分子遺傳學(xué)復(fù)習(xí)題

1、分子遺傳學(xué)復(fù)習(xí)題名詞解釋：DNA 甲基化 ( DNA methylation ) :是指由 DNA 甲 基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，催化甲基基團從 S-腺昔甲硫氨酸向胞 嘧啶的 C-5 位點轉(zhuǎn)移的過程。ENCODE 計 劃 (The Encyclopedia of DNA Elements Project)：即“DNA元件百科全書計劃”，簡稱 ENCODE 計劃，是在完成人類基因組全序列測定后的2003 年 9 月由美國國立人類基因組研究所(NationalHuman Genome Research Institute， NHGRI ) 組織的又一 個重大的國際合作計劃，其目的是解碼基因組的藍圖，鑒定人類

2、基因組中已知的和還不知功能的多個物種的保守序列等在內(nèi)的所有功能元件。ENCODE 計劃的實施分為 3 個階段：試點階段(a pilot phase) 、技術(shù)發(fā)展階段 a a technology development phase)和生產(chǎn)階段( a producttion phase) 。gRNA (guide RNA) ： 既指導(dǎo)” RNA(gRNA ， guide RNA) ， 能通過正常的堿基配對途徑，或通過G U 配對方式與 mRNA 上的互補序列配對，指導(dǎo)編輯的進行。GT -AG 規(guī)律 ( GT -AG rule) ：真核生物所有編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，其RNA 前體在內(nèi)含子和外顯子交

3、界處有兩個較短的保守序列，內(nèi)含子的左端均為GT，右端均為AG ，此規(guī)律稱GT-AG 規(guī)律。miRNA :即小RNA ,長度為22nt左右，5'端為 磷酸基團、3'端為羥基。miRNA廣泛存在于真核生物 中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質(zhì)，其基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，在RNase出酶切后以雙鏈形式存在，是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA,它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。RNA 編輯 (RNA editing) : 是指通過堿基修飾、核 苷酸插入或刪除以及核苷酸替換等方式改變RNA 的堿基序列的轉(zhuǎn)錄后修飾方式。RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體( RNA Indu

4、ced SilencingComplex ， RISC ) ： 與 siRNA 結(jié)合后可識別并切斷mRNA。RNA 指導(dǎo)的 DNA 甲基化(RNA Directed DNAMethylation RDDM ) ： 活性 RISC 進入核內(nèi)，指導(dǎo)基因 發(fā)生 DNA 的甲基化。密碼子擺動假說(wobble hypothesis ) ： 密碼子的第1, 2位核甘酸(5' <3)'與反密碼子的第 2, 3核昔 酸正常配對；密碼子的的第3 位與反密碼子的第1 位配對并不嚴謹，當(dāng)反密碼子的第1 位為 U 時可識別密碼子第 3 位的 A 或 G， 而 G 則可識別U 或 C， (I 次

5、黃嘌呤)可識別 U 或 C 或 A。比較基因組學(xué)(comparative genomics) ： 是一門通過運用數(shù)理理論和相應(yīng)計算機程序，對不同物種的基因組進行比較分析來研究基因組大小和基因數(shù)量、基因排列順序、編碼序列與非編碼序列的長度、數(shù)量及特征以及物種進化關(guān)系等生物學(xué)問題的學(xué)科。表觀遺傳變異(epigenetic variation ) :基因的堿基序列未發(fā)生改變，而是由于DNA 甲基化，組蛋白的乙?；蚏NA 編輯等修飾導(dǎo)致基因活性發(fā)生了變化，使基因決定的表型發(fā)生變化，且可遺傳少數(shù)世代，但這種變化是可逆的。超基因家族( supergene family ) ： 是 DNA 序列相似，但功

6、能不一定相關(guān)的若干個單拷貝基因或若干組基 因家族的總稱。沉默子(silencer ) ： 一種轉(zhuǎn)錄負調(diào)控元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。特點很象增強子，但不增強轉(zhuǎn)錄，而是減弱轉(zhuǎn)錄，故稱負增強子。代謝組學(xué)(metabolomics) ： 是對某一生物或細胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定 性和定量分析的一門新學(xué)科。端粒 (telomere) ： 是由獨特的DNA 序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成的線性真核染色體的末端結(jié)構(gòu)，它具有防止末端基因降解、染色體末端間的粘連和穩(wěn)定染色體末端及其精確復(fù)制等功能。反向遺傳學(xué)( reverse genetics) ：是從改變某個感興趣的基

7、因或蛋白質(zhì)入手，然后去尋找相關(guān)的表型變 化。反 轉(zhuǎn) 座 子 ( retroposon ) 或 “ 反 轉(zhuǎn) 錄 轉(zhuǎn) 座 子( retrotransposon ) ” :先轉(zhuǎn)錄為RNA 再反轉(zhuǎn)錄成DNA而進行轉(zhuǎn)座的遺傳元件。核酶( ribozyme ) :具有催化活性的RNA, 即化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸(RNA), 卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA 分子中的某些部位。核心啟動子( core promoter ) ： 是指在體外測定到的由RNA pol n進行精確轉(zhuǎn)錄起始所要求的最低限度的一套 DNA 序列元件?；瘜W(xué)基因組學(xué)(chemogenomics)

8、： 它是作為后基因組時代的新技術(shù), 是聯(lián)系基因組和新藥研究的橋梁和紐帶。它指的是使用對確定的靶標蛋白高度專一的小分子化合物來進行基因功能分析和發(fā)現(xiàn)新的藥物先導(dǎo)化合物?；蚪M印跡(genomic imprinting) :也稱作基因印跡 (gene impringting) ，是一種新發(fā)現(xiàn)的非孟德爾遺傳現(xiàn)象，指來自雙親的某些等位基因在子代中呈現(xiàn)差異性表達的現(xiàn)象。程 序 性 細 胞 死 亡 / 凋 亡 ( programmed cell death/apoptosis) ：細胞應(yīng)答一類刺激劑，引起一連串特征性的反應(yīng)，從而啟動導(dǎo)致細胞死亡的途經(jīng)。焦磷酸化編輯( pyrophosphorolytic

9、editing ) ： RNA聚合酶通過PPi 的摻入(聚合反應(yīng)的逆反應(yīng))去除錯誤加入的核苷酸，然后加入正常的核苷酸，雖然這種編輯不能區(qū)分正常和錯誤的核苷酸，但由于轉(zhuǎn)錄在錯誤加入核苷酸后停留時間過長，而對其有優(yōu)先校正功能。酵母雙雜交(yeast two-hybrid) ： 利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用 。亮氨酸拉鏈( leucine zipper ) ： 是由伸展的氨基酸組成，每7 個氨基酸中的第7 個氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在 “-螺旋的一側(cè)，所有帶電荷的氨基酸殘基排在另一側(cè)。當(dāng)2 個蛋白質(zhì)分子平行排列時，亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形

10、成“拉鏈”。密碼子使用的偏好(relative synonymous codonusage， RSCU ) ： 編碼同一氨基酸的各個密碼子的使用頻率在不同生物中并不相同，也不與該氨基酸在整個蛋白質(zhì)中的頻率成正比，這也就是密碼子使用的偏好現(xiàn)象，該現(xiàn)象可影響基因表達的效率。母系印跡(maternal imprinting) : 來自母本的等位基因(母源等位基因)不表達，而父源等位基因表達的現(xiàn)象 。母性基因(maternal gene) ： 母體卵子發(fā)生時所表達的基因，母性體細胞基因是在母性體細胞中表達，而母性胚系基因則在生殖細胞中表達(如卵母細胞)。染色質(zhì)重塑(chromatin remodeli

11、ng) : 是表觀遺傳修飾中一種常見的方式，是指導(dǎo)致整個細胞分裂周期中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和位置改變的過程。染色質(zhì)重塑因子( chromatin remodeling factor ) :依靠水解ATP 提供能量來完成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。染色質(zhì)重塑因子在組成及功能上不同，但都包含類Snf2 超家族的 ATP 酶亞基增強子(enhancer) ：該 DNA 序列可增加與其連鎖基因轉(zhuǎn)錄的頻率。增強子多位于基因的5端，但也可位于基因的3 端，甚至基因的內(nèi)含子中。無位置及方向性，但可能有組織細胞特異性，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10200倍，有的甚至可以高達上千倍。甚至遠離靶基因達幾千kb 也仍有增強作用。轉(zhuǎn)座子沉

12、默(transposon silencing ) :宿主積累了轉(zhuǎn)座子的多個拷貝，從而阻遏轉(zhuǎn)座發(fā)生。組成型剪接(constitutive splicing ) ：編碼蛋白質(zhì)的不連續(xù)基因通過RNA 剪接將內(nèi)含子從mRNA 的前體中依次去除，然后規(guī)范地將外顯子剪接成成熟的mRNA ，這種剪接方式是一個基因只產(chǎn)生一種成熟的mRNA， 一般也只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。組蛋白密碼(histone code) ：組蛋白氨基端的各種修飾(甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等)及組合通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生效應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點而影響基因的表達活性，從而調(diào)控下游的細胞學(xué)過程。組蛋白修飾(histone modifica

13、tion) :是指染色質(zhì)上的組蛋白被甲基化、乙?；蛄姿峄倪^程。中心法則(central dogma) F.Crick 于 1958 年提出的闡明遺傳信息傳遞方向的法則，指出遺傳信息從DNA 傳遞至 RNA ,再傳遞至多肽。DNA 與RNA之間遺傳信息的傳遞是雙向的，而遺傳信息只是單向地從核酸流向蛋白質(zhì)。簡答題：1. 核小體與核小體定位在基因表達及其調(diào)控中有何作用？答：核小體的形成及其在染色質(zhì)上的精確定位導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不均勻，表現(xiàn)為某些區(qū)域核小體占據(jù)率高、某些區(qū)域核小體缺乏。由于核心DNA 被包裝進核小體中，阻斷了轉(zhuǎn)錄因子等與DNA 的接觸機會，核小體起基因轉(zhuǎn)錄抑制子的作用；而核小體之間的自

14、由區(qū)域更有利于這些蛋白因子與其識別位點的結(jié)合；此外，核小體定位在染色質(zhì)重塑過程中發(fā)生變化，從而明顯地影響基因的表達水平。2. 原核生物與真核生物的啟動子結(jié)構(gòu)有什么差別？答：原核生物的啟動子特點： Pribnow框：TATAAT ,位于-10左右，是 RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點 Sextama 框： TTGACA ，位于 -35 附近，是RNA 聚合酶的初始結(jié)合位點 上述二者及之間的距離決定轉(zhuǎn)錄效率，一般距離17bp 左右 CAP 位點是cAMP -受體蛋白復(fù)合物在啟動子上的的結(jié)合位點真核生物有三類RNA 聚合酶，與此對應(yīng)，有三類不同的啟動子：RNA聚合酶I識別的啟動子，由起始位點的核心啟動子和

15、其上游控制元件兩部分組成。核心啟動子包括 -45 到 +20， 負責(zé)轉(zhuǎn)錄的啟始；上游控制元件從-200 到 -150， 它們之間的序列長度對轉(zhuǎn)錄效率影響很大。RNA聚合酶出啟動子可分為兩種類型。一種是啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始點下游，分為兩個亞型，I型和H型，I型內(nèi)部啟動子有兩個分開的序列boxA ,和boxC,而它們之間的距離比較固定，為中間元件( internal element IE),這是5SrRNA基因的 典型結(jié)構(gòu)；n型啟動子內(nèi)部啟動子由 boxA和boxB組成，兩者之間距離較大，且不固定， 是tRNA基因啟 動子的典型結(jié)構(gòu)。另一種啟動子是與常見的啟動子相似，又稱上游啟動子(upstream

16、 promoter) 。上游啟動子包括三部分元件， 即 TATA 框， 近側(cè)序列元件( proximal sequence element, PSE) ， 和遠側(cè)序列元件( distal sequence element,DSE) ，這是部分snRNA 基因啟動子的典型結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶H啟動子由四部分元件組成，即轉(zhuǎn)錄起始點、 TATA盒、上游元件和遠上游元件。轉(zhuǎn)錄起始點(initiators )位于-3 +5，常和 TATA 盒組成核心啟動子起始基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。絕大多數(shù)H型轉(zhuǎn)錄酶啟動子均含有TATA盒，一致性序列為 TATAAAA ,常在起始點上游-25bp 1. 0bp區(qū)，TATA盒對有些II型

17、轉(zhuǎn)錄酶啟動子的功能是十分重要。上游元件(upstream element,UE )位于TATA盒上游的元件種類較多，常見的有 GC盒、CAAT盒、八聚體元件、另外有些啟動子還可見到KB 、 ATFu 等。 GC 盒：位于TATA 上游特定位置上(-90bp) ，一個或幾個含有高GC 序列的元件，有位置依賴性，但無方向依賴性，它與SP1 蛋白結(jié)合后可以促進轉(zhuǎn)錄的效率。 CAAT 盒一般位于起始點上游-80 到 -75 左右?？蓸O大的提高轉(zhuǎn)錄的效率，但對其起點、特異性等無影響。遠上游元件或遠端調(diào)控區(qū)，比較常見的有增強子、沉默子、上游激活序列、邊際序列、絕緣子等。3. 常見的反式作用因子有哪些？其結(jié)

18、構(gòu)特點是什么？答： 轉(zhuǎn)錄因子有數(shù)千種之多，從其結(jié)構(gòu)特點來看，主要有兩大功能區(qū)， DNA 結(jié)合域， 活性域。對于 DNA結(jié)合域， 根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)域的特點，又可分為：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 ( helix-turn-helix,HTH ) ， 鋅指 ( zinc finger) ，螺旋-環(huán) -螺旋( helix -loop -helix,HLH ) ， 亮氨酸拉鏈( leucine zipper， ZIP) ， 同源異型域( homeodomain,HD) ，激素受體類(類固醇等)或核受體類，3桶(伊barrels)結(jié)構(gòu)等。大量的實驗證明這兩大功能域是分開的，但不同轉(zhuǎn)錄因子的活性域其激活方式可能不同。

19、 鋅指蛋白，鋅指結(jié)構(gòu)域是由蛋白質(zhì)上保守的半胱氨酸及/或組氨酸與鋅原子結(jié)合形成一個手指狀的結(jié)構(gòu)。典型的鋅指蛋白往往有多個鋅指結(jié)構(gòu)域，兩個鋅指之間由7 8 個氨基酸相連。從每個鋅指的三級結(jié)構(gòu)來看，其N端形成3折疊，C端形成“螺旋。反向平行的3折疊區(qū)含有2個半胱氨酸，與其后 a螺旋中的 2 個組氨酸一起與鋅原子結(jié)合，而由鋅原子穩(wěn)定了整個鋅指結(jié)構(gòu)。 同源異型域蛋白，同源異型域(homeodomains,HD )蛋白含有60 個氨基酸保守序列的DNA 結(jié)合蛋白，屬于 HTH 蛋白， 可形成三個螺旋區(qū)，其中螺旋2、 螺旋 3 形成典型的HTH 域， 螺旋 3 識別螺旋與DNA大溝結(jié)合，其N 末端臂參與DN

20、A 小溝的結(jié)合3-barrels結(jié)構(gòu)域，由多個反向平行的3折疊構(gòu)成的伊桶(barrels)結(jié)構(gòu)，每個亞基上的a-螺旋則與DNA大溝相結(jié)合，兩個相鄰的大溝被識別螺旋結(jié)合后可導(dǎo)致DNA 分子發(fā)生45°的彎曲。 螺旋一環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域，長 4050個氨基酸，有兩個長1516個氨基酸的親水、親脂的 a螺旋，長度不同的環(huán)(連接區(qū))將其分開。多數(shù)HLH 附近有一強堿性的氨基酸區(qū)是DNA 的識別和結(jié)合所必需的亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)域，亮氨酸拉鏈(leucine zipper, ZIP)的雙親a螺旋其疏水面亮氨酸突出，并與另一個平行的亮氨酸拉鏈蛋白的亮氨酸突出交錯排列，盤繞成卷，兩個右手螺旋互相纏繞，每圈3.

21、5 個氨基酸，每 7 個殘基構(gòu)成一個完整的重復(fù)單位，因此亮氨酸在拉鏈區(qū)每隔6 個氨基酸殘基重復(fù)出現(xiàn)一次，兩個蛋白形成同源二聚體或異源二聚體。在每個拉鏈蛋白質(zhì)中與亮氨酸重復(fù)序列鄰近的區(qū)域是高度堿性的，可作為一個DNA 的結(jié)合位點。整個二聚體呈Y 型結(jié)構(gòu)。4. 原核生物與真核生物基因表達調(diào)節(jié)機制的主要差別是什么？ 在原核生物中，基因表達的調(diào)控以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控為主，在調(diào)節(jié)基因的作用下，主要以操縱子為單位，轉(zhuǎn)錄出一條多順反子 mRNA,并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成；而且轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的，很少發(fā)生mRNA的加工、修飾。但也存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，例如反義RNA 的調(diào)控，翻譯的調(diào)控，RNA 開關(guān)等。 在真核生物中，基因

22、表達的調(diào)控十分復(fù)雜，可發(fā)生在多個層次、多個水平，包括從染色體和染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)控制，DNA 的復(fù)制、RNA 的轉(zhuǎn)錄、加工與拼接、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后加工、修飾等等。對于真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，主要是順式作用元件( cis-acting element)與反式作用因子(trans-acting factor)的相互作 用。 另外， DNA 的重排和RNA 的交替剪接也是真核生物基因表達多樣性的重要機制；近年發(fā)現(xiàn)的小分子RNA通過 RNA 干擾途徑也可調(diào)節(jié)基因的表達，介導(dǎo)DNA 的甲基化、mRNA 的降解及翻譯起始的抑制等。5. 轉(zhuǎn)座子的遺傳學(xué)效應(yīng)與應(yīng)用答： 改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，引起的染色體DNA 缺

23、失或倒位； 誘發(fā)基因突變； 調(diào)節(jié)基因表達，很多轉(zhuǎn)座子帶有增強子，有的還含有啟動子，能促進基因的轉(zhuǎn)錄活性；轉(zhuǎn)座子插入某個基因的內(nèi)含子或外顯子中而影響該基因表達；產(chǎn)生新的變異；應(yīng)用轉(zhuǎn)座子標記技術(shù)，克隆目的基因；以轉(zhuǎn)座因子作為基因工程載體，進行轉(zhuǎn)基因等遺傳操作。6. 簡述染色質(zhì)重塑的基本過程及其生物學(xué)功能。答： 染色質(zhì)重塑是指導(dǎo)致整個細胞分裂周期中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和位置改變的過程。此過程由兩種蛋白復(fù)合體所介導(dǎo)，即 ATP 依賴型核小體重構(gòu)復(fù)合體和組蛋白修飾復(fù)合體。染色質(zhì)的重塑因子通過利用ATP 水解釋放的能量，引起特定核小體位置的改變(滑動),或核小體三維結(jié)構(gòu)的改變 , 或二者兼有,將核小體重新排布，從高

24、度致密的染色質(zhì)上解開,從而使啟動子區(qū)中的順式作用元件得以暴露,為反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)與之結(jié)合提供了空間接觸的可能。組蛋白修飾因子并不改變核小體的位置，而是在DNA 上作標記，以招募其他的活性成分(組蛋白密碼)，對核心組蛋白N 端尾部進行共價修飾，從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)重塑是DNA 修復(fù)和基因表達調(diào)控過程中的一個重要環(huán)節(jié)。細胞基因組中的DNA 通常并非處于裸露狀態(tài)，而是與組蛋白一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)致密的染色質(zhì)，故染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的改變會影響基因的表達。細胞中存在著各種不同的染色質(zhì)重塑因子復(fù)合物激活或者沉默基因的表達。染色質(zhì)重塑在個體發(fā)育，人類疾病及基因劑量補償中具有重要作用論述題1. 有哪些方法可

25、用于功能基因組學(xué)的研究？現(xiàn)在有何進展？答：隨著多種生物全基因組序列的獲得，基因組研究正在從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)的整體研究。在功能基因組學(xué)的研究中通常運用高通量技術(shù)(high-throuput techniques ) ，如 DNA 微陣列(DNAmicroarrays ) ，反向遺傳學(xué)(reverse genetics )技術(shù)如基因打靶，轉(zhuǎn)基因以及反義mRNA 和 RNA 干擾等技術(shù)來系統(tǒng)地分析基因功能及基因間相互作用，基因組的時空表達以及發(fā)現(xiàn)和尋找新基因等。( 1) DNA 微陣列技術(shù)又稱DNA 芯片( DNA chips )或基因芯片技術(shù)(gene chips) ，它通過將對應(yīng)于不

26、同基因 或 cDNA 的 DNA 片段或寡聚核苷酸點樣于微芯片上形成高密度的矩陣，與熒光標記的總mRNA進行雜交，然后通過激光共聚焦掃描檢測并運用計算機軟件對雜交信號進行自動化定性定量分析，具有高通量、實時、靈敏、準確等特點。( 2)基因打靶是指通過轉(zhuǎn)染的DNA 序列與細胞內(nèi)同源的基因組序列(靶序列)之間進行同源重組，以改變靶序列來研究其結(jié)構(gòu)和功能或進行基因治療的技術(shù)。基因打靶技術(shù)包括基因敲除(knock -out)和基因敲入(knock-in),前者是用無功能的DNA序列與靶序列重組，破壞原基因組的遺傳功能，后者是用有功能的DNA 序列與受到破壞的靶序列重組使其恢復(fù)遺傳功能。基因打靶技術(shù)是一

27、種從基因到表型的新研究方法，屬于反求遺傳學(xué)范疇。( 3) 反義 mRNA 技術(shù)通過向細胞導(dǎo)入一段與特定編碼mRNA 互補的非編碼RNA 鏈， 使其與該段mRNA特異性結(jié)合而定向阻抑靶基因表達的技術(shù)。這一技術(shù)的成熟，為功能基因組學(xué)的研究和基因治療提供了新的思路。在反義mRNA 技術(shù)的研究過程中，科學(xué)家們意外發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入正義mRNA ( sense RNA )與導(dǎo)入反義mRNA 具有等效的阻抑效應(yīng)。而更令人吃驚的是如果導(dǎo)入相應(yīng)雙鏈RNA ( dsRNA ) ，其阻抑效應(yīng)比導(dǎo)入任一單鏈RNA 強十倍以上，dsRNA 若經(jīng)純化則阻抑效應(yīng)更強。這種雙鏈RNA 特異性地作用于與其序列配對的基因而抑制其表達的現(xiàn)

28、象叫做RNA 干涉。 RNA 干涉技術(shù)作為一種新的定點敲除knockdown 技術(shù)，賦與了功能基因組學(xué)、基因治療等全新的思路，堪稱生命科學(xué)近年來的革命性的突破。因而發(fā)現(xiàn)RNA 干擾機制的兩位美國科學(xué)家Fire 和 Mello 榮獲 2006 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。可見該項成果的重大科學(xué)意義。2. 目前最常用的突變體創(chuàng)制方法有哪些？如何利用突變體進行功能基因組學(xué)研究？答： 1.化學(xué)誘變，化學(xué)誘變劑主要有烷化劑、堿基類似物、亞硝基化合物、疊氮化物等，多用烷化劑，如 EMS 和 MNU 等。 EMS 誘發(fā)的特點是突變均勻分布于整個基因組中而不呈現(xiàn)明顯的 “熱點” 。 我們不僅僅可以通過EMS 造成

29、轉(zhuǎn)錄提前終止的功能缺失突變體來研究基因的功能，也可以通過錯義突變引起的一些表型較弱、中間類型的突變體來研究功能蛋白中某個特定氨基酸殘基的功能。2 .物理誘變，誘變劑主要有紫外線，X-射線，丫射線，快中子，激光，微波，離子束等；電離輻射廣泛用于植物、動物和微生物的誘變育種，由于快中子具有能量高、輻射處理的劑量容易控制和操作簡便等特點，在生物誘變上具有獨到的優(yōu)點：如對子粒較大的玉米、大豆等的誘變效率較高，誘變的劑量(強度和時間)容易控制，在一個基因組上可以存在多個突變位點，同時誘變后生物材料仍保持較高的活性3 .生物技術(shù)，轉(zhuǎn)基因， 基因打靶，激活標簽法, G atew ay 全長 cDNA 過量表

30、達技術(shù)和RNA 干涉技術(shù)等。T-DNA 標簽技術(shù)是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法，在獲得穩(wěn)定的突變表型后 , 可用報告基因為探針在突變體文庫中克隆相應(yīng)的功能基因。還可通過質(zhì)粒挽救的方法克隆插入序列兩翼的基因片段。T-DNA 標簽突變體庫除了通過基因敲除來研究基因功能以外，還可通過對T-DNA 標簽的改造建立了激活標簽(activation tagging)突變體庫，和捕獲標簽( entrapment tagging)突變體庫。轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)：廣泛應(yīng)用于病毒、細菌、酵母、果蠅、擬南芥菜、水稻等物種的突變體創(chuàng)制與基因功能研究。尤其是在高等植物上取得了突破性進展，如玉米激活子(a

31、ctivator, Ac)、解離子(dissociation ,Ds)、增變子(mutator, Mu)、金魚草Tam、矮牽牛dTphl以及水稻的Tos17。構(gòu)建突變體庫是功能基因組學(xué)研究的重要手段。1 .重要性狀基因的克隆與鑒定：通過TILLING 、 PCR walking 或圖位克隆技術(shù)，可以獲得某些突變性狀所對應(yīng)的突變基因，確定基因與性狀的對應(yīng)關(guān)系。只要擁有飽和的突變體庫，理論上可以獲得所有基因的突變體。2.創(chuàng)制中間材料，研究生物生長發(fā)育和代謝途徑3. RNAi通過哪些機制控制基因的表達？實踐中有何應(yīng)用？答：RNA 干涉(RNA interference, RNAi) 通過雙鏈 RNA

32、( double -stranded RNA, dsRNA) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。它可以快速分析靶基因的功能，成為反向遺傳學(xué)研究的重要工具之一。1) 胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶 Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA (約2123 bp),即siRNA。 siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義 siRNA再與體內(nèi)一些 酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA -induced silencing complex , RISC)。 RISC與外源性基因表達的 mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功

33、能，在結(jié)合部位切割mRNA ,切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿 主細胞針對這些 mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈 mRNA ,而且可作為引物與靶 RNA結(jié)合并在 RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase , RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA ,新合成 的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級 siRNA ,從而使RNAi的作用進一步放大， 最終將靶mRNA完全 降解，使基因沉默2) 線蟲的lin4和let7,通過和靶基因 mMT的3'末端非翻譯區(qū)結(jié)合而阻斷相應(yīng)

34、蛋白質(zhì)的翻譯3) RNAi對基因表達的靜默作用可能通過染色質(zhì)濃縮實現(xiàn)，dsRNA可結(jié)合到植物啟動子區(qū)域，能通過一種使DNA甲基化的作用導(dǎo)致基因沉默。4) siRNA可能參與纖毛蟲，四膜蟲蟲體間結(jié)合時的基因重組。在蟲體之間結(jié)合過程中，結(jié)合到重組序列的 siRNA介導(dǎo)DNA缺失和染色體斷裂。5) 轉(zhuǎn)座子沉默與 siRNA有關(guān)，蠕蟲 mut-7基因參與 RNAi和轉(zhuǎn)位抑制，從裂殖酵母的中心粒區(qū)分離出 siRNA ,并檢測到這些 siRNA介導(dǎo)此區(qū)內(nèi)組蛋白甲基化。應(yīng)用：1) RNAi在探索基因功能中的應(yīng)用在RNAi技術(shù)出現(xiàn)以前，基因敲除( gene knockout )是主要的反向遺傳學(xué)( rever

35、se genetics )研究 手段，但其技術(shù)難度較高、操作復(fù)雜、周期長。由于 RNAi技術(shù)可以利用 siRNA或siRNA表達載 體快速、經(jīng)濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。同時siRNA表達文庫構(gòu)建方法的建立，使得利用RNAi技術(shù)進行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點有重要意義。2) RNAi在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用RNAi的作用具有高效率和高特異性的特點，它能使目標蛋白的mRNA發(fā)生特異性降解。因此RNAi是基因沉默療法的理想工具。目前，人們已經(jīng)證明在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，可用于抗病毒和抗 腫瘤等的基因治療；3)

36、 其他a) RNAi在新藥物的研究與開發(fā)中的應(yīng)用可以作為高通量藥物靶標靶標識別和確認的工具； b)由于能高效特異的阻斷基因的表達，可使其成為研究信號傳導(dǎo)通路的良好工具；c) RNAi技術(shù)已被用于改良植物品質(zhì)、改善植物營養(yǎng)價值等方面的研究，取得了客觀的經(jīng)濟效益。4 . DNA甲基化是如何在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達的？ 直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子與各自啟動子結(jié)合的識別位置DNA的大溝是許多蛋白因子與DNA結(jié)合的部位，胞喀咤的甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。許多轉(zhuǎn)錄因子，如AP-2和E2F等能識別含CpG的序列，且對其甲基化程度非常敏感，當(dāng) CpG上白C C被甲基化后，轉(zhuǎn)錄即被抑制。 轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物干擾基

37、因轉(zhuǎn)錄甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)內(nèi)的甲基化CpG島結(jié)合，再與其它一些蛋白共同形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物 (transcriptional repression complex, TRC),阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的 結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。 已經(jīng)鑒定了甲基化胞喀咤結(jié)合蛋白1和2(MeCP1和MeCP2)及甲基化DNA結(jié)合蛋白(MBD )等轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。MeCP1的抑制作用比較弱，需要與含12個甲基化CpG的位點結(jié)合，缺乏MeCPI的細胞其基因組內(nèi)甲基化基因的抑制作用減弱。MeCP2在細胞中比 MeCPl豐富，轉(zhuǎn)錄抑制作用比較強，可與單個甲基化的CpG堿基對結(jié)合。通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而抑制基因

38、表達DNA甲基化與組蛋白去乙酰化正相關(guān)，而乙?；揎椪钦{(diào)節(jié)基因表達的另一重要方式。染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨著組氨酸的乙?；腿ヒ阴；S多乙?；腿ヒ阴；副?身就分別是轉(zhuǎn)錄增強子蛋白和轉(zhuǎn)錄阻遏物蛋白。DNA失活的區(qū)域處于高度甲基化狀態(tài)，同時又富含低乙?；M氨酸。CpG二聚體中胞喀咤甲基化是高等真核生物基因組的主要特征。一般來說，在基因啟動子區(qū)的 DNA甲基化伴隨著基因沉默。5 .真核生物CG島的甲基化狀態(tài)與基因的表達活性的關(guān)系如何？ CpG島經(jīng)常出現(xiàn)在真核生物的 house-keeping基因的5'端調(diào)控區(qū)域調(diào)控區(qū)，在其它地方出現(xiàn)時會由于CpG中的C易被甲基化而形成 5'-甲基

39、胞喀咤，脫氨基后形成胸腺喀咤，由于T本身就會存在于 DNA中，因此不易被修復(fù)，所以被淘汰。故CpG在基因組中是以島的形式分布的。 除定位于失活X染色體上的基因和印跡基因外，正常細胞的CpG島由于被保護而處于非甲基化狀態(tài)。啟動子區(qū)域的CpG島的非甲基化狀態(tài)對相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄是必須的，而甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)，去甲基化 往往與一個沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián)。 目前認為基因調(diào)控元件（如啟動子）的 CpG島中發(fā)生5mC修飾會在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合，而直接抑制基因表達；通過轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，間接影響基因表達 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調(diào)節(jié)失控和正常非甲基化CpG

40、島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象。以往的研究證明啟動子區(qū)的高甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是人類腫瘤所具有的共同特征之一，而 且這種高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的又一個機制。6 .端粒及其生物學(xué)意義端粒是由許多簡單重復(fù)序列和相關(guān)蛋白組成的線性真核染色體的末端結(jié)構(gòu)，它具有防止末端基因降解、染色體末端間的粘連和穩(wěn)定染色體末端及其精確復(fù)制等功能。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，是以自身 RNA為模板，合成端粒重復(fù)序列，加到新合成DNA鏈末端。 端粒與衰老：大量實驗說明端粒、 端粒酶活性與細胞衰老有著一定的聯(lián)系，對于正常細胞來說，當(dāng)進行了一定次數(shù)的分裂后，端粒長度縮短到一定程度，會使細胞停止分

41、裂，導(dǎo)致衰老與死亡；有很多與老年相關(guān)的 疾病以及早衰綜合癥都與端粒加快縮短相關(guān)；此外，端粒酶基因的突變體還會引起很多人類的一些綜合癥，如再生障礙性貧血。 端粒與癌癥：90%以上的癌細胞都通過端粒酶途徑來維持端粒長度，通過抑制端粒酶的活性來阻止癌細胞 生長一直是人們治療癌癥的一個策略。端粒與干細胞端粒的長度能調(diào)節(jié)細胞自我更新的能力和腫瘤的抑制的平衡狀態(tài)。但是許多問題用端粒學(xué)說還不能解釋。研究發(fā)現(xiàn)有些細胞的端粒長度長期維持在一個較高的水平，而端粒酶卻不表達。另外，Kippling發(fā)現(xiàn)，鼠的端粒比人類長近5-10倍，壽命卻比人類短的多。這些都提示體細胞端粒長度與個體的壽命及不同組織器官的預(yù)期壽命并非

42、一致。生殖細胞的端粒酶活性長期維持較高的水平卻不會象腫瘤那樣無限制分裂繁殖；生殖細胞內(nèi)端粒酶活性較高，體細胞中為什么沒有較高的端粒酶活性。看來端 粒的長度縮短是衰老的原因還是結(jié)果尚需進一步研究。7 .組蛋白修飾與基因表達調(diào)控組蛋白H2A、H2B、H3和H4是核心組蛋白，只有當(dāng)DNA存在時它們才能組裝成一種有序的結(jié)構(gòu)。組蛋白N端尾的修飾也可以改變?nèi)旧|(zhì)的易接近性而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白N端尾部可被多種酶修飾，不同組蛋白末端修飾的方式不同，這些修飾包括：乙?；?、磷酸化、甲基化、泛素化、ADP糖基化等。不同修飾的組合與基因的表達狀況密切相關(guān)，又稱組蛋白密碼。這主要是因為修飾的核小體蛋白改變了與其

43、DNA 的結(jié)合狀態(tài)，使有些位點暴露，或可與其它基因表達調(diào)控蛋白結(jié)合，改變基因表達狀態(tài)。核心組蛋白都可以被乙?；饕囊阴；稽c在組蛋白H3、 H4 的 N 端尾部的賴氨酸。乙?；贒NA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時發(fā)生。在復(fù)制時，組蛋白的乙?；苡斜匾@使得它們更容易被整合到新的核心；在轉(zhuǎn)錄中，乙?；瘜τ谙嚓P(guān)結(jié)構(gòu)上的變化也很有必要，甚至可能允許組蛋白核心從DNA 上去除，或者可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄必需的其他蛋白的結(jié)合位點。在進行有絲分裂的染色體中，經(jīng)?？梢杂^察到高度壓縮的染色質(zhì)上組蛋白H3 N 端尾部被磷酸化。據(jù)推測，這些修飾可能被參與基因表達和其他DNA 行為的蛋白質(zhì)所識別。組蛋白N 端的修飾改變了染色質(zhì)的功能，

44、從而影響到基因的表達和調(diào)控。8 . 論述基因編輯技術(shù)，重點說crisper ?；蚓庉嬍墙陙戆l(fā)展起來的可以對基因組完成精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點InDel 突變、敲入、多位點同時突變和小片段的刪失等，可在基因組水平上進行精確的基因編輯。在科研領(lǐng)域，該技術(shù)可以快速構(gòu)建模式動物，節(jié)約大量科研時間和經(jīng)費；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，該技術(shù)可以人為改造基因序列，使之符合人們的要求，如改良水稻等糧食作物；在醫(yī)遼領(lǐng)域，基因編輯技術(shù)可以更加準確、深入地了解疾病發(fā)病機理和探究基因功能，可以改造人的基因，達到基因治療的目的等。因此，基因組編輯具有極其廣泛的發(fā)展前景和應(yīng)用價值。ZFN 、 TALEN 和 CRISPR/

45、Cas9 是三大基因編輯技術(shù)1 ) ZFN 的基因打靶效率能夠達到30%左右，已經(jīng)可以做到針對某些特定的序列來設(shè)計ZFN 實現(xiàn)靶基因的修飾，但也有其發(fā)展的局限性，ZFN 的識別結(jié)構(gòu)域中存在上下文依賴效應(yīng)，使得ZFN 設(shè)計和篩選效率大大降低，也無法實現(xiàn)在每一個基因或其他功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFN 作用位點。另外，由于ZFN 的脫靶切割會導(dǎo)致細胞毒性，使得其在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用出現(xiàn)了一定的局限性。2)相比 ZFN 技術(shù)， TALEN 使用了 TALE 分子代替ZF 作為人工核酸酶的識別結(jié)構(gòu)域，極好地解決了 ZFN 對于 DNA 序列識別特異性低的問題。TALE 蛋白與 DNA 堿基

46、是一一對應(yīng)的，并且對堿基的識別只由2 個氨基酸殘基決定，這相對于ZFN 的設(shè)計要簡單得多。但是在構(gòu)建過程中，TALE 分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作，對于普通實驗室的可操作性較低，而商業(yè)化公司構(gòu)建也需要花費上千美元，使用成本較高；3)相較于ZFn 和 TALEN 兩種人工核酸酶技術(shù)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是一個天然存在的原核生物RNA干擾系統(tǒng)，其介導(dǎo)的基因組編輯是由crRNA 指導(dǎo)的， 對靶序列的識別是RNA 與 DNA 的堿基配對過程，相比蛋白質(zhì)對DNA 序列的識別要精確更多，降低了脫靶切割的幾率，減低了細胞毒性。而且 CRISPR/Cas9 的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計與

47、靶序列互補的RNA 即可， 過程相對于TALEN 更為簡單和廉價，普通的實驗室也可以自行完成構(gòu)建，這大大提高了基因操作的效率及簡便性。但是，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在著一些不足。首先，Cas9 蛋白對于目標序列的切割不僅僅依靠crRNA 序列的匹配，在目標序列附近必須存在一些小的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM) ， 如果目標序列周圍不存在PAM 或者無法嚴格配對，則 Cas9 蛋白不能對任意序列進行切割。最后，和ZFN 及 TALEN 技術(shù)一樣，CRISPR/Cas9 也面臨著如何控制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復(fù)可能隨機產(chǎn)生細胞毒性的問題。9 . 測序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用9.測序技術(shù)的發(fā)展

48、及應(yīng)用早期測序技術(shù)：1954 年， Whitfeld 等用化學(xué)降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。第一代測序技術(shù)：1977 年， Sanger 等發(fā)明雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert 等發(fā)明化學(xué)降解法，標志著第一代測序技術(shù)的誕生。第一代測序技術(shù)完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但存在成本高、速度慢等方面的不足。第二代測序技術(shù)：21 世紀后，以Roche 公司的 Solexa 技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標志的第二代測序技術(shù)誕生。第二代測序技術(shù)較第一代測序技術(shù)有采用矩陣分析技術(shù)，實現(xiàn)了大規(guī)模并行化，使得矩陣上的DNA 樣本可以被同時并行分析；邊測序邊合成，測

49、序速度大大提高；測序儀微型化，測序成本大大降低的特點。缺點： 產(chǎn)生的測序結(jié)果長度比較短，適用于對已知序列的基因組進行重新測序，且對全新的基因組進行測序時還需結(jié)合第一代測序技術(shù)。第二代測序技術(shù)原理是建立在PCR 的基礎(chǔ)上，但是擴增后得到的DNA 分子片段的數(shù)目和擴增前DNA 分子片段的數(shù)目比例有相對偏差，在分析基因表達方面存在較大的弊端。（簡而言之，缺點是序列讀長較短和需要模板擴增步驟）第三代測序技術(shù)：技術(shù)標志是單分子測序和長讀長。第三代測序技術(shù)通過在單一DNA 分子組成的陣列上進行合成測序。在一個表面積限定的介質(zhì)上使用單個分子，可以增加獨立分析的DNA 片段的數(shù)量，也意味著不再進行昂貴的DNA

50、 擴增步驟了，因此，可以使數(shù)據(jù)產(chǎn)出量更高，并且將進一步降低測序的成本。主要問題：集中在單分子水平光學(xué)信號的檢測方面，準確性降低。第四代測序技術(shù)：代表為納米孔測序，它不需要對DNA 樣品進行任何生物或化學(xué)方面的處理，而采用物理方法直接讀出其堿基序列。原理為：單個堿基通過納米孔通道時，就會引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化，并且由于ATGC 這 4 種不同的堿基存在電學(xué)性質(zhì)差異，使得它們穿越納米孔時所引起的電學(xué)參數(shù)的變化量也不同。因此，不同的電學(xué)參數(shù)變化量就對應(yīng)通過納米孔的相應(yīng)堿基。（參見 新一代測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用. 田李等）名詞解釋十選八論述2 個簡答3-4 個，重點看下第3、 5 個表1-1分子遺傳學(xué)相

51、關(guān)整嫁女諾貝爾獎名錄姓名我獎國籍功頜時間Lands te iner. K1930美人類血型的發(fā)現(xiàn)MorgaikTH1933美連鎖定律和逮傳的染色體學(xué)說L.1946美X射線透導(dǎo)基因突變1052多“一個基肉一個陶”學(xué)說LodoAoig.J.1P58美細苗雜交的方法并炭現(xiàn)轉(zhuǎn) 寧作用Sax ige x.F1958美更白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)Qchoa,S. & Kombeig,A.1939美RMA黑合酶與DNA來臺防IBum et ,F Trt.F&JVtedavrar F.B1960美抗體和成中克隆選擇學(xué)說Cahdn.M1961美光和作用中的CO 同1化作用的生化機制WatsonJ.D&

52、; CricKFH.C.1962美建立DNA的雙螺旋模型Wilki吟 MHF.1962英DNA雙等旋模型的X射線衍射圖Eccles J.C., Hodgkin.A.L.,1963渙大利神經(jīng)膜電位的發(fā)現(xiàn)&HuxleyA.F亞，英Jacob ,M.F.& ,Monod,J .L.1965法乳禽懊縱子模型DrofTAM1965法淆原現(xiàn)象的機制Rous,F.P.1966美鳥類中的致廟病毒Borlaug,N.1967墨西哥墨西哥超級小麥品種HoUeyR.W.1963美笨丙氨酸t(yī)RNA的序列、結(jié)構(gòu)和反密碼于N ire nheigM.W. & Khorana7H .G1968美遺傳密碼的破譯He