2012-11-7--質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化

1、2021/8/21 質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化2021/8/22目目 的的鞏固質(zhì)粒的概念，通過原理部分的學(xué)習(xí)加深對(duì)質(zhì)粒DNA與染色體DNA理化性質(zhì)差異的認(rèn)識(shí) 學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法掌握酶切反應(yīng)的操作2021/8/23質(zhì) 粒 提 取2021/8/24質(zhì)粒是染色體外小型（質(zhì)粒是染色體外小型（1-2001-200kbkb）的共價(jià)、閉合、的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳分子，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。的遺傳因子。 是進(jìn)行是進(jìn)行DNADNA重組的常用載體。重組的常用載體。常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因常常編

2、碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型主要為抗生素抗性。的表型主要為抗生素抗性。質(zhì)質(zhì) 粒粒2021/8/25AmpAmpr r抗性基因抗性基因AmpAmpr r抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（- -內(nèi)酰胺酶）可特異地內(nèi)酰胺酶）可特異地切割切割A(yù)mpAmp的的-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (11

3、21)ApaLI (2367)2021/8/26常常 用用 質(zhì)質(zhì) 粒粒 提提 取取 方方 法法煮沸法煮沸法 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA。堿裂解法堿裂解法2021/8/27堿裂解法提取原理堿裂解法提取原理 宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)狀態(tài)的差異 加入堿變性時(shí)，線狀基因組DNA變性充分而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開當(dāng)條件恢復(fù)時(shí)（酸中和），質(zhì)粒DNA迅速準(zhǔn)確配置重新形成完全天然超螺旋分子。 由于操作原因，提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開由于操作原因，提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超

4、螺旋。環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 2021/8/28收菌重懸裂解中和過柱洗滌洗脫質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟 P1: 50mM葡萄糖，25mMTris-HCl, 10mM EDTA pH8.0 P2: 0.2MNaOH,1%SDS P3: 3M醋酸鉀, 2M醋酸 硅基質(zhì)膜在高鹽低pH值（pH7.5）時(shí)可結(jié)合DNA，在低鹽及高pH值（pH8）條件下洗脫。75%乙醇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期2021/8/29取菌液 12,000rpm離心離心2min 棄上清（盡可能吸盡上清）用250uLPI重懸菌體沉淀，漩渦振蕩至徹底懸浮加入250uLP2，溫和溫和地上下顛倒6 -10次 (溶液粘稠清亮)加入350uLN

5、3, 立即溫和立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6 -10次（白色絮狀沉淀）12,000rpm離心10min小心吸取上清，加入吸附柱小心吸取上清，加入吸附柱 12,000rpm離心離心1min 棄濾液棄濾液加入700uL buffer PW 12,000rpm 離心離心1min， 棄濾液空柱12,000rpm 離心離心2min， 室溫開蓋放置3 5 min加入500uL buffer PW 12,000rpm 離心離心1min， 棄濾液吸附柱置于新離心管中，加入50-100uLbuffer EB, 室溫放置室溫放置2min，12,000rpm離心1min，收集質(zhì)粒溶液到離心管，收集質(zhì)粒溶液到離心管，-20 保存

6、。保存。CWBIO2021/8/210取菌液 12,000rpm離心離心2min 棄上清（盡可能吸盡上清）用250uLPI重懸菌體沉淀，漩渦振蕩至徹底懸浮加入250uLP2，溫和溫和地上下顛倒6 -10次 (溶液粘稠清亮)加入350uLP3, 立即溫和立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6 -10次（白色絮狀沉淀）12,000rpm離心10min小心吸取裂解上清，加入吸附柱小心吸取裂解上清，加入吸附柱 12,000rpm離心離心1min 棄濾液棄濾液加入500uL buffer PD 12,000rpm 離心離心1min， 棄濾液空柱12,000rpm 離心離心2min， 室溫開蓋放置3 5 min加入600uL buffer PW 12,000rpm 離心離心1min， 棄濾液 （重復(fù)一次重復(fù)一次）吸附柱置于新離心管中，加入50-100uL洗脫液洗脫液 EB, 室溫放置室溫放置2min，12,000rpm離心1min，收集質(zhì)粒溶液到離心管，收集質(zhì)粒溶液到離心管，-20 保存。保存。T&G（500uL 平衡液平衡液BL，加入吸附柱，加入吸附柱 12,000rpm離