生物工藝學第四章生物工藝過程中的無菌技術

1、國家十一五規(guī)劃教材國家十一五規(guī)劃教材生物工藝學生物工藝學（邱樹毅主編）配套課件（邱樹毅主編）配套課件共39頁 第2頁目錄 目錄目錄 第一章緒論第一章緒論 第二章工業(yè)微生物菌種選育、制備與保藏第二章工業(yè)微生物菌種選育、制備與保藏 第三章工業(yè)培養(yǎng)基及其設計第三章工業(yè)培養(yǎng)基及其設計 第四章生物工藝過程中的無菌技術第四章生物工藝過程中的無菌技術 第五章生物反應動力學第五章生物反應動力學 第六章第六章 發(fā)酵過程原理發(fā)酵過程原理 第七章第七章 生物反應器及生物工藝過程的放大生物反應器及生物工藝過程的放大 第八章第八章 生物反應過程參數(shù)檢測與控制生物反應過程參數(shù)檢測與控制 第九章第九章 生物產品分離及純化技

2、術生物產品分離及純化技術 第十章第十章 生物產品工藝學及應用生物產品工藝學及應用 共39頁 第3頁目錄 第四章第四章 生物工藝過程中的無菌技術生物工藝過程中的無菌技術 4.1 生物反應過程中無菌的要求生物反應過程中無菌的要求 4.2 工業(yè)常用無菌技術工業(yè)常用無菌技術 4.2.1 干熱滅菌干熱滅菌 4.2.2 濕熱滅菌濕熱滅菌 4.2.3 射線滅菌射線滅菌 4.2.4 化學藥劑滅菌化學藥劑滅菌 4.2.5 過濾除菌過濾除菌 4.3 培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌 4.3.1 濕熱滅菌原理濕熱滅菌原理 4.3.2 分批滅菌分批滅菌 4.3.3 連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌 4.4 空氣除菌空氣除菌 4.4.1 空氣除菌

3、方法空氣除菌方法 4.4.2 空氣除菌流程空氣除菌流程 4.5 設備及管道滅菌設備及管道滅菌 共39頁 第4頁目錄 采取措施對生產過程涉及到的原料、設備等進行采取措施對生產過程涉及到的原料、設備等進行滅菌處理，達到嚴格的純種培養(yǎng)條件。滅菌處理，達到嚴格的純種培養(yǎng)條件。通常工業(yè)上采取通常工業(yè)上采取的主要措施是：的主要措施是：(1)對培養(yǎng)基進行滅菌處理；對培養(yǎng)基進行滅菌處理；(2)對好氧過程的空氣進行滅菌處理；對好氧過程的空氣進行滅菌處理；(3)對生物反應器對生物反應器(發(fā)酵罐發(fā)酵罐)及其連接管道進行滅菌處理；及其連接管道進行滅菌處理； (4)菌種為無污染的純粹種子；菌種為無污染的純粹種子；(5)

4、使生物反應器處于正壓環(huán)境；使生物反應器處于正壓環(huán)境；(6)對培養(yǎng)過程中補料進行滅菌處理等。對培養(yǎng)過程中補料進行滅菌處理等。4.1 生物反應過程中無菌的要求生物反應過程中無菌的要求共39頁 第5頁目錄4.2.1 干熱滅菌干熱滅菌 4.2 工業(yè)常用無菌技術工業(yè)常用無菌技術4.2.2 濕熱滅菌濕熱滅菌 4.2.3 射線滅菌射線滅菌 4.2.4 化學藥劑滅菌化學藥劑滅菌4.2.5 過濾除菌過濾除菌共39頁 第6頁目錄 干熱滅菌時，微生物主要由于氧化作用而死亡。干熱滅菌時，微生物主要由于氧化作用而死亡。最常用的最常用的方法有以下兩種：方法有以下兩種： (1)灼燒法。灼燒法。常用于實驗室接種針、勺、試管或

5、三角瓶口和常用于實驗室接種針、勺、試管或三角瓶口和棉塞的滅菌，也用于工業(yè)發(fā)酵罐接種時的火環(huán)保護。棉塞的滅菌，也用于工業(yè)發(fā)酵罐接種時的火環(huán)保護。 (2)烘箱熱空氣法。烘箱熱空氣法。將物品放入烘箱內，然后升溫至將物品放入烘箱內，然后升溫至165，維持維持2小時。經過烘箱熱空氣法可以達到徹底滅菌的目的。小時。經過烘箱熱空氣法可以達到徹底滅菌的目的。該法適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌。其優(yōu)點是滅菌該法適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌。其優(yōu)點是滅菌后物品干燥，缺點是操作所需時間長，易損壞物品，對液后物品干燥，缺點是操作所需時間長，易損壞物品，對液體樣品不適用。體樣品不適用。 4.2.1 干熱滅菌干熱滅

6、菌 共39頁 第7頁目錄 利用飽和蒸汽進行滅菌的方法稱為濕熱利用飽和蒸汽進行滅菌的方法稱為濕熱滅菌。通常濕熱滅菌條件為滅菌。通常濕熱滅菌條件為121，維持，維持30 min。 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是實驗室、發(fā)酵工業(yè)生產是實驗室、發(fā)酵工業(yè)生產中最常用的滅菌方法。一般培養(yǎng)基、玻中最常用的滅菌方法。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、無菌水、緩沖液、金屬用具等璃器皿、無菌水、緩沖液、金屬用具等都可以采用此法滅菌。都可以采用此法滅菌。4.2.2 濕熱滅菌濕熱滅菌 共39頁 第8頁目錄 射線滅菌射線滅菌是利用紫外線、高能電磁波或放射性是利用紫外線、高能電磁波或放射性物質產生的高能粒子進行滅菌的方法，其中以物質產生

7、的高能粒子進行滅菌的方法，其中以紫外線最常用。紫外線最常用。其殺菌作用主要是因為導致其殺菌作用主要是因為導致DNA胸腺嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體和胞嘧胸腺嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體和胞嘧啶水合物，抑制啶水合物，抑制DNA正常復制。此外，空氣正常復制。此外，空氣在紫外線輻射下產生的在紫外線輻射下產生的臭氧臭氧有一定殺菌作用。有一定殺菌作用。 4.2.3 射線滅菌射線滅菌 共39頁 第9頁目錄 某些某些化學試劑化學試劑能與微生物發(fā)生反應而具有殺能與微生物發(fā)生反應而具有殺菌作用。常用的化學藥劑有菌作用。常用的化學藥劑有酒精、甲醛、漂白粉酒精、甲醛、漂白粉(或次氯酸鈉或次氯酸鈉)、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、季銨

8、鹽等。、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、季銨鹽等。由于化學藥劑也會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，由于化學藥劑也會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，且加入培養(yǎng)基后易殘留在培養(yǎng)基內，所以，且加入培養(yǎng)基后易殘留在培養(yǎng)基內，所以，化學化學藥劑不能用于培養(yǎng)基的滅菌，一般應用于發(fā)酵工藥劑不能用于培養(yǎng)基的滅菌，一般應用于發(fā)酵工廠環(huán)境的消毒。廠環(huán)境的消毒。4.2.4 化學藥劑滅菌化學藥劑滅菌共39頁 第10頁目錄 過濾除菌過濾除菌是利用過濾法阻留微生物以達到是利用過濾法阻留微生物以達到除菌的目的。此法僅除菌的目的。此法僅適用于不耐高溫的液體培養(yǎng)適用于不耐高溫的液體培養(yǎng)基組分和空氣的過濾除菌。基組分和空氣的過濾除菌。工業(yè)上常用過濾法大

9、工業(yè)上常用過濾法大量制備無菌空氣，供好氧微生物的液體深層發(fā)酵量制備無菌空氣，供好氧微生物的液體深層發(fā)酵使用。使用。4.2.5 過濾除菌過濾除菌共39頁 第11頁目錄4.3.1 濕熱滅菌原理濕熱滅菌原理 4.3培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌4.3.2 分批滅菌分批滅菌 4.3.3 連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌共39頁 第12頁目錄4.3.1.1 微生物熱阻微生物熱阻 每種微生物都有一定的生長每種微生物都有一定的生長溫度范圍溫度范圍。當微生物處于。當微生物處于生長生長溫度的下限溫度的下限時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當溫度超過生長當溫度超過生長溫度的上限溫度的上限時，微生物細胞

10、中的蛋白質時，微生物細胞中的蛋白質等大分子物質會發(fā)生不可逆變性，使微生物在很短的時等大分子物質會發(fā)生不可逆變性，使微生物在很短的時間內死亡，加熱滅菌就是根據(jù)微生物的這一特性進行的。間內死亡，加熱滅菌就是根據(jù)微生物的這一特性進行的。 一般微生物一般微生物的營養(yǎng)細胞在的營養(yǎng)細胞在60加熱加熱10min全部死亡，全部死亡，但但細菌芽孢細菌芽孢能耐受較高的溫度，在能耐受較高的溫度，在100需要數(shù)分鐘甚至需要數(shù)分鐘甚至數(shù)小時才能被殺滅。某些數(shù)小時才能被殺滅。某些嗜熱菌的芽孢嗜熱菌的芽孢在在120下需下需30min甚至更長時間才能殺滅。所以，甚至更長時間才能殺滅。所以，一般衡量滅菌徹底一般衡量滅菌徹底與否

11、，是以能否殺滅芽孢細菌為標準。與否，是以能否殺滅芽孢細菌為標準。 4.3.1 濕熱滅菌原理濕熱滅菌原理 致死溫度：致死溫度：殺死微生物的極限溫度。殺死微生物的極限溫度。致死時間：致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間。的時間。 在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。由在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。由于不同種類微生物細胞及微生物細胞和微生物孢子對于不同種類微生物細胞及微生物細胞和微生物孢子對熱的抵抗力不同，它們的致死溫度和致死時間也有很熱的抵抗力不同，它們的致死溫度和致死時間也有很大的差別。大的差別。 熱阻：熱阻：微生物對熱的抵抗力，即指

12、微生微生物對熱的抵抗力，即指微生物在某一特定條件下物在某一特定條件下(主要是溫度主要是溫度)的致死時間。的致死時間。相對熱阻：相對熱阻：指某一條件下的致死時間與另一微生物指某一條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間之比。在相同條件下的致死時間之比。共39頁 第13頁目錄 在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應速率理論，微生物受熱死亡的速率速率理論，微生物受熱死亡的速率dN/dt在任何瞬在任何瞬間與殘留的活菌數(shù)間與殘留的活菌數(shù)N成正比，這就是成正比，這就是對數(shù)殘留定律，對數(shù)殘留定律，其數(shù)學表達式為其數(shù)學表達式為 式中：式中：N殘留活菌數(shù)，個；

13、殘留活菌數(shù)，個； t受熱時間，受熱時間，min； k比死亡速率常數(shù)，比死亡速率常數(shù)，s-1。k也稱滅菌速率常數(shù)，也稱滅菌速率常數(shù)，此常數(shù)大小與微生物種類及滅菌溫度有關；此常數(shù)大小與微生物種類及滅菌溫度有關； dN/dt活菌數(shù)瞬時變化速率，即死亡速率?；罹鷶?shù)瞬時變化速率，即死亡速率。4.3.1.2濕熱滅菌的對數(shù)殘留定律濕熱滅菌的對數(shù)殘留定律kNdtdN若開始滅菌若開始滅菌(t=0)時，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為時，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0，將式上式，將式上式積分后可得到積分后可得到式中：式中：N0開始滅菌時原有的活菌數(shù)，個；開始滅菌時原有的活菌數(shù)，個； Nt經過經過t時間滅菌后的殘留菌數(shù)，個。時間

14、滅菌后的殘留菌數(shù)，個。 此式是計算滅菌的基本公式，從式中可知此式是計算滅菌的基本公式，從式中可知滅菌時間取決滅菌時間取決于污染程度于污染程度(N0)、滅菌程度、滅菌程度(殘留菌數(shù)殘留菌數(shù)Nt)和和k值。值。 亦可看出，如果要求完全徹底滅菌，即殘留菌數(shù)亦可看出，如果要求完全徹底滅菌，即殘留菌數(shù)Nt=0時，時，需要的滅菌時間為無窮大，需要的滅菌時間為無窮大， 此式即無意義，事實上是不可能此式即無意義，事實上是不可能的。因此，工程上進行滅菌設計時，一般采用的。因此，工程上進行滅菌設計時，一般采用Nt=0.001，即，即在在1000次滅菌中允許有一次染菌機會。次滅菌中允許有一次染菌機會。 kNNtt0

15、lg303. 2共39頁 第14頁目錄 在實際過程中某些微生物受熱死亡的速率是不符合對數(shù)在實際過程中某些微生物受熱死亡的速率是不符合對數(shù)殘留規(guī)律的。將其殘留規(guī)律的。將其N0/Nt對滅菌時間對滅菌時間t在半對數(shù)坐標中標繪得到在半對數(shù)坐標中標繪得到的殘留曲線不是直線。呈現(xiàn)這種熱死亡非對數(shù)動力學行為的的殘留曲線不是直線。呈現(xiàn)這種熱死亡非對數(shù)動力學行為的主要是一些微生物芽孢。有關這一類熱死亡動力學的行為，主要是一些微生物芽孢。有關這一類熱死亡動力學的行為，雖然可用多種模型來描述，但其中以雖然可用多種模型來描述，但其中以Prokop和和Hunphey所提所提出的出的“菌體循序死亡模型菌體循序死亡模型”最

16、有代表性，其假設耐熱性微生最有代表性，其假設耐熱性微生物芽孢的死亡不是突然的，而是漸變的，即耐熱性芽孢物芽孢的死亡不是突然的，而是漸變的，即耐熱性芽孢(R型型)先轉變?yōu)閷崦舾械闹虚g態(tài)芽孢先轉變?yōu)閷崦舾械闹虚g態(tài)芽孢(S型型)，然后轉變成死亡的芽，然后轉變成死亡的芽孢孢(D型型)，這一過程可用下式表示，這一過程可用下式表示 NR耐熱性活芽孢數(shù)耐熱性活芽孢數(shù)(R型型)；NS敏感性活芽孢數(shù)敏感性活芽孢數(shù)(S型型)； ND死亡的芽孢數(shù)死亡的芽孢數(shù)(D型型)； 4.3.1.3 濕熱滅菌的非對數(shù)殘留定律濕熱滅菌的非對數(shù)殘留定律根據(jù)對數(shù)殘留定律，聯(lián)立微分方程可得根據(jù)對數(shù)殘留定律，聯(lián)立微分方程可得式中：式中

17、：Nt任一時刻具有活力的芽孢數(shù)，即任一時刻具有活力的芽孢數(shù)，即Nt = NS + NR； N0初始的活芽孢數(shù)；初始的活芽孢數(shù)； kR耐熱性芽孢的比死亡速率，耐熱性芽孢的比死亡速率，s-1； kS敏感性芽孢的比死亡速率，敏感性芽孢的比死亡速率，s-1。 在溫度相同時，對數(shù)與非對數(shù)定律的滅菌時間在溫度相同時，對數(shù)與非對數(shù)定律的滅菌時間t不同。不同。DkSkRNNNSR)exp()exp(0tkkktkkkkNNRRSSSRRt共39頁 第15頁目錄 當培養(yǎng)基受熱溫度從當培養(yǎng)基受熱溫度從T1上升至上升至T2時，微生物的比死亡速時，微生物的比死亡速率常數(shù)率常數(shù)k和培養(yǎng)基成分分解破壞的速率常數(shù)和培養(yǎng)基成

18、分分解破壞的速率常數(shù)k變化情況為變化情況為對微生物的死亡情況而言對微生物的死亡情況而言將上述兩式相除并取對數(shù)后可得將上述兩式相除并取對數(shù)后可得 培養(yǎng)基成分的破壞，培養(yǎng)基成分的破壞，同樣也可得同樣也可得兩式相除得兩式相除得 4.3.1.4 滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度和時間的選擇 在生產中必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養(yǎng)基成在生產中必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養(yǎng)基成分破壞減少至最少的工藝條件。分破壞減少至最少的工藝條件。 微生物的受熱死亡屬于單分子反應，微生物的受熱死亡屬于單分子反應，其滅菌速率常數(shù)其滅菌速率常數(shù)k與與溫度之間的關系可用溫度之間的關系可用阿倫尼烏斯方程阿倫尼烏斯方程表示

19、：表示：式中：式中：A阿倫尼烏斯常數(shù)，阿倫尼烏斯常數(shù)，s-1； R氣體常數(shù)，氣體常數(shù)，8.314J/(molK)； T熱力學溫度，熱力學溫度，K； E微生物死亡活化能，微生物死亡活化能，J/mol 。 大部分培養(yǎng)基的破壞也可認為是一級分解反應，大部分培養(yǎng)基的破壞也可認為是一級分解反應，若其他若其他條件不變，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)和溫度的關系也可用阿條件不變，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)和溫度的關系也可用阿倫尼烏斯方程表示。倫尼烏斯方程表示。)exp(RTEAk)exp(11RTEAk)exp(22RTEAk)11(ln2112TTREkk)11(ln2112TTREkkEEkkkk)ln()ln(1

20、212共39頁 第16頁目錄4.3.1.4 滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度滅菌溫度/完全滅菌時間完全滅菌時間/min 維生素維生素B1破壞量破壞量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.011滅菌溫度和完全滅菌時間對滅菌溫度和完全滅菌時間對維生素維生素B1破壞量的比較破壞量的比較 由于由于滅菌時殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分破壞滅菌時殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分破壞的活化能的活化能E，因此隨著溫度的上升，微生物比死亡速率因此隨著溫度的上升，微生物比死亡速率常數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分破壞分解速率常數(shù)的增加常

21、數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分破壞分解速率常數(shù)的增加倍數(shù)。也就是說，當滅菌溫度升高時，微生物死亡速率大倍數(shù)。也就是說，當滅菌溫度升高時，微生物死亡速率大于培養(yǎng)基成分破壞的速率。根據(jù)這一理論，培養(yǎng)基滅菌一于培養(yǎng)基成分破壞的速率。根據(jù)這一理論，培養(yǎng)基滅菌一般選擇般選擇高溫快速滅菌法，高溫快速滅菌法，換言之，為達到目的相同的滅菌換言之，為達到目的相同的滅菌效果，提高滅菌溫度可以明顯縮短滅菌時間，并可減少培效果，提高滅菌溫度可以明顯縮短滅菌時間，并可減少培養(yǎng)基因受熱時間長而遭到破壞的損失。養(yǎng)基因受熱時間長而遭到破壞的損失。 共39頁 第17頁目錄 不同成分的培養(yǎng)基其含菌量不同成分的培養(yǎng)基其含菌量是不同的。

22、是不同的。培養(yǎng)基中微生物數(shù)量培養(yǎng)基中微生物數(shù)量越多，達到無菌要求所需的滅菌越多，達到無菌要求所需的滅菌時間也越長。時間也越長。天然基質培養(yǎng)基，天然基質培養(yǎng)基，特別是營養(yǎng)豐富或變質的原料中特別是營養(yǎng)豐富或變質的原料中含菌量遠比化工原料的含菌量多，含菌量遠比化工原料的含菌量多，因此，滅菌時間要適當延長。因此，滅菌時間要適當延長。含含芽孢桿菌多的培養(yǎng)基，芽孢桿菌多的培養(yǎng)基，要適當提要適當提高滅菌溫度并延長滅菌時間。高滅菌溫度并延長滅菌時間。 4.3.1.5 影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH培養(yǎng)基物理狀態(tài)培養(yǎng)基物理狀態(tài)泡沫泡沫微生物數(shù)量微生物數(shù)量 p

23、H對微生物的耐熱性對微生物的耐熱性影響很大，影響很大，pH為為6.08.0時微生物耐熱能力最強，時微生物耐熱能力最強，pH小于小于6.0時，時，H+易滲入微易滲入微生物細胞內，改變細胞的生物細胞內，改變細胞的生理反應促使其死亡。所生理反應促使其死亡。所以以培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所愈低，滅菌所需時間愈短。需時間愈短。 固體培養(yǎng)基的滅菌時間要比液體培固體培養(yǎng)基的滅菌時間要比液體培養(yǎng)基的滅菌時間長，養(yǎng)基的滅菌時間長，假如假如100時液體培時液體培養(yǎng)基的滅菌時間為養(yǎng)基的滅菌時間為1h，而固體培養(yǎng)基則，而固體培養(yǎng)基則需要需要23h才能達到同樣的滅菌效果。才能達到同樣的滅菌效果。其原因在于液體培養(yǎng)基滅

24、菌時，熱的傳其原因在于液體培養(yǎng)基滅菌時，熱的傳遞除了遞除了傳導作用傳導作用外還有外還有對流作用，對流作用，而固而固體培養(yǎng)基則只有傳導作用而沒有對流作體培養(yǎng)基則只有傳導作用而沒有對流作用，另外液體培養(yǎng)基中水的用，另外液體培養(yǎng)基中水的傳熱系數(shù)傳熱系數(shù)要要比有機固體物質大得多。比有機固體物質大得多。 泡沫中的空氣形成隔泡沫中的空氣形成隔熱層，熱層，使傳熱困難，對滅使傳熱困難，對滅菌極為不利。因此對易產菌極為不利。因此對易產生泡沫的培養(yǎng)基進行滅菌生泡沫的培養(yǎng)基進行滅菌時，可加入少量消泡劑。時，可加入少量消泡劑。 油脂、糖類及一定濃度的蛋白油脂、糖類及一定濃度的蛋白質質增加了微生物的耐熱性，增加了微生物

25、的耐熱性，高濃度高濃度有機物會在細胞的周圍形成一層薄有機物會在細胞的周圍形成一層薄膜，從而影響熱的傳入。所以滅菌膜，從而影響熱的傳入。所以滅菌溫度應高些。溫度應高些。 例如，大腸桿菌在水中加熱到例如，大腸桿菌在水中加熱到6065便死亡，在便死亡，在10%的糖液中，的糖液中，需需70處理處理46min，而在，而在30%的的糖液中則需糖液中則需70處理處理30min。共39頁 第18頁目錄4.3.2 分批滅菌分批滅菌 培養(yǎng)基的分批滅菌培養(yǎng)基的分批滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵就是將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或生物反應器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備儀器罐或生物反應器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備儀

26、器進行滅菌的操作過程，也稱為進行滅菌的操作過程，也稱為實罐滅菌實罐滅菌，而若反應中沒，而若反應中沒有物料，則稱為有物料，則稱為空消空消，空消是對發(fā)酵罐設備及其周邊連，空消是對發(fā)酵罐設備及其周邊連接管道進行滅菌處理。接管道進行滅菌處理。優(yōu)點：優(yōu)點：培養(yǎng)基的分批滅菌不需要專門的滅菌設備，對蒸培養(yǎng)基的分批滅菌不需要專門的滅菌設備，對蒸汽要求低，投資少，設備簡單，滅菌效果可靠。汽要求低，投資少，設備簡單，滅菌效果可靠。缺點缺點：蒸汽消耗量大，造成鍋爐負荷波動大；滅菌溫度蒸汽消耗量大，造成鍋爐負荷波動大；滅菌溫度低時間長以及升降溫時間長，對培養(yǎng)基破壞大。低時間長以及升降溫時間長，對培養(yǎng)基破壞大。應用：應

27、用：分批滅菌是中、小型發(fā)酵罐經常采用的一種培養(yǎng)分批滅菌是中、小型發(fā)酵罐經常采用的一種培養(yǎng)基滅菌方法?；鶞缇椒ā?分批滅菌在所用的發(fā)酵罐中進行。將培養(yǎng)基在配制罐中配分批滅菌在所用的發(fā)酵罐中進行。將培養(yǎng)基在配制罐中配好以后，用泵通過專用管道輸入發(fā)酵罐中，然后用好以后，用泵通過專用管道輸入發(fā)酵罐中，然后用直接蒸汽或直接蒸汽或間接蒸汽加熱間接蒸汽加熱到滅菌溫度到滅菌溫度(一般一般121)在此溫度維持一定時間，在此溫度維持一定時間，再冷卻到發(fā)酵所需溫度，完成滅菌過程。再冷卻到發(fā)酵所需溫度，完成滅菌過程。 分批滅菌過程包括升溫、維持和冷卻三個階段，分批滅菌過程包括升溫、維持和冷卻三個階段，通常通常100

28、以下的溫度對滅菌沒有太多貢獻，在實際過程中是忽略以下的溫度對滅菌沒有太多貢獻，在實際過程中是忽略的，升溫是指從的，升溫是指從100升到升到121的情況，而冷卻是指的情況，而冷卻是指121冷冷卻到卻到100時的情況，在這兩個溫度段，加熱升溫和冷卻對滅時的情況，在這兩個溫度段，加熱升溫和冷卻對滅菌是有貢獻的。菌是有貢獻的。 為了使滅菌處理得到期望的結果，為了使滅菌處理得到期望的結果，Deindoerfer引入了引入了來來測定測定滅菌度滅菌度(N0/N) 。ln Deindoerfer還假設各階段滅菌效果可以疊加，即還假設各階段滅菌效果可以疊加，即 總總加熱加熱維持維持冷卻冷卻ln NN0NN0共3

29、9頁 第19頁目錄共39頁 第20頁目錄共39頁 第21頁目錄共39頁 第22頁目錄4.3.2 分批滅菌分批滅菌 例：例：一萬升培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中于一萬升培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中于121分批滅菌，各階段的時間分別分批滅菌，各階段的時間分別為：升溫從為：升溫從100121，37分鐘，保持分鐘，保持121，10分鐘，從分鐘，從121冷冷卻到卻到100，13分鐘，計算分鐘，計算總?？?。解：解：由表由表45，從，從100121的的值累加為值累加為11.36，由于實際升溫過，由于實際升溫過程為程為37分鐘，而不是分鐘，而不是20分鐘，實際有更多的滅菌處理。則：分鐘，實際有更多的滅菌處理。則：加熱加熱11.3637

30、/2021.016同樣，從同樣，從121冷卻到冷卻到100，在，在20分鐘時間內分鐘時間內值為值為11.36，由于實，由于實際冷卻時間為際冷卻時間為13分鐘，滅菌過程實際更少，則分鐘，滅菌過程實際更少，則冷卻冷卻11.3613/207.384保持階段保持階段. kt，k1.83(121)保持保持1.831018.3所以，所以，總總加熱加熱維持維持冷卻冷卻21.0167.38418.346.7 一般來說，在培養(yǎng)基分批滅菌，使用一般來說，在培養(yǎng)基分批滅菌，使用Richards方法計算有大約方法計算有大約5的偏差，其最大優(yōu)點是計算簡單，這樣，在滅菌過程中可很快調的偏差，其最大優(yōu)點是計算簡單，這樣，在

31、滅菌過程中可很快調整滅菌過程中出現(xiàn)的失誤。整滅菌過程中出現(xiàn)的失誤。共39頁 第23頁目錄分批滅菌操作：分批滅菌操作： 發(fā)酵罐上一般裝有發(fā)酵罐上一般裝有空氣管道，空氣管道，取樣用的取樣用的取樣管道，取樣管道，放放料用的料用的出料管道，接種管道，消泡管道，補料管道，出料管道，接種管道，消泡管道，補料管道，調節(jié)調節(jié)pH用的用的酸堿管道酸堿管道以及控制培養(yǎng)溫度用的以及控制培養(yǎng)溫度用的降溫水管道。降溫水管道。降降溫水管是與夾套或蛇管連接，與發(fā)酵罐內部不相通。溫水管是與夾套或蛇管連接，與發(fā)酵罐內部不相通。 4.3.2 分批滅菌分批滅菌 注意事項：注意事項： 滅菌之前，進行滅菌之前，進行分空氣過濾器滅菌并用

32、空氣吹干。分空氣過濾器滅菌并用空氣吹干。 放去夾套或蛇管中的冷水，放去夾套或蛇管中的冷水，進料完畢，并進料完畢，并開動攪拌器開動攪拌器以防料以防料液沉淀。液沉淀。 開始滅菌時，開啟夾套蒸汽閥，緩慢進蒸汽，使開始滅菌時，開啟夾套蒸汽閥，緩慢進蒸汽，使料液間接加料液間接加熱至熱至80 左右左右后關閉夾套蒸汽閥。后關閉夾套蒸汽閥。 從取樣管和放料管從取樣管和放料管向罐內通入蒸汽，向罐內通入蒸汽，培養(yǎng)基溫度達到培養(yǎng)基溫度達到121，罐壓達罐壓達1105Pa(表壓表壓)時，安裝在發(fā)酵罐上封頭的接種、補料、時，安裝在發(fā)酵罐上封頭的接種、補料、消泡劑、酸、堿管道應排氣，并調節(jié)好各進氣和排氣閥門，使罐消泡劑、

33、酸、堿管道應排氣，并調節(jié)好各進氣和排氣閥門，使罐壓和溫度保持在這一水平進行保溫。壓和溫度保持在這一水平進行保溫。 在保溫階段，凡進口在培養(yǎng)基液面下的各管道以及顯示鏡管在保溫階段，凡進口在培養(yǎng)基液面下的各管道以及顯示鏡管都應通入蒸汽，在液面上的其余各管道則應排放蒸汽，這樣才能都應通入蒸汽，在液面上的其余各管道則應排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。保證滅菌徹底，不留死角。 保溫結束后，依次關閉各排氣，進氣閥門，待罐內壓力低于保溫結束后，依次關閉各排氣，進氣閥門，待罐內壓力低于空氣壓力后，空氣壓力后，向罐內通入無菌空氣，向罐內通入無菌空氣，在夾套或蛇管中通冷卻水，在夾套或蛇管中通冷卻水，使培

34、養(yǎng)基溫度降到所需溫度。使培養(yǎng)基溫度降到所需溫度。共39頁 第24頁目錄培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌就是將配就是將配好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時進行加熱、養(yǎng)裝置輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻的滅菌過程保溫和冷卻的滅菌過程。圖圖4- 1 連續(xù)滅菌過程中溫度變化連續(xù)滅菌過程中溫度變化優(yōu)點：優(yōu)點：培養(yǎng)基成分破壞少；培養(yǎng)基成分破壞少；發(fā)酵罐利用率高；發(fā)酵罐利用率高；提高提高產量；產量；產品質量較易控制；產品質量較易控制；蒸汽負荷均衡，鍋爐利用蒸汽負荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便；率高，操作方便；適宜采用自動控制；適宜采用自動控制；降低勞動強度。降低勞動強度。4.3

35、.3 連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌缺點：缺點：氣壓要求高于氣壓要求高于0.5MP；滅菌設備復雜，投資大。滅菌設備復雜，投資大。共39頁 第25頁目錄常用連續(xù)滅菌工藝流程常用連續(xù)滅菌工藝流程u 4.3.3.1 連消塔連消塔噴淋冷卻流程噴淋冷卻流程 u 4.3.3.2 噴射加熱噴射加熱真空冷卻流程真空冷卻流程u 4.3.3.3 板式換熱器滅菌流程板式換熱器滅菌流程共39頁 第26頁目錄4.3.3.1 連消塔連消塔噴淋冷卻流程噴淋冷卻流程1-配料預熱罐配料預熱罐 2-連消泵連消泵 3-連消塔連消塔 4-維持罐維持罐 5-噴淋冷卻器噴淋冷卻器圖圖4- 2 連消塔連消塔-噴淋冷卻流程噴淋冷卻流程配好的培養(yǎng)基用泵配好

36、的培養(yǎng)基用泵打人連消塔與蒸汽打人連消塔與蒸汽直接混合，達到滅直接混合，達到滅菌溫度后進入維持菌溫度后進入維持罐，維持一定時間罐，維持一定時間后經噴淋冷卻器冷后經噴淋冷卻器冷卻至一定溫度后進卻至一定溫度后進入發(fā)酵罐。入發(fā)酵罐。 共39頁 第27頁目錄基本設備一般包括：基本設備一般包括：配料預熱罐，配料預熱罐，將配好的料液預熱到將配好的料液預熱到6070，以避免滅菌，以避免滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水汽撞擊聲；時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水汽撞擊聲；連消塔，連消塔，連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料液的溫度很快升高到滅

37、菌溫度混合，并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度 (126132)；維持罐，維持罐，連消塔加熱的時間很短，光靠這段時間的滅菌是連消塔加熱的時間很短，光靠這段時間的滅菌是不夠的，需要在維持罐高溫保溫；不夠的，需要在維持罐高溫保溫；冷卻管，冷卻管，從維持罐出來的料液要經過冷卻管進行冷卻，生從維持罐出來的料液要經過冷卻管進行冷卻，生產上一般采用冷卻水噴淋冷卻，冷卻到產上一般采用冷卻水噴淋冷卻，冷卻到4050后，輸送到后，輸送到預先已經滅菌過的罐內。預先已經滅菌過的罐內。4.3.3.1 連消塔連消塔噴淋冷卻流程噴淋冷卻流程共39頁 第28頁目錄圖圖4- 3 噴射加熱噴射加熱-真空冷卻流程真空冷卻流程4.3

38、.3.2 噴射加熱噴射加熱真空冷卻流程真空冷卻流程 培養(yǎng)基用泵打入培養(yǎng)基用泵打入噴射加熱器，噴射加熱器，以較高速度自以較高速度自噴嘴噴出，借高速流體的抽吸作用與蒸汽混合后噴嘴噴出，借高速流體的抽吸作用與蒸汽混合后進人管道進人管道維持器，維持器，經一定維持時間后通過一膨脹經一定維持時間后通過一膨脹閥進入閥進入真空閃急蒸發(fā)室，真空閃急蒸發(fā)室，因真空作用使水分急驟因真空作用使水分急驟蒸發(fā)而冷卻到蒸發(fā)而冷卻到7080左右，再進入發(fā)酵罐冷卻左右，再進入發(fā)酵罐冷卻到接種溫度。到接種溫度。 流程優(yōu)點：流程優(yōu)點：加熱和冷卻在瞬間完成，營養(yǎng)成分破加熱和冷卻在瞬間完成，營養(yǎng)成分破壞最少。壞最少。注意：注意：恒定滅

39、菌溫度的控制恒定滅菌溫度的控制 共39頁 第29頁目錄圖圖4- 4 薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌流程 4.3.3.3 板式換熱器滅菌流程板式換熱器滅菌流程 流程中流程中采用了薄板換熱器作為培養(yǎng)液的加熱和冷卻器，采用了薄板換熱器作為培養(yǎng)液的加熱和冷卻器，培養(yǎng)液在設備中同時完成預熱、滅菌及冷卻過程。培養(yǎng)液在設備中同時完成預熱、滅菌及冷卻過程。利用板式熱交換器進行連續(xù)滅菌時，加熱和冷卻培養(yǎng)液利用板式熱交換器進行連續(xù)滅菌時，加熱和冷卻培養(yǎng)液所需要的時間所需要的時間比使用噴射式連續(xù)滅菌稍長，但滅菌周期比比使用噴射式連續(xù)滅菌稍長，但滅菌周期比間歇滅菌短得多。間歇滅菌短得多。由于滅菌培養(yǎng)液的預熱

40、過程同時為滅菌培養(yǎng)液的冷卻過由于滅菌培養(yǎng)液的預熱過程同時為滅菌培養(yǎng)液的冷卻過程，所以程，所以節(jié)約了蒸汽及冷卻水的用量。節(jié)約了蒸汽及冷卻水的用量。共39頁 第30頁目錄連續(xù)滅菌優(yōu)勢：連續(xù)滅菌優(yōu)勢：1、高溫快速滅菌，、高溫快速滅菌，對培養(yǎng)基成分破壞少；對培養(yǎng)基成分破壞少；2、耐熱性物料和熱敏性物料可在不同溫度下、耐熱性物料和熱敏性物料可在不同溫度下分開滅菌；分開滅菌；碳源和氮源可分開滅菌，以免醛基和氨基發(fā)生反應生成有碳源和氮源可分開滅菌，以免醛基和氨基發(fā)生反應生成有害物。害物。需注意：需注意：1、黏度高或固體成分多的培養(yǎng)基連續(xù)滅菌，必須、黏度高或固體成分多的培養(yǎng)基連續(xù)滅菌，必須避免管避免管道過長，

41、道過長，或盡可能將淀粉質原料先液化?；虮M可能將淀粉質原料先液化。2、采用連續(xù)滅菌時，發(fā)酵罐應、采用連續(xù)滅菌時，發(fā)酵罐應提前空消，提前空消，加熱器、維持加熱器、維持罐及冷卻器也應先滅菌。罐及冷卻器也應先滅菌。共39頁 第31頁目錄 4.4.1 空氣除菌方法空氣除菌方法4.4 空氣除菌空氣除菌 4.4.2 空氣除菌流程空氣除菌流程 空氣除菌空氣除菌就是就是除去或殺滅除去或殺滅空氣中的微生物，空氣中的微生物，可使用介質過濾、輻射、化學藥品、加熱、靜可使用介質過濾、輻射、化學藥品、加熱、靜電吸附等方法。其中，電吸附等方法。其中，介質過濾和靜電吸附介質過濾和靜電吸附方方法是利用分離過程把微生物粒子除去，

42、其余的法是利用分離過程把微生物粒子除去，其余的方法是使微生物蛋白質變性失活。方法是使微生物蛋白質變性失活。共39頁 第32頁目錄4.4.1.1 熱殺菌熱殺菌 熱殺菌熱殺菌是一種有效的、可靠的方法。是一種有效的、可靠的方法。 采用蒸汽或電加熱空氣；采用蒸汽或電加熱空氣； 利用利用空氣被壓縮時產生的熱量空氣被壓縮時產生的熱量進行加熱保溫進行加熱保溫殺菌，并安裝殺菌，并安裝分過濾器分過濾器將空氣進一步過濾，然將空氣進一步過濾，然后再進入發(fā)酵罐。后再進入發(fā)酵罐。共39頁 第33頁目錄 X-射線、射線、-射線、紫外線、超聲波、射線、紫外線、超聲波、-射線射線等從理論上都能破壞蛋白質活性而起殺菌作用。等從

43、理論上都能破壞蛋白質活性而起殺菌作用。 但應用較廣泛的還是但應用較廣泛的還是紫外線，紫外線，它的波長在它的波長在253.72256 nm時殺菌效力最強，它的殺菌力與時殺菌效力最強，它的殺菌力與紫外線的強度成正比，與距離的平方成反比。紫外線的強度成正比，與距離的平方成反比。紫紫外線通常用于超凈臺、無菌室和醫(yī)院手術室等空外線通常用于超凈臺、無菌室和醫(yī)院手術室等空氣對流不大的環(huán)境消毒殺菌。氣對流不大的環(huán)境消毒殺菌。但殺菌效率低，殺但殺菌效率低，殺菌時間長，一般要結合甲醛或苯酚噴霧等來保證菌時間長，一般要結合甲醛或苯酚噴霧等來保證無菌室的高度無菌。無菌室的高度無菌。4.4.1.2輻射殺菌輻射殺菌共39

44、頁 第34頁目錄4.4.1.3 靜電除菌靜電除菌 靜電除塵靜電除塵是利用靜電引力吸附帶電粒子而達到是利用靜電引力吸附帶電粒子而達到除菌除塵的目的，主要去除空氣中的水霧、油霧、除菌除塵的目的，主要去除空氣中的水霧、油霧、塵埃和微生物。塵埃和微生物。常用于潔凈工作臺和潔凈室所需無常用于潔凈工作臺和潔凈室所需無菌空氣的預處理，再配合高效過濾器使用。菌空氣的預處理，再配合高效過濾器使用。 懸浮于空氣中的微生物，其孢子大多帶有不同懸浮于空氣中的微生物，其孢子大多帶有不同的電荷；沒有帶電荷的微粒在進入高壓靜電場時都的電荷；沒有帶電荷的微粒在進入高壓靜電場時都會被電離變成帶電微粒。會被電離變成帶電微粒。共3

45、9頁 第35頁目錄4.4.1.4 過濾除菌法過濾除菌法 過濾除菌過濾除菌是目前最常用的空氣除菌方法，是目前最常用的空氣除菌方法，它采用它采用定期滅菌的干燥介質來阻截濾過的空氣所含的微生物，定期滅菌的干燥介質來阻截濾過的空氣所含的微生物，從而獲得無菌空氣。從而獲得無菌空氣。 原理：原理：微粒隨空氣流通過過濾層時濾層纖維所形微粒隨空氣流通過過濾層時濾層纖維所形成的網(wǎng)格阻礙氣流前進，使氣流無數(shù)次改變運動速度成的網(wǎng)格阻礙氣流前進，使氣流無數(shù)次改變運動速度和運動方向而繞過纖維前進，這些改變引起微粒對濾和運動方向而繞過纖維前進，這些改變引起微粒對濾層纖維產生層纖維產生慣性沖擊、重力沉降、攔截滯留、布朗擴慣

46、性沖擊、重力沉降、攔截滯留、布朗擴散、靜電吸引散、靜電吸引等作用而把微粒截留在纖維表面。等作用而把微粒截留在纖維表面。共39頁 第36頁目錄4.4.2 空氣除菌流程空氣除菌流程 空氣除菌流程空氣除菌流程是按發(fā)酵生產時是按發(fā)酵生產時對無菌空氣對無菌空氣的要求，的要求，如無菌程度、空氣壓力、溫度和濕度如無菌程度、空氣壓力、溫度和濕度等，并結合等，并結合采氣環(huán)境的空氣條件采氣環(huán)境的空氣條件和和所用除菌設所用除菌設備的特性，備的特性，根據(jù)空氣的性質制定的。根據(jù)空氣的性質制定的。 吸風條件吸風條件 壓縮和鼓風壓縮和鼓風 冷卻冷卻 除水去油霧除水去油霧 過濾過濾 共39頁 第37頁目錄4.4.2 空氣除菌

47、流程空氣除菌流程4.4.2.1 兩極冷卻、加熱除菌流程兩極冷卻、加熱除菌流程4.4.2.2 冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程4.4.2.3 高效前置過濾空氣除菌流程高效前置過濾空氣除菌流程4.4.2.4 利用熱空氣加熱冷空氣的流程利用熱空氣加熱冷空氣的流程共39頁 第38頁目錄4.4.2.1 兩極冷卻、加熱除菌流程兩極冷卻、加熱除菌流程旋風分離器旋風分離器特點：特點：兩次冷卻、兩次分離、適當加熱。兩次冷卻、兩次分離、適當加熱。兩次冷卻、兩次分兩次冷卻、兩次分離油水的好處是能提高傳熱系數(shù)，節(jié)約冷卻水，油水分離得離油水的好處是能提高傳熱系數(shù)，節(jié)約冷卻水，油水分離得比較完

48、全。比較完全。 適用：適用：比較完善的除菌流程，比較完善的除菌流程，能適應各種氣候條件，充分分能適應各種氣候條件，充分分離油水，尤其適用潮濕的地區(qū)及對無菌程度要求比較高的微離油水，尤其適用潮濕的地區(qū)及對無菌程度要求比較高的微生物工程產品。生物工程產品。共39頁 第39頁目錄4.4.2.2冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程 1-粗過濾器粗過濾器; 2-壓縮機壓縮機; 3-貯罐貯罐; 4-冷卻器冷卻器; 5-絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器; 6-過濾器過濾器圖圖4- 6 冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程 壓縮空氣從貯罐出來后分成兩部分，壓縮空氣從貯罐出來

49、后分成兩部分，一部分進入一部分進入冷卻器，冷卻到較低溫度，經分離器分離水、油霧后冷卻器，冷卻到較低溫度，經分離器分離水、油霧后與另一部分未處理過的高溫壓縮空氣混合，此時混合與另一部分未處理過的高溫壓縮空氣混合，此時混合空氣已達到溫度為空氣已達到溫度為3035，相對濕度為，相對濕度為5060的的要求，再進入過濾器過濾要求，再進入過濾器過濾特點：特點：省去二次冷卻、分離設備和空氣加熱設備，省去二次冷卻、分離設備和空氣加熱設備，流流程比較簡單，程比較簡單，利用壓縮空氣來加熱析水后的空氣，利用壓縮空氣來加熱析水后的空氣，冷冷卻水用量少等。卻水用量少等。適用：適用：中等含濕地區(qū)，中等含濕地區(qū)，但不適合于空氣含濕量高的地但不適合于空氣含濕量高的地區(qū)。區(qū)