凝膠層析操作過程

1、凝膠層析操作過程凝膠層析操作過程 莫雯靜凝膠層析即凝膠過濾技術(shù)v凝膠過濾技術(shù)主要包括：v （1）層析介質(zhì)的選擇v （2）凝膠粒度的選擇v （3）凝膠用量的計(jì)算v （4）凝膠的處理v （5）柱的選擇v （6）裝柱v （7）流動(dòng)相的選擇v （8）樣液的制備v （9）上柱v （10)洗脫v (11)凝膠柱的再生與保存凝膠層析操作過程主要可分為三大步驟：v裝柱 上柱 洗脫 v凝膠層析實(shí)驗(yàn)操作過程： (一）層 析 柱 的 選 擇v層析柱是所有層析方法的主要主要組成 部分。對(duì)層析柱選擇合理與否將直接影響分離效果。v選擇層析柱主要考慮被分離組分相對(duì)分子質(zhì)量的差異：（1）分離相對(duì)分子質(zhì)量差別較大的樣品可采用短

2、粗的層析柱，柱長度：柱內(nèi)徑=10:1或20:1，如脫鹽柱。 （2）分離相對(duì)分子質(zhì)量差別較小的樣品，可采用細(xì)長的層析柱，柱長度：柱內(nèi)徑=50:1,或100:1如：蛋白質(zhì)組分分離。層 析 柱 簡 介v 層析柱簡介1、普通層析柱 2、中壓柱 3、尼龍膜 層析柱簡介v 層析柱是凝膠層析技術(shù)的主體：工廠中的層析柱層 析 柱 簡 介 低壓凝膠層析柱(二）裝 柱v 裝柱的方法可分為濕裝法和干裝法兩種濕裝法：加適量溶劑到柱內(nèi) 排走空氣 攪勻預(yù)先用溶劑浸泡好的吸附劑 將此懸浮連續(xù)倒入柱中 自然沉降（至柱高1/41/3) 打開柱的下端口 溶劑流出，柱上端懸浮液下降至所需高度 干裝法：直接加吸附劑到柱中，然后倒入溶

3、劑。 （濕裝法對(duì)各種基質(zhì)都適用）裝柱應(yīng)注意事項(xiàng)v 在裝柱前要在柱的底部放置一層玻璃纖維或者棉花。v層析柱中基質(zhì)應(yīng)符合填裝均勻，一致和沒有松緊氣泡的標(biāo)準(zhǔn)，所以裝柱時(shí)， 吸附劑表面要平整，應(yīng)使其一直浸泡在溶劑的中，防止氣泡或裂紋產(chǎn)生。（三）流動(dòng)相的選擇在選擇凝膠過濾所使用的緩沖液主要考慮三方面因素：（1）被分離物質(zhì)的穩(wěn)定性： 包括緩沖液的PH、離子強(qiáng)度及保護(hù)劑。（2）凝膠介質(zhì)的穩(wěn)定性：要求不與介質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不變形，不降解。 （3）分離物質(zhì)后處理：被分離組分經(jīng)凝膠過濾分離后如還需采用其他方法進(jìn)一步分離，該采用與后續(xù)層析方法同一緩沖液。如果后處理是冰凍干燥，可選用易揮發(fā)性的溶液，如HAC和NH4O

4、H。（四）樣 液 的 制 備v樣品在上樣前要進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，如通過離心、沉淀、抽提等方法以去除雜質(zhì)，樣液的濃度不宜太稀也不宜太濃，組分不宜太多。（五）上 柱v上柱是將欲分離的混合液加入凝膠層析柱的過程，要在洗脫液的液面恰好與凝膠床的表面相平時(shí)加入混合液，使組分能夠均勻的進(jìn)入凝膠床。上柱的混合體積常為凝膠床體積的10%左右，最大不能超過30%?；旌弦旱臐舛瓤梢愿咝?，但是黏度宜低。（六）洗 脫 v樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面洽與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液洗管壁，洗脫液應(yīng)與干燥凝膠溶脹時(shí)及裝柱平衡時(shí)所使用的液體完全一致，否則會(huì)影響分離效果。使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層

5、析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速。一般來說，洗脫流速慢，分離效果好，但是太慢也會(huì)因擴(kuò)散加劇而影響分離效果。另外洗脫時(shí)的流速要嚴(yán)格控制，否則收集的每一部分洗脫體積就不會(huì)恒定，理想的分配技術(shù)就難以測出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵。流速對(duì)洗脫曲線峰形的影響v洗脫劑的流速對(duì)分離效果也有很大的影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線，可見在較快的流速下得到的洗脫峰較寬且低，流速低洗脫峰窄而高。也就是說流速較低，分辨率較高。恒流泵v欲達(dá)到流速恒定的目的，可自己恒壓加液裝置（下圖），更可靠的是使用微量恒流泵。如果沒有恒流泵該怎么辦？v沒有恒流泵的情況下可用控制操作壓的辦法。其操作壓是通過兩個(gè)液面之間的距離來控制的。流速與操作壓關(guān)系v 洗脫時(shí)，流速與操作壓有關(guān)，與凝膠的型號(hào)與粒度也有關(guān)，在同樣的操作壓下，洗脫時(shí)往往編號(hào)小的葡聚糖凝膠，以及顆粒粗的凝膠流速大；編號(hào)大的，粒度細(xì)的流速慢。對(duì)于某種凝膠來說，在一定范圍內(nèi)，操作壓加大，流速加快。對(duì)于強(qiáng)度大的凝膠，如Sephadex G1050，在相當(dāng)大的柱壓范圍內(nèi)流速(V)與操作壓（F)成正比，與柱長(L)成反比： V=K P