PCR反應(yīng)中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用

1、PCR反應(yīng)中基本成分（引物、dNTP、模板等）的作用PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)包括三個基本步驟，即：模板 DNA 的變性、模板 DNA 與 引物的退火復(fù)性、弓 I 物的延伸。PCR 反應(yīng)體系包括 5 種基本成分，依次為：引 物、DNA 聚合酶、dNTP 模板 DNA Mg2+PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)包括三個基本步驟，即：模板 DNA 的變性、模板 DNA 與 引物的退火復(fù)性、弓 I 物的延伸。PCF 反應(yīng)體系包括 5 種基本成分，依次為：引 物、DNA 聚合酶、dNTP 模板 DNA Mg2+1、引物引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA 互補(bǔ)的

2、程度。理論上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸 鏈 做引物，利用 PCR就可將模板 DNA 在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：1引物長15-30bp，常用為 20bp 左右。2引物擴(kuò)增跨度： 以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至 10kb 的片段。3引物堿基：G+C 含量以 40-60%為宜，G+C 太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn) 非特異條帶。ATGCft好隨機(jī)分布，避免 5 個以上的嘌吟或嘧啶 核苷酸的成串排 列。4避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成 引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。5引物 3端

3、的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免 因末 端堿基不配對而導(dǎo)致 PCR 失敗。6引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子 克隆 很有好處。7引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度 0.1? 1umol 或 10? 100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的 結(jié)果 為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增， 且可增加引物之間形成二 聚體的 機(jī)會。2、酶目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR 反應(yīng)約需

4、酶量 2.5U （指總反應(yīng)體積為 100ul 時），濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3、dNTP dNTP 的質(zhì)量與濃度和 PCRT 增效率有密切關(guān)系， dNTP 粉呈顆粒狀，如保 存不當(dāng) 易變性失去生物學(xué)活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以IMNaOH 或 1M Tris。HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到 7.0? 7.5，小量分裝，-20C冰凍 保 存。多次凍融會使 dNTP 降解。在 PCF 反應(yīng)中， dNTP 應(yīng)為 50? 200umol/L , 尤其 是注意 4 種dNTP 的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它 幾 種時（

5、偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCRT物的產(chǎn)量。 dNTP 能 與 Mg2+吉合，使游離的 Mg2+濃度降低。dNTP 儲存液：dNTP 溶于 pH 為 7.0 的 NaOHC 存液中，最初的貯存液可稀釋到 10mol/L，分裝后存放在-20C冰箱中。dNTP 使用濃度在 20? 200 卩 mol/L 之間 4 種 dNTP 必須等濃度配合以減少錯配誤差。dNTP 使用濃度：在 PCR 反應(yīng)中 ,使用低 dNTP 濃度,?可減少非靶位置啟動和延伸 時的 核苷酸錯誤摻入。一般可根據(jù)靶序列的長度和組成來決定最低dNTP 濃度。例如在 100 卩 l?的反應(yīng)體系中,4 種 dNTP

6、 的濃度為 20 卩 mol/L,可基本滿足合成 2.6 卩 g DNA或？10pmol/L?的 400bp 序列。使用低 dNTP 濃度（每種 dNTP 濃度為 2 卩 mol/L）,能夠高度靈敏地（1/107）?擴(kuò)增 ras 基因點突變的等位基因。4、 模板模板核酸的量與純化程度，是 PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 DNA 屯化方 法 通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標(biāo)本。SDS 的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上 的脂 類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白， SDS 還 能與蛋 白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA 吉合的組蛋

7、白，再用 有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份， 用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。提取的 核酸即可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速 簡便的方法溶解 細(xì)胞， 裂解病原體， 消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離， 直 接用于 PCRT 增。RNA 莫板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止 RNase 降解 FNA。5、 Mg2 濃度Mg2+寸 PCRT增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為 200umol/L 時，Mg2+濃度為 1.5? 2.0mmol/L 為宜。Mg2 濃度過高，反應(yīng) 特 異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng) 產(chǎn)物 減少。引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，不好的引物嚴(yán)重影響實驗的質(zhì)量，好的引物可以 事 倍功半；酶