植物生理指標檢測方法

1、植物組織中可溶性糖含量的測定在作為營養(yǎng)物質主要是指可溶性糖和淀粉。它們在營養(yǎng)中的作用主要有：合成纖維素組成細胞壁；轉化并組成其他有機物如核苷酸、核酸等；分解產(chǎn)物是其他許多有機物合成的原料，如糖在呼吸過程中形成的有機酸，可作為 NH 3 的受體而轉化為氨基酸；糖類作為呼吸基質，為作物的各種合成過程和各種生命活動提供了所需的能量。由于碳水化合物具有這些重要的作用，所以是營養(yǎng)中最基本的物質，也是需要量最多的一類。 蒽酮法測定可溶性糖一、原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的

2、定量測定。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因為反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應），所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應液中，不然會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺

3、，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與蒽酮反應生成的有色物質在可見光區(qū)的吸收峰為 620 nm ，故在此波長下進行比色。二、實驗材料、試劑與儀器設備（一）實驗材料任何植物鮮樣或干樣。（二）試劑1. 80 乙醇。2. 葡萄糖標準溶液（ 100 g/mL ）：準確稱取 100 mg 分析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至 100 mL ，使用時再稀釋 10 倍（ 100 g/mL ）。3 蒽酮試劑：稱取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 濃硫酸（將 98% 濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中） 1000 mL 中，冷卻至室溫

4、，貯于具塞棕色瓶內(nèi)，冰箱保存，可使用 2 3 周。（三） 儀器設備分光光度計，分析天平，離心管，離心機，恒溫水浴，試管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、 0.5 mL ），剪刀，瓷盤，玻棒，水浴鍋，電爐，漏斗，濾紙。三、實驗步驟1. 樣品中可溶性糖的提取 稱取剪碎混勻的新鮮樣品 0.5 1.0 g （或干樣粉末 5 100 mg ），放入大試管中，加入 15 mL 蒸餾水，在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷卻，過濾入 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水沖洗殘渣數(shù)次，定容至刻度。2. 標準曲線制作 取 6 支大試管，從 0 5 分別編號，按表 24-1 加入各試劑。表 24-1 蒽酮法測可溶性

5、糖制作標準曲線的試劑量試 劑管 號012345100 g/mL 葡萄糖溶液（ mL ）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ mL ）1.00.80.60.40.20蒽酮試劑（ mL ）5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量（ g ）020406080100將各管快速搖動混勻后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷卻，在 620 nm 波長下，用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標，含葡萄糖量（ g ）為橫坐標繪制標準曲線。3 樣品測定 取待測樣品提取液 1.0 mL 加蒽酮試劑 5 mL ，同以上操作顯色測定光密度。重復 3 次。四、結果計算溶性糖含量（）從標準曲線查得糖的量（g）&

6、#215;提取液體積（ml）×稀釋倍數(shù)/測定用樣品液的體積(ml)×樣品重量(g)×106×100式中： C 從標準曲線查得葡萄糖量， g 。V T 樣品提取液總體積 , mL 。V 1 顯色時取樣品液量， mL 。W 樣品重（ g ）。植物體內(nèi)可溶性蛋白質含量的測定植物體內(nèi)的可溶性蛋白質大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物體總代謝的一個重要指標。在研究每一種酶的作用時，常以比活（酶活力單位/mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測定植物體內(nèi)可溶性蛋白質是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有Lowry法和考馬斯亮藍G-250染料結合法。

7、本實驗將分別介紹這兩種方法。1考馬斯亮藍法一、 實驗原理考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質的疏水區(qū)結合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65 nm，后者在595 nm。在一定蛋白質濃度范圍內(nèi)（0-100 g/mL），蛋白質色素結合物在595 nm波長下的光吸收與蛋白質含量成正比。故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2 min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應非常靈敏，可測微克級蛋白質含量，所以是一種比較好的蛋白質定量法。二、 實驗材料、儀器和試劑1. 材料小

8、麥葉片或其他植物組織2. 儀器設備分光光度計，離心機，研缽，25 mL容量瓶1個，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL試管3支。3. 試劑(1) 牛血清白蛋白 配成1000 g/mL和100 g/mL。(2) 考馬斯亮藍G-250：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容至1000 mL。此溶液在常溫下可放置一個月。(3) 90%乙醇(4) 磷酸（85%，W/V）三、 實驗步驟：1. 可溶性蛋白的提取稱取新鮮植物葉片0.5 g置于研缽中，加入5 mL 4oC下預冷的濃度為50 mmol/L，pH

9、7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉入10 mL離心管中，在4 oC冰箱中靜置10 min，于15000 rpm/min下冷凍離心25 min，上清液即為過氧化物粗提液。4 oC下保存?zhèn)溆谩?. 標準曲線的繪制(1) 0-100 g/mL標準曲線的制作取6支試管，按下表數(shù)據(jù)配制0-100 g/mL血清白蛋白液各1 mL。準確吸取所配各管溶液0.1 mL，分別放入10 mL具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，反轉混合數(shù)次，放置2 min后，在595 nm下比色，繪制標準曲線。配制0-100 g/mL血清白蛋白液管 號123456100 g/mL牛血清蛋白量(mL)蒸餾

10、水量(mL)蛋白質含量(mg)01.000.20.80.020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.000.10(2) 0-1000 g/mL標準曲線的制作另取6支試管，按表10-2數(shù)據(jù)配制0-1000 g/mL牛血清白蛋白溶液各1 mL。與步驟（1）操作相同，繪出0-1000 g/mL的標準曲線。配制0-1000 g/mL血清蛋白血液管 號7891011121000 g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸餾水量(mL)蛋白質含量(mg)01.000.20.80.20.40.60.40.60.40.60.80.20.81.001.03. 樣品提取液中蛋白質濃度的測定 吸取樣品提

11、取液0.1 mL（樣品提取見各酶活測定），放入具塞刻度試管中（設兩個重復管），加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2min后在595 nm下比色，記錄吸光度值，通過標準曲線查得蛋白質含量。四、 結果計算與分析樣品蛋白質含量（mg/g鮮重）=式中 C查標準曲線所得每管蛋白質含量（mg）；V提取液總體積（mL）；a測定所取提取液體積（mL）；W取樣量（g）。葉綠素測定方法1、 稱取剪碎葉片0.2g，放入容量瓶。2、 加50ml 95%的乙醇。3、 遮光浸提48-72小時，中間搖晃一次。（保證各批次浸提時間一致）4、 分光光度計測吸光值，三波長（649，665，470），分別對應葉綠

12、素a、b和其他?？瞻诪?5%乙醇。計算公式如下：CA=13.95*D665-6.88*D649C 單位：mg/L葉綠素a=CA*0.05/2葉綠素單位：mg/gCB=24.96*D649-7.32*D665葉綠素b=CB*0.05/2C其他=(1000*D470-2.05*CA-114.8CB)/245葉綠素其他=C其他*0.05/2總葉綠素含量為三者之和。一般葉綠素a/b為3：1至4：1選擇的波長不一樣，計算公式就不一樣，網(wǎng)上也有其他的波長方法，計算公式里的系數(shù)響應也有差異。淀粉含量的測定原理淀粉是由葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其水解成葡萄糖，測定葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖含量換算成

13、淀粉含量(C6H12O6 )n ( C6H10O5) n + nH2O糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再與蒽酮作用形成綠色絡合物，顏色的深淺與糖含量有關。在 625 nm 波長下的OD值與糖含量成正比。由于蒽酮試劑與糖反應的呈色強度隨時間變化，故必須在反應后立即在同一時間內(nèi)比色儀器用具和試劑1. 儀器用具：移液槍、10ml離心管、試管、50ml容量瓶、試管架、棕色瓶（>=500ml）、螺口瓶（>=500ml）、燒杯、移液管（連續(xù)加樣器）、離心機、分光光度計；2. 試 劑： 葡萄糖標準液：精確稱取0.1000g蔗糖（分析純），于小燒杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴濃H2S04，

14、該溶液可長期保存；葡萄糖標準液:準確吸取1mg/ml的蔗糖標準液5ml，加水定容量50ml，得到濃度為0.1mg/ml蔗糖標準液；蒽酮溶液：100mg蒽酮溶于50ml濃H2S04（化學純）中，避光保存，當天配制當天使用；3mol/L NaOH溶液：12g氫氧化鈉溶于100ml蒸餾水；3mol/L Hcl溶液：25ml濃鹽酸與75ml蒸餾水混勻。測定方法1. 植物淀粉相關溶液的提?。合驕y可溶性糖所剩殘渣中加入7ml 3mol/L的鹽酸，在沸水浴中煮沸45分鐘，取出冷卻，4000轉/分離心15分鐘，取上清到50ml容量瓶中，加入7ml 3mol/L NaOH，用蒸餾水定容到50ml，作為待測樣品。

15、2. 標準曲線的配制：吸取0.1mg/ml葡萄糖標準液按下表加入至11支試管：0123456789100.1mg/ml 葡糖(ml)00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0蒸 餾 水(ml)20.90.80.70.60.50.40.30.20.10葡糖濃度（mg/ml）00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1蒽酮試劑(ml)8.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.045水浴中顯色1015分鐘，625 nm 處測OD值3. 準確吸取待測液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45水浴中顯色10-15分鐘，各管在加入蒽

16、酮試劑時要迅速，加完后用力振蕩混勻。4. 取出后避光冷卻，在 625 nm處測OD值，從標準曲線上得到提取液中可溶性總糖含量。結果計算葡萄糖糖含量（%）=標準曲線對應含糖量×定容體積×100（樣品質量×顯色吸取液體積×103）粗淀粉含量（%）=葡萄糖含量×0.9強酸溶液，注意安全超氧化物歧化酶(SOD)的測定一、 實驗原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用來確定酶活性大小。在氧

17、化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧自由基O2·，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560 nm處有最大吸收。而SOD可清除O2·，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性的大小。二、 實驗材料、儀器和試劑：1. 材料小麥葉片或其他植物組織2. 儀器設備高速離心機；分光分度計；微量進樣器；熒光燈(反應試管處理度為4000 Lx)；試管或指形管數(shù)支。3. 試劑(1) 1.50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)。(2) 2.130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶

18、液：稱1.9399 g Met用磷酸緩沖液定容至100 mL。(3) 3.750 mol/L氮藍四唑(NBT)溶液：稱取0.06133 g NBT用磷酸緩沖液定容至100 mL，避光保存。(4) 4. 100 mol/L EDTA-Na2溶液：稱取0.03721 g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至 1000 mL。(5) 5. 20 mol/L核黃素溶液：稱取0.0753 g核黃素用蒸餾水定容至1000 mL避光存。三、 實驗步驟：1. 顯色反應取5 mL指形管數(shù)支，測定管數(shù)目依據(jù)處理而定，另4支為對照管，按表2依次加入下列各溶液對照管用緩沖液代替酶液，蒸餾水0.25 mL。將其中2支對照

19、管置于暗處，其它置于4000 Lx日光下反應20 min左右，主要看顏色的變化，全部變成灰色，對照可能較淺。2. 測定待反應結束，以不照光的對照管做空白，依次測定其它各管的吸光值。表2 各溶液顯色反應用量 試 劑(酶) 用量(mL) 終濃度(比色時) 0.05 mol/L磷酸緩沖液 1.5 130 mmol/L Met溶液 0.3 13 mmol/L 750 mol/L NBT溶液 0.375 mol/L 100 mol/L EDTA Na2液 0.3 10 mol/L 20 mol/L核黃素 0.3 2.0 mol/L 酶 液 /緩沖液（對照）0.1 對照管以緩沖液代替酶液 蒸餾水 0.2

20、總 體 積 3.0 四、 結果計算與分析已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。 SOD總活性SOD比活力式中：SOD總活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。Ack 照光對照管的吸光度。AE 樣品管的吸光度。VT 樣品液總體積，mL。Vt 測定時樣品用量，mL。W 樣品鮮重，g。 蛋白質含量單位為mg/g。 五、 注意事項1. 配好的Met溶液須在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止Met活性損失。2. 配好的NBT溶液須放入棕色試劑瓶，并在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止NBT見光分解。3. 配好的核黃素溶液須放入棕色試劑瓶避光保存。六、

21、思考題1. 在 SOD 測定中為什么設照光和暗中兩個對照管 ? 2. 影響本實驗準確性的因素是什么 ? 應如何克服 ?實驗六 植物抗氧化酶活性的測定酶液的提取稱取新鮮植物葉片0.5 g置于研缽中，加入5 mL 4oC下預冷的濃度為50 mmol/L，pH 7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉入10 mL離心管中，在4 oC冰箱中靜置10 min，于15000 rpm/min下冷凍離心25 min，上清液即為過氧化物粗提液。4 oC下保存?zhèn)溆谩?過氧化氫酶(CAT)的活性測定 植物在逆境下或衰老時，由于體內(nèi)活性氧代謝加強而導致H2O2累積。H2O2可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)的核酸、蛋白質

22、等生物大分子，并使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以清除植物體內(nèi)的H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中過氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關。 一、 實驗原理H2O2在240 nm波長下有強吸收，過氧化氫酶(Catalase, CAT, EC 1.11.1.6)能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。 二、 實驗材料、儀器和試劑1. 材料小麥葉片或其他植物組織2. 儀器設備紫外分光光度計，離心機，研缽，25 mL容量瓶1個，刻度吸管0.5 mL 2支，2 mL 1支，10 mL試

23、管3支，恒溫水浴鍋。3. 試劑(1) 0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液(內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮)。(2) 0.1 mol/L H2O2 (用0.1 mol/L高錳酸鉀標定)。 三、 實驗步驟： 取10 mL試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管(將酶液煮死)，按表1順序加入試劑。 表1 紫外吸收待測樣品測定液配制表 試 劑(酶) 管 號 S0S1S2粗酶液(mL) 0.20.20.2pH 7.8磷酸緩沖液(mL) 1.51.51.5蒸餾水(mL) 1.01.01.025 oC預熱后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L的 H2O2，每加完1管立即計時，并迅速倒入石英比色杯中，

24、240 nm下測定吸光度，每隔l min讀數(shù)1次，共測4 min，待3支管全部測定完后，計算酶活性。 四、 結果計算與分析以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(µ)。過氧化氫酶活性式中： A240 AS0 (AS1+AS2)/2。 AS0 加入煮死酶液的對照管吸光度。 AS1、AS2 樣品管吸光度。 Vt 粗酶提取液總體積(mL)。 V1 測定用粗酶液體積(mL)。 FW 樣品鮮重(g)。 0.1 A240 每下降 0.1為 1 個酶活單位(µ)。 t 加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間(min)。 注意：凡在 240 nm下有強吸收的物質對本實驗有干擾。五、 注意

25、事項1. 試劑中的H2O2的濃度對測定結果影響較大，要注意標定的準確性。2. 緩沖液中必須加PVP，以防止酶活性降低。六、 思考題1. 影響過氧化氫酶活性測定的因素有哪些？2. 超氧化物歧化酶(SOD)的測定七、 實驗原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC 1.15.1.1)普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用來確定酶活性大小。在氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧自由基O2·，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560 nm處有

26、最大吸收。而SOD可清除O2·，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性的大小。八、 實驗材料、儀器和試劑：1. 材料小麥葉片或其他植物組織2. 儀器設備高速離心機；分光分度計；微量進樣器；熒光燈(反應試管處理度為4000 Lx)；試管或指形管數(shù)支。3. 試劑(6) 1.50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)。(7) 2.130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：稱1.9399 g Met用磷酸緩沖液定容至100 mL。(8) 3.750 mol/L氮藍四唑(NBT)溶液：稱取0.06133 g NBT用磷酸

27、緩沖液定容至100 mL，避光保存。(9) 4. 100 mol/L EDTA-Na2溶液：稱取0.03721 g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至 1000 mL。(10) 5. 20 mol/L核黃素溶液：稱取0.0753 g核黃素用蒸餾水定容至1000 mL避光存。九、 實驗步驟：3. 顯色反應取5 mL指形管數(shù)支，測定管數(shù)目依據(jù)處理而定，另4支為對照管，按表2依次加入下列各溶液對照管用緩沖液代替酶液，蒸餾水0.25 mL。將其中2支對照管置于暗處，其它置于4000 Lx日光下反應20 min左右，主要看顏色的變化，全部變成灰色，對照可能較淺。4. 測定待反應結束，以不照光的對照管做空

28、白，依次測定其它各管的吸光值。表2 各溶液顯色反應用量 試 劑(酶) 用量(mL) 終濃度(比色時) 0.05 mol/L磷酸緩沖液 3 130 mmol/L Met溶液 0.6 13 mmol/L 750 mol/L NBT溶液 0.675 mol/L 100 mol/L EDTA Na2液 0.6 10 mol/L 20 mol/L核黃素 0.6 2.0 mol/L 酶 液 0.1 對照管以緩沖液代替酶液 蒸餾水 0.5 總 體 積 6.0 十、 結果計算與分析已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。 SOD總活性SOD比活力式中：SOD總

29、活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。Ack 照光對照管的吸光度。AE 樣品管的吸光度。VT 樣品液總體積，mL。Vt 測定時樣品用量，mL。W 樣品鮮重，g。 蛋白質含量單位為mg/g。 十一、 注意事項4. 配好的Met溶液須在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止Met活性損失。5. 配好的NBT溶液須放入棕色試劑瓶，并在4冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止NBT見光分解。6. 配好的核黃素溶液須放入棕色試劑瓶避光保存。十二、 思考題3. 在 SOD 測定中為什么設照光和暗中兩個對照管 ? 4. 影響本實驗準確性的因素是什么 ? 應如何克服 ?3過氧化物酶(POD)活性的測定一、 實驗原理過

30、氧化物酶(peroxidases, POD, EC 1.11.1.7)是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等有密切關系，當植物受到環(huán)境脅迫時，酶活性就會發(fā)生變化。在過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質在470 nm處有最大吸收，可用分光光度計測量470 nm的吸光度變化，測定過氧化物酶活性。二、 實驗材料、儀器和試劑1. 材料小麥葉片或其他植物組織2. 儀器設備分光光度計，研缽，100 mL容量瓶，吸管，離心機。3. 試劑(1) 50 mmol/L磷酸緩沖液pH 7.0。(2) 過氧化氫：取30%的過氧化氫613 L用蒸餾水

31、定容至50 mL，備用。(3) 含愈創(chuàng)木酚的混合液：取60.3 L愈創(chuàng)木酚溶于50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)的燒杯中，置于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，用磷酸緩沖液pH 7.0定容至200 mL，保存于冰箱中，備用。三、 實驗步驟取光徑1 cm 比色杯2只，于1只中加入水或磷酸緩沖液(pH 7.0) 50 l，反應混合液2.9 mL和過氧化氫60 L，作為對照，另1只中加入酶液50 L(如酶活性過高可稀釋之)，反應混合液2.9 mL和過氧化氫60 L，立即開啟秒表記錄時間，于分光光度計上測量波長470 nm下吸光度值，每隔1min讀數(shù)一次。 四、 結果計算

32、與分析以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A 470/min·g(FW) 表示之。也可以用每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(u)表示。 過氧化物酶活性式中： A470 反應時間內(nèi)吸光度的變化。W 植物鮮重，g。 VT 提取酶液總體積，mL。 Vs 測定時取用酶液體積， mL。 t 反應時間，min。 五、 注意事項1. 愈創(chuàng)木酚的含量會影響測定結果，在配制愈創(chuàng)木酚溶液時，必須準確量取。2. H2O2須準確配制六、 思考題1. 在POD測定的過程中不設置對照對實驗結果有無影響？為什么？淀粉酶活力的測定方法淀粉酶主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它

33、們廣泛存在于動物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質有所不同。植物中最重要的淀粉酶是 -淀粉酶和-淀粉酶。 -淀粉酶隨機作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分 -1,4糖苷鍵，單獨使用時最終生成寡聚葡萄糖、-極限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH 3.6 以下可使其鈍化。 -淀粉酶從非還原端作用于-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的 -1,6鍵時停止。單獨作用時產(chǎn)物為麥芽糖和-極限糊精。-淀粉酶是一種巰基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl 等輔助因子，最適pH偏酸，與 -淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，60 保溫15min可使其鈍化。通常提取液中 -淀粉酶和-淀

34、粉酶同時存在?？梢韵葴y定（ + ）淀粉酶總活力，然后在60 加熱 15 min ，鈍化-淀粉酶，測出 -淀粉酶活力，用總活力減去 - 淀粉酶活力，就可求出 - 淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸的顯色反應來測定。還原糖作用于黃色的 3,5- 二硝基水楊酸生成棕紅色的 3- 氨基 -5- 硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。以每克樣品在一定時間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。1 酶活測定方法（1）標準曲線的制作(見下表)取7支20 ml具塞刻度試管,預先潔凈滅菌干燥,編號,按表加入試劑。搖勻,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷

35、卻,加蒸餾水定容至20 ml,以1號管作為空白調(diào)零點,在520 nm的波長下比色測定吸光度值。并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1 標準麥芽糖溶液成分表及OD測定值試劑1234567麥芽糖標準液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麥芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力測定待測粗酶液的制備：發(fā)酵24 h后發(fā)酵液4000 r/ min離心10 min,去除菌體，在上清液中加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶

36、解后于4鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。按以下順序操作：取預先潔凈滅菌干燥試管,編號。取粗酶液1 ml于各只試管中，各只試管分別加入3ml蒸餾水，于60水浴中預熱5min，各加1ml 2%的淀粉溶液檸檬酸淀粉緩沖液同時在40水中預熱5min，取檸檬酸淀粉緩沖液1ml加入試管中,于40水浴中保溫30min加入1.5 ml 3,5-二硝基水楊酸,沸水中5 min,加入氫氧化鈉溶液終止反應,加蒸餾水至20 ml。搖勻,用分光光度計測定OD520 nm值。在上述條件下以單位體積樣品在30 min釋放1 mg麥芽糖所需的酶量為一個麥芽糖單位表示酶活性。在標準曲線上查

37、出相應的麥芽糖含量按下列公式計算酶活力酶活力測定公式： 淀粉酶活力=麥芽糖含量（mg）·淀粉酶原液總體積（mL）/所加淀粉質量每個樣品按下表所示步驟操作，在反應過程中，從加入底物開始，向每支管中加入試劑的時間間隔要絕對一致：表2樣品酶活力測定步驟反應順序樣品（重復3個）樣品空白標準空白樣品稀釋液（ml）110蒸餾水00160預熱5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60保溫30min依次加入DNS試劑（ml）1.51.51.5混合100煮沸5min加入0.4mol/L NaOH溶液終止反應加入蒸餾水至總體積（ml）202020反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)

38、混濁需在離心機上以4,000rpm離心10min，上清液以標準空白調(diào)零，在分光光度計520nm波長處測定樣品空白（A0）和樣品溶液（A）的吸光值，AA0為實測吸光值。用直線回歸方程計算樣品淀粉酶的活性。2 活性計算酶活力單位定義：在60、PH5.6條件下，每小時從2的可溶性淀粉溶液中釋放出1mg爾麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）淀粉酶活性U按下式計算： K×（AA0） S×（30÷60）×180 U = ×F其中：U樣品淀粉酶活性，U/ml； K標準曲線斜率；F樣品溶液反應前的總量，ml；S樣品測試量；表1中S1ml；601小時為60mi

39、n；30反應時間，min。試劑 (1)2% 淀粉溶液 (2) 0.4mol/L 氫氧化鈉 (3) pH5.6 檸檬酸緩沖液 稱取檸檬酸 20.01g ，溶解后定容至 1000mL ，為 A 液。稱取檸檬酸鈉 29.41g ，溶解后定容至 1000mL ，為 B 液。取 A 液 13.7mL 與 B 液 26.3mL 混勻，即為 pH5.6 之緩沖液。 (4) 精確稱取 1g3,5- 二硝基水楊酸溶于 20mL 1mol/L 氫氧化鈉中，加入 50mL 蒸餾水，再加入 30g 酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至 100Ml ，蓋緊瓶塞，防止 CO 2 進入。 植物組織游離脯氨酸含量的測定原理：植

40、物在逆境條件下，游離脯氨酸便會大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標。采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)(干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其消光度成正比。材料、儀器設備及試劑 1材料：植物葉片2儀器設備：分光光度計；水浴鍋：漏斗：大試管(20m1)；具塞刻度試管(20m1) 注射器或滴管(5lOml)。 3試劑：(1)3磺基水楊酸溶液(2)甲苯；(3)2.5酸性茚三

41、酮顯色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合，作為溶劑進行配制，此液在4下23天有效(4)脯氨酸標準溶液：準確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸餾水稀釋至lOOml，即成10gmL-1的脯氨酸標準液。1標準曲線制作（1）取7支具塞刻度試管按表9.2-1加入各試劑?；靹蚝蠹硬Ａ蛉?，在沸水中加熱40min。(2)取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管勻對照在波長520nm下比色。（3）以消光值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程921各試管中試劑加入量

42、試管 0 1 2 3 4 5 6脯氨酸標準溶液(m1) 0 02 04 08 12 16 20 水(m1) 2 18 16 12 08 04 0 冰乙酸(m1) 2 2 2 2 2 2 2茚三酮顯色液(m1) 3 3 3 3 3 3 3樣品測定 （1）脯氨酸提取：取不同處理的剪碎混勻植物葉片0205g(干樣根據(jù)水分含量酌減)，分別置于大試管中，加入5m1 3磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。  (2)取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1顯色液，于沸水浴中加熱40min，下步操作按標準曲線制做方法進行甲苯萃取和比

43、色（向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管勻對照在波長520nm下比色）。  (3)結果計算：從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度 脯氨酸含量的百分數(shù)。     脯氨酸g.g-1(干或鮮重)(CV)·(a·W)1        式中：C一提取液中脯氨酸濃度(PS)，由標準曲線求得：        

44、60;  V  提取液總體積（ml）           A -  測定時所吸取得體積（ml）           W- 樣品重（g）實驗一 植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）一、 實驗目的學習植物激素的ELISA測定原理，掌握激素測定技術和樣品提取方法。二、 實驗原理免疫測定的方法是利用抗

45、原、抗體特異性反應而建立的，根據(jù)可視化方法的不同可分為：酶聯(lián)免疫、放射免疫、熒光免疫、化學發(fā)光免疫測定、生物發(fā)光免疫測定、濁度免疫測定法等。由于酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 簡稱ELISA）具有靈敏性高且快速、簡便、成本低廉、無放射性污染等特點，而日益被廣泛應用于植物激素測定。目前，幾大類植物激素IAA、ABA、GA3、GA4、iPA、ZR和DHZR等都建立了相應的ELISA方法并有試劑盒出售。ELISA是建立在兩個重要的生物化學反應基礎之上的，即抗原和抗體反應的高度專一性和敏感性；酶的高效催化特性。ELISA把這而這有機地結合在一

46、起，即被分析物先與其相應的抗體或抗原反應，然后再檢測抗體或抗原上酶標記物的活性，從而達到定性或定量測定的目的。ELISA根據(jù)均相、非均相以及競爭與非競爭可分為非競爭固相免疫測定、非競爭均相免疫測定、競爭均相、競爭固相測定。常用的免疫測定均為非競爭固相和競爭固相免疫測定統(tǒng)稱為酶聯(lián)免疫吸附測定。所用的吸附載體為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶聯(lián)板以及硝酸纖維素膜（dot-ELISA）等。目前植物激素的酶聯(lián)免疫檢測方法有三種形式（見下圖）：直接法，間接法和簡化的間接法。直接法是在固相載體上直接包被抗體（或先包被二抗，再加一抗。此為直接包被抗體的一種變通形式），利用游離抗原和酶標抗原與吸附的抗體進行競爭。A

47、b+H+HE=AbH+AbHE其中Ab表示抗體，H表示游離激素，HE表示酶標抗原。根據(jù)質量作用定律，當該反應體系中Ab及HE的量確定時，游離H越多， AbH形成的就越多，而AbHE形成的就越少，即結合在板上的酶標抗原就越少；反之游離H越少， AbH形成的就越少，而AbHE形成的就越多，即結合在板上的酶標抗原就越多。通過檢測酶的活性，就可以確定游離H量的多少。間接法和簡化的間接法是包被抗原（間接法）。利用游離抗原和吸附抗原與游離抗體進行競爭。間接法是競爭后，再加入二抗標記的酶，而簡化的間接法是在競爭的同時就加入二抗標記的酶。Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗體，H表示游離激素，HP表

48、示吸附在板上的激素蛋白質復合物。根據(jù)質量作用定律，當該反應體系中Ab及HP的量確定時，游離H越多，AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即結合在板上的抗體就越少；游離H越少，AbH形成的就越少，而AbHP形成的就越多，即結合在板上的抗體就越多。而板上的抗體可以與二抗標記的酶結合，檢測酶的活性，就可以確定游離H量的多少。 間接法 直接法 簡化間接法三、 實驗材料、儀器和試劑1. 材料新鮮植物材料2. 儀器設備研缽，冷凍離心機，氮氣吹干裝置，酶聯(lián)免疫檢測儀，吸水紙，恒溫箱，冰箱，96孔酶標板，可調(diào)微量液體加樣器（10 L，40 L，200 L，1000 L），帶蓋瓷盤（內(nèi)鋪濕紗布）。3. 試

49、劑(1) 包被緩沖液：稱取1.5 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.2 g NaN3（可不加）, 用量筒加1000 mL蒸餾水，pH為9.6。(2) 磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 2.96 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1000 mL蒸餾水，pH為7.5。(3) 樣品稀釋液：500 mL PBS中加0.1 mL Tween-20，0.5 g明膠（稍加熱溶解）。(4) 底物緩沖液：稱取5.10 g C6H8O7·H2O（檸檬酸）， 18.43 g Na2HPO4·12H2O，用量筒加10

50、00 mL蒸餾水溶解，再加1 mL Tween-20，pH為5.0。(5) 洗滌液：1000 mL PBS加1 mL Tween-20。(6) 終止液：2 mol/L 硫酸。(7) 提取液：80甲醇，內(nèi)含1 mmol/L BHT(二叔丁基對甲苯酚為抗氧化劑，先用100%甲醇溶解BHT，再配成80%的濃度。否則BHT 難溶解)。(8) 各激素包被抗原、各激素抗體、激素標準物和辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（間接和簡化間接酶免疫測定用試劑）。各激素抗體、激素標準物和各激素酶標物（直接酶免疫測定用試劑）。四、 實驗步驟1. 樣品中激素的提取(1) 稱取0.5-1.0 g新鮮植物材料（若取樣后材料

51、不能馬上測定，用液氮速凍后保存在-20的低溫冰箱中），加2 mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉入10 mL試管，再用2 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉入試管中，搖勻后放置在4冰箱中。(2) 4下提取4 h，1000 g離心15 min(實驗中離心機型號LDZ5-2，約4000 rpm), 取上清液。沉淀中加1 mL提取液，攪勻，置4下再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積，殘渣棄去。(3) 上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是： 80%甲醇（1 mL）平衡柱上樣收集樣品移開樣品后用100%甲醇（5 mL）洗柱100%乙醚（5 mL）洗柱100%甲醇（5 mL）洗柱循環(huán)。(4) 將

52、過柱后的樣品轉入5 mL塑料離心管中，真空濃縮干燥或用氮氣吹干，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容（一般0.5 g鮮重用1.5-3.0 mL左右樣品稀釋液定容）。2. 樣品測定(1) 包被：在10 mL包被緩沖液中加入一定量的包被抗原（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標簽），混勻，在酶標板每小孔中加100 L。然后將酶標板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內(nèi)，置于37下3 h。(2) 洗板：將包被好的板取出，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液，將下口瓶內(nèi)的洗滌液通過乳膠管均勻加入板上，使每孔充滿洗滌液，放置約0.5 min,再甩掉洗滌液。重復3次，將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。(3) 競爭：即加標準物、待測樣和抗體

53、。a) 加標樣及待測樣：取樣品稀釋液0.98 mL，內(nèi)加20 L激素的標樣試劑（100 g/mL）,即為2000 ng/mL標準液，然后再依次稀釋1000 ng/mL, 500 ng/mL,250 ng/mL,125 ng/mL,62.5 ng/mL，31.25 ng/mL，15.625 ng/mL，0 ng/mL。將系列標準樣加入96孔酶標板的前三行，每個濃度加3孔，每孔50 L，其余孔加待測樣，每個樣品重復三孔，每孔50 L。b) 加抗體：在5 mL樣品稀釋液中加入一定量的抗體（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標簽）,混勻后每孔加50 L，然后將酶標板加入濕盒內(nèi)開始競爭。c) 競爭條件37左右0.5

54、h。(4) 洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意第一次加入洗滌液后要立即甩掉。然后再接著加第二次。目的是防止各孔的相互干擾。(5) 加二抗：將一定量的酶標二抗，加入10 mL樣品稀釋液中（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標簽），混勻后，在酶標板每孔加100 L，然后將其放入濕盒內(nèi)，置37下，溫育0.5 h。(6) 洗板：方法同競爭之后的洗板（步驟4），洗五次，(7) 加底物顯色：稱取10-20 mg鄰苯二胺（OPD）溶于10 mL底物緩沖液中（小心勿用手接觸OPD），完全溶解后加2-4 L 30% H202?；靹?，在每孔中加100 L（在暗處操作），然后放入濕盒內(nèi)，當顯色適當后（即0 ng/mL孔與2000 ng/mL孔的OD差值約為1.0左右時），每孔加入50 L 2 mol/L硫酸終止反應。(8) 比色：在酶聯(lián)免疫分光光度計上依次測定標準物各濃度和各樣品492 nm處的OD值。五、 結果計算與分析1. 標準曲線用于ELISA結果計算最方便的是logit曲線。曲線的橫坐標用激素標樣各濃度（ng/mL ）的自然對數(shù)表示，縱坐標用各濃度顯色值的logit值表示。Logit值的計算方法如下： B/B0 B Logit（B/B0）=ln =ln 1-B/B0 B0-B 其中B0是0 ng/mL孔的顯色