甲基化引物探針設(shè)計(jì)方法

1、本文敘述了一種用于甲基化分析的探針法定量PCR的引物和探針設(shè)計(jì)方法，目前用于甲基化檢測的引物探針設(shè)計(jì)工具非常多，都有使用成功的案例，經(jīng)過初步多方嘗試，本文中敘述的為本人認(rèn)為較為靠譜的方法。Oligo7的優(yōu)勢在于專業(yè)，參數(shù)詳盡且可自由設(shè)置，模塊化設(shè)計(jì)，學(xué)會(huì)后使用便利。專業(yè)的活就是要專業(yè)的用專業(yè)的工具干。首先是進(jìn)行序列轉(zhuǎn)換，有較多的在線工具和聯(lián)機(jī)軟件都可實(shí)現(xiàn)，這里使用/methprimer/ ，較為簡單直觀。直接將目標(biāo)序列放入如上圖的編輯框中，此網(wǎng)站也可直接用于相關(guān)引物的設(shè)計(jì)，不過本人沒使用過，因?yàn)椴荒茉O(shè)計(jì)探針。submit后就有轉(zhuǎn)化后的序列信息，如下圖：

2、以上詳細(xì)標(biāo)記了CpG位置和非CpG位置的C，可直接復(fù)制到Word內(nèi)標(biāo)注使用，下面就可以使用Oligo7利用上邊的序列設(shè)計(jì)引物和探針了，如果是設(shè)計(jì)非甲基化引物探針，則使用原始序列。關(guān)于引物和探針的一些主要參數(shù)，主要參考invtrogen的建議：Primer設(shè)計(jì)的基本原則：a) 引物長度一般在18-35mer。 b) G-C含量控制在40-60%左右。 c) 避免近3端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 d) 如果可能避免在3端最后5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C。 e) 如果可能避免在3端最后1個(gè)堿基為A。 f) 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。 g) 退火溫度Tm控制在 58-60C左

3、右。 h) 如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則：a) TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。 b) 長度一般為18-40mer 。 c) G-C含量控制在40-80%左右。 d) 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。 e) 在引物的5端避免使用G。 f) 選用比較多的堿基C。 g) 退火溫度Tm控制在 68-70左右。 另：目標(biāo)變異堿基最好在3末端或3末端-1位置，保證擴(kuò)增特異性，對于甲基化，則最好是C。打開軟件，有以上幾種方式可以建立新的序列文件，建立好的文件可保存，下次繼

4、續(xù)處理，此處直接復(fù)制轉(zhuǎn)化后的序列。建立好的用來設(shè)計(jì)引物和探針的序列。如果選擇自動(dòng)搜索，選擇如下菜單，選擇后彈出相應(yīng)的設(shè)置項(xiàng)。Search for Primer& Probes的主要設(shè)置項(xiàng)目在Parameters和Ranges兩個(gè)子項(xiàng)中。以上根據(jù)優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系調(diào)整，這里主要是反應(yīng)體系中各離子濃度。對于甲基化PCR影響較大的應(yīng)該是鎂離子濃度，如果需要可以重點(diǎn)優(yōu)化一下。Constraints是各約束條件設(shè)置，每個(gè)設(shè)置項(xiàng)在幫助文件中有詳細(xì)解釋，我在這里只設(shè)置Primer Length和Tm值相關(guān)的選項(xiàng)，前邊的鎖形標(biāo)記表示強(qiáng)制要求和建議要求。對于甲基化PCR，有一種理論認(rèn)為增加引物長度（

5、30mer左右）減小產(chǎn)物長度（小于150mer）能增加PCR反應(yīng)的敏感性，即更容易得到擴(kuò)增，經(jīng)過嘗試，有一定效果。Search Ranges選項(xiàng)，做一些序列位置和產(chǎn)物長度的限定。除以上提到的設(shè)置條件，其他條件可根據(jù)項(xiàng)目含義調(diào)整，如果不了解則使用默認(rèn)設(shè)置即可。以上條件都設(shè)置后，可能會(huì)出現(xiàn)Search Filed的情況，是因?yàn)樵O(shè)置的條件無法滿足，此時(shí)需要修改為更寬松的條件，另外如果序列太長Search時(shí)間可能會(huì)較長。Seacrh完成后，如下圖，這里同時(shí)調(diào)出Current Oligo和Selected Oligos的Key Info，如下圖：這里最重要的信息是Score，基本上大于700points

6、的，據(jù)我測試都能成功，可見此處的算法比較合理。本人還做個(gè)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，用不同軟件對同一段序列設(shè)計(jì)引物探針，相互評估，就算完全一樣的序列各自計(jì)算出的不管是Tm值還是其他分?jǐn)?shù)都差距不小，所以只能選擇一個(gè)軟件設(shè)計(jì)的合成后測試了，Oligo7是目前設(shè)計(jì)使用成功率較高的一個(gè)，差別的原因是各家算法不同，部分軟件會(huì)給出詳細(xì)的計(jì)算公式，如果感興趣可以查看了解。雖然指定了大致設(shè)計(jì)位置，但以上設(shè)計(jì)的引物探針位置不一定是我們需要的位置，特別是我們需要指定某幾個(gè)CpG被包含的情況，這就需要用到軟件的評估功能了。打開Edit菜單下的對話框，其中用Upper Oligo或Lower Oligo表示Probe，分別為正鏈和反鏈

7、互補(bǔ)序列。打開編輯框后，根據(jù)自身需求調(diào)整引物和探針的長度及位置，輸入下圖中的編輯框后確認(rèn)，這里主要需要關(guān)注如下圖紅色框中的信息，原則有幾點(diǎn)：a) Edit Foward Primer輸入正向序列，Edit Foward Primer輸入反向互補(bǔ)序列，Edit Upper/Lower Primer輸入正向/反向互補(bǔ)序列，每項(xiàng)編輯后點(diǎn)擊確認(rèn)小勾，相應(yīng)的參數(shù)會(huì)列出，這里重點(diǎn)調(diào)出Analyze下的Key Info和Composition& Tm兩個(gè)選項(xiàng)，對應(yīng)每個(gè)引物或探針的信息。b) 修改后得到的Score是根據(jù)前述Search中設(shè)置的參數(shù)得來，所以這里需要設(shè)置的相關(guān)參數(shù)也是在前述相同的Sea

8、rch選項(xiàng)下修改，其中的諸如Primer Length，Primer Tm Range等參數(shù)的設(shè)置同樣會(huì)影響最后的Score，詳見Search Parameters下的Scores選項(xiàng)卡，所以如果有相關(guān)不適宜的設(shè)定，可能會(huì)降低Score值。c) 關(guān)于Tm值，此軟件列出了3中不同算法的Tm值，對于引物，3種算法的Tm值會(huì)相近，如果不能滿足，以nearest neighbor method算法的Tm值為準(zhǔn)，此處的探針法的引物以接近60為優(yōu)。對于探針，以nearest neighbor method算法的Tm值為準(zhǔn)，另外兩種算法會(huì)偏高，以接近70為優(yōu)。d) 關(guān)于Score，如果Length和Tm以及其他輔助項(xiàng)，如G+C含量等，基本符合要求后，Score只要大于700即為優(yōu)秀，越高越好，這里