PCR技術(shù)的基本原理

1、PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板 DNA 、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合成反應(yīng)。 DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板，借助一小段雙鏈 DNA 來 啟動合成， 通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈 DNA 模板中的一段互補序列結(jié) 合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下， DNA 聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物 3-OH 末端，并以此為起始點，沿模板 5 3方向延伸，合成一條新的 DNA 互補鏈。PCR 目錄PCR 原理PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件PCR 步驟 PCR 檢測 PCR 反應(yīng)特點 PCR 儀器 聚合酶鏈式反應(yīng) (Polymerase Chain

2、 Reaction) ，簡稱 PCR ，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用 于放大特定的 DNA 片段?？煽醋魃矬w外的特殊 DNA 復(fù)制。DNA 聚合酶( DNA polymerase I )最早于 1955 年發(fā)現(xiàn) ，而較具有實驗價值及實用性的 Klenow fragment of E. Coli 則是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)， 但由于此酶不 耐高溫， 高溫能使之變性 , 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應(yīng)。 現(xiàn)今所使用的酶 (簡 稱 Taq polymerase), 則是于 1976 年從 溫泉中的細菌 ( Thermus aquaticus )分離出來的。

3、它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的 酶，但它被廣泛運用則于 80 年代之后。 PCR 最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于 1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā) 表了第一個單純且短暫性基因復(fù)制(類似 PCR 前兩個周期反應(yīng))的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出 來的 PCR 則于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 發(fā)展出的， Dr. Mullis 當(dāng)年服務(wù)于 PE 公司，因 此 PE 公司在 PCR 界有著特殊的地位。 Dr. Mullis 并于 1985 年與 Saiki 等人正式表了第一 篇相關(guān)的論文。此后， PCR 的運用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)

4、量可以說是令眾多其它研 究方法難望其項背。隨后 PCR 技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物 學(xué)研究的最重要技術(shù)。 Mullis 也因此獲得了 1993 年諾貝爾化學(xué)獎。編輯本段 PCR 原理DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。 雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性 解鏈成單鏈，在 DNA 聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分 子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)， DNA 在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成 為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入 DNA 聚合酶、 dNTP 就可以完成特定基因的體

5、外復(fù)制。但是， DNA 聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的 DNA 聚合酶，不僅操 作煩瑣，而且價格昂貴，制約了 PCR 技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱 DNA 聚合同酶 -Taq 酶對于 PCR 的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受 90 以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使 PCR 技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低 了成本， PCR 技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。PCR 技術(shù)的基本原理 類似于 DNA 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補 的寡核苷酸引物。 PCR 由變性 -退火 -延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 93 左

6、右一定時間后， 使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板 DNA 與引物的退火（復(fù)性 ）：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸： DNA 模板 -引物結(jié)合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性 -退火 -延伸三過程，就可獲得更多的 “半保留復(fù) 制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24 分鐘， 23小

7、時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。編輯本段 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準的 PCR 反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液 10ul4種dNTP 混合物 各200umol/L引物 各 10 100pmol模板 DNA 0.1 2ugTaq DNA 聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加雙或三蒸水至 100ulPCR 反應(yīng)五要素： 參加 PCR 反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、 酶、dNTP 、模板和緩沖液 （其中需要 Mg2+）編輯本段 PCR 步驟標(biāo)準的 PCR 過程分為三步：1. DNA 變性（ 90-96 ）：雙鏈 DNA 模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈 DNA2. 退火（

8、 25-65 ）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA 模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3. 延伸（ 70-75）：在 Taq 酶（在 72左右最佳的活性） 的作用下， 以 dNTP 為原料， 從引物的 5端 3端延伸，合成與模板互補的 DNA 鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸， DNA 含量既增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些 PCR 因為擴增區(qū)很短， 即使 Taq 酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成， 因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60 -65 間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。編輯本段 PCR 檢測PCR 反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠， EB ）染色

9、 凝膠電泳是最最常用的檢測手段。 電泳法檢測特異性是不太高的， 因此引物兩聚體等非特異 性的雜交體很容易引起誤判。 但因為其簡捷易行， 成為了主流檢測方法。 近年來以熒光探針 為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。編輯本段 PCR 反應(yīng)特點特異性強PCR 反應(yīng)的特異性決定因素為： 引物與模板 DNA 特異正確的結(jié)合； 堿基配對原則； Taq DNA 聚合酶合成反應(yīng)的忠實性； 靶基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。 引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原 則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及 Taq DNA 聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫

10、度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持 很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 （pg=10- 12） 量級的起始待測模板擴增 到微克 （ug=-6） 水平。能從 100 萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中， PCR 的靈敏 度可達 3 個 RFU（ 空斑形成單位 ）；在細菌學(xué)中最小檢出率為 3 個細菌。簡便、快速PCR 反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA 聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在 DNA 擴增液和 水浴鍋上進行變性 -退火 -延伸反應(yīng)，一般在 24 小時完成擴增反應(yīng)。

11、擴增產(chǎn)物一般用電泳 分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標(biāo)本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞， DNA 粗制品及 RNA 均可作為擴增模板?？芍苯佑?臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等 DNA 擴增檢測。 PCR 的循環(huán)參數(shù)1 、預(yù)變性（ Initial denaturation ）模板 DNA 完全變性對 PCR 能否成功至關(guān)重要，一般 95 加熱 3-5 分鐘。2 、引物退火（ Primer annealing ） 退火溫度一般需要憑實驗（經(jīng)驗）決定。 退火溫度對 PCR 的特異性有較大影響。3、引物延伸 引物延伸一般在 72進行（ Taq 酶最適

12、溫度）。延伸時間隨擴增片段長短而定。4、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般 95 ，30 秒足以使各種靶 DNA 序列完全變性： 變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù) PCR 含 25-35 循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。6 、最后延伸在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在 72 維持 5-15 分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成 雙鏈。（四） PCR 中的污染和假陽性PCR 中污染主要來自1、樣品間交叉污染；2 、先前 PCR 產(chǎn)物遺留（ carry-over ） 編輯本段 PCR 儀器 pcr 儀器的發(fā)展pcr 溫度循環(huán)至關(guān)重要， pcr 擴增儀各參數(shù)必須準確。自 p

13、erkin elmer cetus 公司第一臺 pcr 擴增儀問世以來，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國內(nèi)外生產(chǎn)和銷售 pcr 擴增儀。在短短的 幾年間，擴增儀經(jīng)過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進一步朝方便、實用、高智能化和 自動化的方向發(fā)展。為了便于了解和選購適宜的 pcr 實驗設(shè)備，現(xiàn)將部分國內(nèi)外 pcr 擴增儀列表如下 （表 22-5 ）； 這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點。國產(chǎn) 1109 型 dna 擴增儀則是用恒溫浴機械手移位式。更接近于手工操作。 ptc-51a/b 體積 小，智能化與自動化程序高，可以兼做套式pcr ，方便實用。以上各種儀

14、器一般都配有微電腦自動控制溫度、時間及循環(huán)數(shù)，可以達到節(jié) 省勞動力的目的。在采用這些儀器作 pcr 試 驗之前， 一般均應(yīng)實測管內(nèi)溫度變化循環(huán)情況， 以了解升、 降溫時管內(nèi)因熱傳導(dǎo)造成的溫度 滯后情況和實際到達的最高、最低溫度，用于修正設(shè)計的循環(huán)參數(shù)。溫度滯后受到所用 eppendorf 管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對變溫鋁塊式儀器影響更 大些。 對于配用制冷機式半導(dǎo)體元件致冷的儀器， 在使用低于室溫的溫度來保冷 pcr 反應(yīng)后 小管時，應(yīng)注意冷凝水的問題，勿使流入儀器內(nèi)浸濕半導(dǎo)體元件而損壞儀器。國內(nèi)外生產(chǎn)的幾種 dna 擴增儀1109 型北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合機械臂變溫

15、水浴電子調(diào)溫40×0.5ml16400 元 /臺90a/b 型 中科院遺傳所 機械臂 變溫水浴 電熱14000 元 /臺 ptc-51a/b 型 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 變溫氣流 電子調(diào)兼作套式 30×0.5ml 12000 元 /臺 dna thermal cycler perkin elmercetus（ 美 ） 變溫鋁塊 壓縮機致冷 48×0.5ml us $ 20000.- thermocycler 60 00 180b.braunbiotech（德）變溫水浴 98 四檔電熱 ,自來水冷卻 60×1.5ml 100×1.5ml 180×

16、;1.5ml dm 30000.- automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.（ 美 ） 變溫鋁塊 25 100 電熱 ,自來水冷卻 29×1.5ml 58×1.5ml us $4985.- us $7980.- grant autogen grant instrumant ltd（ 美 ） 變溫水浴 0 99 電熱 ,自來水冷卻或加冷循環(huán)器 50×1.5ml or 50×1.5ml us $250. plus us $ 15.-for rack（x2） techn

17、e phc-1 phc-2 techne ltd.（ 英 ） 變溫鋁塊 0 99三檔 電熱 500w 水冷 100w 54×0.5ml 54×0.5ml 24×1.5ml 3383. 3997. - biooven biothrm corp（ 美 ） 變溫氣流 -150 115v 11a 200' s of 4 × 96plate us $ 2990. - trio-thermo-block tb-1 biomertra（ 德 ） 半導(dǎo)體變溫220v3×20 管分別控溫dm12900. -micro cycler eeppendorf（

18、 美 ） 變溫鋁塊220v/100v3×29 管us $ 3500. - PCR 常見問題PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。 假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， PCR 循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有 Taq 酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化 除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模 板核酸 變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核

19、 酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo) 致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、 兩條引物的濃度是否對稱， 是PCR 失敗或擴增條帶不 理 想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條 濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單 位。引物的濃 度不僅要看 OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳， 一定要有引物條帶出現(xiàn)， 而且兩 引物帶的亮度應(yīng)大體一致， 如一條引物有條帶， 一

20、條引物無條帶， 此時做 PCR 有可能失敗， 應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。 如一條引物亮度高， 一條亮度低， 在稀釋引物時要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存， 防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分， 導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失 效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對 PCR 擴增效率影響很大， 濃度過高可降低 PCR 擴增的特 異 性，濃度過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行 PCR 擴增采用的體積為 20ul 、30ul 、 50ul ?；?100ul ，應(yīng)用 多 大體積進行 PCR 擴增，是

21、根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定， 在做小體積如 20ul 后， 再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對 PCR 擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn) 假陰性 ;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與 模板的結(jié)合而降低 PCR 擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶 鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR 失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段 缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的 PCR 擴增條帶與目的

22、靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適： 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性， 因而在進行 PCR 擴增時， 擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新 設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染： 這種污染有兩種原因： 一是整個基因組或大片段的交叉污 染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決： 操作時應(yīng)小心輕柔， 防止將靶序列吸入加 樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外， 所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 所用 離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射， 以破壞存在的核酸。 二是空氣中

23、的小片段核酸污染， 這些小片段比靶序列短， 但有一定的同 源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出 PCR 產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式 PCR 方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR 擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致， 或大或小， 或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與 非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物 聚合形成二聚體。二是 Mg2+ 離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR 循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。 其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量 過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低

24、酶量或調(diào)換另一 來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫 度點法 （93 變性， 65左右退火與延伸 ）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR 擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差， dNTP 濃度過高， Mg2+ 濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減 少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少 dNTP 的濃度。適當(dāng)降低 Mg2+ 濃 度。增加模板量， 減少循環(huán)次數(shù)?？寺?PCR 產(chǎn)物1）克隆 PCR 產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。 1： 1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1

25、也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒 DNA,1Weiss 單位的T4 連接酶，插入片段共 10ul 。室溫保溫 1 小時，或 4過夜。在這 2 種溫度下，缺 T- 凸出 端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫 1 小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率， 需 4 過夜。2）PCR 產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶， 不需要用凝膠純化。 如可見其他雜帶， 可能是積累了大 量引物的二聚體。 少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高， 這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的 克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實

26、驗？A ）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul 質(zhì)粒 1:100 稀釋,1ul 用于100ul 感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。 用SOC 稀釋到 1000ul 后，用 100ul 鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生 1000 個菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù) /鋪板 DNA 的總量。鋪板 DNA 的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。 具體而言轉(zhuǎn)化用 10ng DNA ，用SOC 稀釋到 1000u 后含 10 ng DNA ，用 1/10 鋪板，共用 1 ng DNA 。轉(zhuǎn)化率為：100

27、0 克隆 X10 （3次方） ng /鋪板 1 ng DNA ug=10 （6次方） cfu/ ug轉(zhuǎn)化 pGEM-T 應(yīng)用 10（8 次方） cfu/ ug 感受態(tài)細胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。C）如用 pGEM-T 正對照，或 PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)生 >20-40 藍斑（用指定步驟 10 （8 次方） cfu/ ug 感受態(tài)細胞） ，表明載體失去 T。可能是連接酶污染了核酸酶。 T4 DNA 連接酶（ M1801 ， M1804 ， M1794 ）質(zhì)量標(biāo)準好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA 連接酶替換。D）用 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 載體

28、，連接 pGEM-T 正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞 （10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得 100 個菌落，其中 60%應(yīng)為白斑，如 產(chǎn)生 >20-40 藍斑 , 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。4）對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？A）連接用室溫保溫 1 小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4過夜。B）插入片段帶有污染， 使 3-T 缺失，或抑制連接， 抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和 pGEM-T 正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量 的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T 或 pGEM-T E

29、asy 載體 3-T 缺失。C ）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV 過度照射，時有發(fā)生。 UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接， DNA 必需重新純化。D ）帶有修復(fù)功能的耐熱 DNA 聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無 A，后者是 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 載體克隆所需。 加 Taq DNA 聚合酶和核苷酸可在末端加 A。詳情查 pGEM-T pGEM-T Easy 載體技術(shù)資料（ TM042 ）。E ）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn) 生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如 SURE 細胞PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準

30、的 PCR 反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液 10ul4種dNTP 混合物 各200umol/L引物 各 10 100pmol模板 DNA 0.1 2ugTaq DNA 聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加雙或三蒸水至 100ulPCR 反應(yīng)五要素： 參加 PCR 反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA 互 補的程度。理論上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈 做引物，利用 PCR 就可將模板 DNA 在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下

31、原則： 引物長度： 15-30bp ，常用為 20bp 左右。 引物擴增跨度： 以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴增長至 10kb 的片段。 引物堿基： G+C 含量以 40-60% 為宜， G+C 太少擴增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特 異條帶。 ATGC 最好隨機分布，避免 5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)， 避免兩條引物間互補， 特別是 3' 端的互補， 否則會形成引 物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物 3'端的堿基， 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基， 應(yīng)嚴格要求配對， 以避免因末端堿基 不配對而導(dǎo)致 PCR 失敗。 引物中

32、有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶 切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引 物的濃度 0.1 1umol 或 10 100pmol ，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好， 引物濃度偏 高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。酶及其濃度 目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶， 另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應(yīng)約需酶量 2.5U（ 指總反應(yīng)體積 為 100ul 時 ），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成

33、產(chǎn)物量減少。dNTP 的質(zhì)量與濃度 dNTP 的質(zhì)量與濃度和 PCR 擴增效率有密切關(guān)系， dNTP 粉呈顆粒 狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以 1M NaOH 或 1M Tris 。HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到 7.0 7.5 ，小量分裝， -20 冰凍保 存。多次凍融會使 dNTP 降解。在 PCR 反應(yīng)中， dNTP 應(yīng)為 50 200umol/L ，尤其是注意 4種dNTP 的濃度要相等 （ 等摩爾配制 ），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低） ，就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。 dNTP 能與

34、Mg2+ 結(jié)合，使游離 的 Mg2+ 濃度降低。模板 （靶基因 ）核酸 模板核酸的量與純化程度，是 PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一， 傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標(biāo)本。 SDS 的主要功能是： 溶解細胞 膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白， SDS 還能 與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA 結(jié)合的組蛋白，再用 有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份， 用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 提取的核酸即 可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病 原體， 消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離， 直接用于 PCR 擴增。 RNA 模板提取一般采 用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA 。Mg2+ 濃度 Mg2+ 對 PCR 擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時， Mg2+ 濃