62-EB病毒(EBV)核酸檢測(cè)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)操作技巧規(guī)章(熒光PCR法)

1、EB病毒（EBV ）核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（熒光PCR法）1. 目的規(guī)范EB病毒核酸DNA （熒光PCR法）檢測(cè)操作流程，準(zhǔn)確進(jìn)行EB病毒DNA分析。2. 應(yīng)用范圍使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司 EB病毒核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）和MX3000P熒光定量PCR儀、Roche480熒光定量PCR儀進(jìn)行EB病毒DNA檢測(cè)。3. 職責(zé)由PCR實(shí)驗(yàn)室制定程序文件，專業(yè)技術(shù)人員負(fù)責(zé)執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)室主管負(fù)責(zé)監(jiān)督實(shí)施。4. 內(nèi)容4.1實(shí)驗(yàn)原理及其臨床應(yīng)用本試劑盒用一對(duì)EB病毒（EBV）特異性引物和一條EB病毒（EBV）特異性熒光探針，配 以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、核

2、苷酸單體（dNTPs ）等成分，用PCR體外擴(kuò)增 法檢測(cè)EB病毒（EBV） DNA。用于人血中EB病毒DNA的測(cè)定，為臨床提供參考，4.2標(biāo)本采集4.2.1使用標(biāo)本類型：全血。4.2.2標(biāo)本采集；由合作單位按照以下要求進(jìn)行采集。4.2.2.1全血：用一次性無(wú)菌注射器抽取受檢者靜脈血 2毫升，注入EDTA（乙二胺四乙酸二鈉） 或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合 5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混 勻，密閉送檢。4.2.3標(biāo)本保存和運(yùn)送：標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可以保存于 -20 C待測(cè)，保存期為6個(gè)月。 標(biāo)本運(yùn)送采用0 °C冰壺。4.3試劑準(zhǔn)備431供應(yīng)商：中山大學(xué)達(dá)安基因

3、股份有限公司432此實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)放在冰箱-20 C保存，在實(shí)驗(yàn)前5分鐘取出備用，實(shí)驗(yàn)后應(yīng)立即放回冰箱-20 C。433如果試劑出現(xiàn)了封口蠟破損導(dǎo)致液體外漏以及過(guò)期試劑，應(yīng)及時(shí)更換。4.4質(zhì)控品4.4.1質(zhì)控品來(lái)源：隨試劑盒，由廠家提供。4.4.2質(zhì)控品保存條件：置于-20 C冰箱中保存。4.4.3質(zhì)控頻度：每次實(shí)驗(yàn)均需做質(zhì)控。4.5操作過(guò)程說(shuō)明4.5.1 DNA 提取4.5.1.1質(zhì)控品處理：取出陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品。8000rpm離心數(shù)秒，吸50ul至0.5ml滅菌離心管中，加入50U1DNA提取液充分混勻，100 C恒 溫處理10 ±1分鐘；12000 rpm

4、離心5分鐘，備用。4.5.1.2樣本處理4.5.1.2.1取全血500ul至干燥玻璃試管中，加入生理鹽水 500ul輕搖混勻；4.5.1.2.2取干燥玻璃試管加入1ml淋巴細(xì)胞分離液；4.5.1.2.3將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細(xì)胞分離液的試管中（注意沿著管壁, 速度要慢）;4.5.1.2.4 2000rpm 離心20分鐘（建議用水平離心機(jī)）；4.5.1.2.5吸取白細(xì)胞層（從上往下第二層），加入1.5ml離心管，12000rpm離心5分鐘；4.5.1.2.6去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混勻，100 C恒溫處理10 ±1分鐘；12000rpm 離心5分鐘，上

5、清備用4.521加樣：取PCR反應(yīng)管若干，加入處理后的樣品（標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界或強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品）上清液5ul,8000rpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽4.5.3 PCR 擴(kuò)增將準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管放置于PCR儀上，編輯樣本信息并按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：37 °C -2min ; 94 °C -2min ; （94 °C -15ses ; 55 °C -45ses ）X40 cyclics ;EBV檢測(cè)熒光素：FAM;反應(yīng)體系：50ul ;熒光信號(hào)收集：55 C -45ses，末端收集。4.5.3Mx3000P熒光定量PCR儀的設(shè)置及結(jié)果分析4.5.3

6、.1打開(kāi)計(jì)算機(jī)電源。4.5.3.2將Mx3000P電源開(kāi)關(guān)打開(kāi)，在大約1分鐘的時(shí)間內(nèi)，儀器將會(huì)自檢并且能聽(tīng)到濾鏡 輪轉(zhuǎn)動(dòng)的聲音。打開(kāi)電腦上的MX3000P軟件，確定軟件界面右下面的聯(lián)機(jī)標(biāo)志呈 現(xiàn)綠色。如果不是綠色而是紅色，軟件會(huì)提示用血M龐PC亡仙血咲也圮伽岀，這時(shí)只需要繼續(xù)稍等片刻，待儀器自檢完成, 會(huì)自動(dòng)連接計(jì)算機(jī)。4.5.3.3在軟件的彈出框中選擇您要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)類型,項(xiàng)“ Qua ntitive PCR(Multiple Sta ndards)” 進(jìn)行絕對(duì)定量分析。4.5.3.4確定鹵鎢燈已經(jīng)打開(kāi)。（綠色）則說(shuō)明鹵鎢燈已經(jīng)打開(kāi)；創(chuàng)（黃色）則說(shuō)明鹵鎢燈正在預(yù)熱（紅色）則說(shuō)明鹵鎢燈沒(méi)有被打開(kāi)

7、，這時(shí)需要用鼠標(biāo)點(diǎn)擊這個(gè)標(biāo)志將光源打開(kāi)。在鹵鎢燈已經(jīng)被打開(kāi)的情況下，軟件界面右下方會(huì)顯示（綠色）4.535最好在儀器與光源預(yù)熱20分鐘后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。4.536 在- 里，對(duì)所選孔進(jìn)行設(shè)定，在Well type 中設(shè)定Standard（標(biāo)準(zhǔn) 品）、NTC （陰性對(duì)照）、unkown （樣品）等，并選擇正確的熒光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），參比熒光（Referenee dye ）選None。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品,在Well type中設(shè)定為“ Standard ”后，再設(shè)定其模板濃度。方法為：點(diǎn)擊S tandard qudntit/:FAM4.00&+00710倍的濃度梯度可以直接點(diǎn)擊

8、、"小 ，在下拉菜單中選擇不同的系數(shù)關(guān)系后， 依次點(diǎn)擊設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)品的另外幾個(gè)孔，濃度將實(shí)時(shí)顯示。也可以直接點(diǎn)擊標(biāo)準(zhǔn)品的各個(gè)孔位，在StandaM中狽瞅曲 7畑一欄，手工輸入濃度。若要對(duì)不同的樣品進(jìn)行編號(hào)則雙擊所選孔，在name框中輸入樣品號(hào)，點(diǎn)擊Show Well Names就能顯示樣品編號(hào)或者點(diǎn)擊版面右上方的,01'，導(dǎo)入以前使用的96孔板設(shè)定。4.537點(diǎn)擊山小*，進(jìn)行PCR循環(huán)的設(shè)定，可以直接點(diǎn)擊溫度、oi：jg時(shí)間;國(guó)日改變各項(xiàng)溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。在選定大步驟之后添加步驟可選定該大步驟后,點(diǎn)擊，或點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在彈出的對(duì)話框中，選擇 AddSegment，則可在該大

9、步驟之后添加一個(gè)大步驟；若是在選定大步驟里面的小步 驟后邊添加一小步驟，選中該小步驟，點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在彈出的對(duì)話框中選擇“AddDel&le，或者點(diǎn)Plateau with Ramp 。要?jiǎng)h除某個(gè)大步驟，直接選定大步驟，點(diǎn)擊界面右邊的擊鼠標(biāo)右鍵選Delete，即可刪除該步驟。如果要?jiǎng)h除一個(gè)大步驟里的小步驟，可先選定此步驟時(shí)間和溫度中間的橫線，將其變紅，如圖D alete，或者點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵選Delete，即可刪除該步驟點(diǎn)擊lri - 1導(dǎo)入以前設(shè)定的PCR程序。'(END )代表在這一步結(jié)束時(shí)米集熒光信號(hào);'(ALL)代表在這一步的全過(guò)程都采集熒光信號(hào)，一般用作熔解曲線分

10、析?？芍苯佑檬髽?biāo)將此圖標(biāo)拖到要采 集信號(hào)的地方。若要去除'，可將其拖出循環(huán)設(shè)定區(qū)域4.538曲曲 結(jié)束之后，點(diǎn)擊軟件界面右上方的已o會(huì)彈出對(duì)話框提示：儀器燈源正在預(yù)熱，需要“馬上運(yùn)行”或者是“燈預(yù)熱完成后再運(yùn)行”？通常可直接 點(diǎn)擊“馬上運(yùn)行”，但最好點(diǎn)擊“燈預(yù)熱完成后再運(yùn)行”，可以保護(hù)燈源。軟件界面右下方會(huì)出現(xiàn)運(yùn)行狀態(tài)顯示框 Run Status，點(diǎn)擊Start開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。在運(yùn)行過(guò)程中可以通過(guò)點(diǎn)擊Add Cycles來(lái)增加擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)。還可以選擇勾選“ Turn lamp off at end of run ”，在PCR運(yùn)行結(jié)束之后軟件將自動(dòng)關(guān)閉鹵鎢燈4.539在PCR運(yùn)行的過(guò)程中可以點(diǎn)

11、擊旳悟，觀察樣品的實(shí)時(shí)擴(kuò)增原始結(jié)果。4.5.3.10 PCR運(yùn)行結(jié)束后，點(diǎn)擊仝三，再點(diǎn)擊Results，軟件將自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果分析, 也可點(diǎn)擊'手動(dòng)進(jìn)行結(jié)果分析?？梢允謩?dòng)調(diào)節(jié)閾值線(拖動(dòng))進(jìn)行分析。點(diǎn) 擊''可顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線，看斜率、截距、線性相關(guān)是否在可控范ROX | HEX | FAM可選擇相應(yīng)的熒光觀察擴(kuò)增曲線。右邊的* ”型-也也理旦世 廣Plaif!帕叩由対山辟 廣 Stsrdard curIntia tenpietg qiuen'jl 廣 L ul cobr ssathE r pll 廠 lehtropari.廠 Ccnioliit»d ripe

12、rtt圍內(nèi)。左下角的*' Arnplification plots可根據(jù)自己的需要選擇顯示的界面Ct值列表, 標(biāo)準(zhǔn)曲線,an *» iurBrn irviiiarM n“iwa Hnitial template qiiantitij：樣本起始濃度,w結(jié)果excel表格輸出,ii! iwi naim 合并面板，包括設(shè)置、程序設(shè)定、樣本Ct值、擴(kuò)增曲線四個(gè)面板。OpticsurF.Ax.lysis Xerw Settings,.4.5311分析曲線時(shí)，如果曲線不夠光滑，還能用中的 Smoothi ng對(duì)曲線進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般Amplification average是3，可按需要將其

13、調(diào)至較大數(shù)值,Anpl i f i c tt 1 on i.v*rsg：i ng如5、7、9，調(diào)整后曲線將更光滑，不過(guò)Ct值會(huì)稍中的微靠后一點(diǎn)，使數(shù)據(jù)失真，通常情況下，不建議這么做4.5.3.12如果需要對(duì)每條曲線進(jìn)行單獨(dú)的基線設(shè)置，點(diǎn)擊Baseli ne Correctio n，點(diǎn)擊Adaptive baseli ne，在下面對(duì)應(yīng)的各孔，單獨(dú)進(jìn)行 基線起始和終止位置的調(diào)節(jié)4.5.3.13關(guān)于MX3000P調(diào)用前一次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的補(bǔ)充說(shuō)明。 點(diǎn)擊桌面Mx3000P的軟件圖標(biāo)，彈出話框：選擇 Multiple Experiment Analysis（多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析）選項(xiàng)，點(diǎn)擊“ 0K”，出現(xiàn)如

14、下對(duì)話框，建議選擇“ Use common threshold ” 進(jìn)行分析進(jìn)算，然后點(diǎn)擊口me年閔庇祗二導(dǎo)入需要一起分析的上機(jī)文件，點(diǎn) 擊“Finish ”即可。4.5.3.14這里選擇時(shí)要注意：1.兩個(gè)或者多個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有相同的實(shí)驗(yàn)程序；2.每次程序中的循環(huán)數(shù)應(yīng)該一致。在分析欄可以選擇不同實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)孔進(jìn)行同步分析。4.5.3.15分析質(zhì)控結(jié)果：陰性質(zhì)控品：EBV（FAM）Ct值=40或“ No Ct ”。陽(yáng)性質(zhì)控品：EBV（ FAM）Ct值33，且有較好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新檢測(cè)。4.5.3.16記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。4.5.3.17取出結(jié)束

15、后擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴(kuò)增管破裂而導(dǎo)致污染。4.5.4 Roche480熒光定量PCR儀的設(shè)置及結(jié)果分析4.541先打開(kāi)電腦，再打開(kāi)熒光定量PCR儀器，然后雙擊圖標(biāo)“口”，打開(kāi)儀器數(shù)據(jù)庫(kù)。4.5.4.2雙擊圖標(biāo)“陽(yáng)”，啟動(dòng)羅氏480軟件。4.5.4.3在彈出的對(duì)話框中，輸入用戶名和密碼，進(jìn)入軟件設(shè)置界面。4.5.4.4在彈出的界面中，點(diǎn)擊 '”，進(jìn)入新的實(shí)驗(yàn)設(shè)置界面:4.5.4.5在“”菜單欄里，“ I詢I”子菜單下。4.5.4.6 將“ Detection Format ”選擇為Daul或3 color的探針雜交類型。設(shè)置為“ 50

16、ul4.5.4.7 將“ Reaction Volume4.5.4.8在“ Programs ”下：通過(guò)“”“ ”來(lái)增加總的循環(huán)階段及階段的循環(huán)數(shù)，并在“變性一延伸一退火”循環(huán)階段的An alysis Mode ” 下選擇 Quan tificati on4.549在“Temperature Targets ”下：通過(guò)“”“”來(lái)增加每個(gè)循環(huán)階段里的小步驟，并在采集熒光的小步驟的“ Acquisition Mode”里選擇“ single ”，采集卄、/,光。4.5.4.10在“曰”菜單欄下，通過(guò)“增加或者減少實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型，通過(guò)右邊的孔位選擇，設(shè)置不同項(xiàng)目的區(qū)域，然后點(diǎn)擊“Apply ”保存。4

17、.5.4.11在“”菜單欄下，Step 1處，選擇“ Abs Qua nt ”； Step 2處，編輯標(biāo)準(zhǔn)品及 樣本。4.5.4.12標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置：在Step 2下的96孔面板中，選中標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔，然后選擇右側(cè)的模板檢測(cè)通道，如! “483-533 ”，然后將下方孔位的“Quantification Sample Type'選擇為“ Standard ”，并在“ Concentration ”處輸入其濃度即可。4.5.4.13樣本設(shè)置：類似于標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置，但僅需要編輯其“Sample Name ”即可。4.5.4.14返回“ ”菜單，在“唄叭zI”子菜單右下角點(diǎn)擊“”，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。4.5.4

18、.15實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在“ 一”菜單下，選擇“ Abs Quant/Fit Points ”，進(jìn)入結(jié)果分析界面:【Analysis】：在此菜單下對(duì)閾值線進(jìn)行調(diào)整；【Noise Band】：對(duì)實(shí)驗(yàn)的信噪比進(jìn)行調(diào)整；【Filter Comb】：對(duì)不同熒光通道進(jìn)行選擇；【Std Curve】：對(duì)定量參考品進(jìn)行選擇，包括實(shí)驗(yàn)中的參考品、導(dǎo)入的標(biāo)準(zhǔn)品等；4.5416在上述操作完成后，點(diǎn)擊“ MTW”；在菜單中，根據(jù)需要選擇報(bào)告中需包含的項(xiàng)目，然后得出結(jié)果。4.5.4.17分析質(zhì)控結(jié)果：陰性質(zhì)控品：EBV(FAM)Ct值=40或“ No Ct ”。陽(yáng)性質(zhì)控品：EBV( FAM)Ct值33。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新檢測(cè)。4.5.4.18記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。4.5.4.20取出結(jié)束后擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴(kuò)增管破裂而導(dǎo)致污染。4.5.4.21關(guān)閉擴(kuò)增儀電源和計(jì)算機(jī)電源4.6結(jié)果判定EBV陽(yáng)性：（EBV-FAM ） Ct <36，且有較好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線。EBV 陰性:（EBV -FAM）Ct 值=40 或者 “ No Ct ” （Mx3000P）或者 “ Un det. ”