馬鈴薯塊莖貯藏期抗性淀粉和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性

1、馬鈴薯塊莖貯藏期抗性淀粉和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性學校名稱：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學作者姓名：陸曉玉指導老師：霍秀文摘要本實驗材料均為內(nèi)蒙古田間統(tǒng)一收獲的馬鈴薯塊莖，選用中薯10號，中薯17號和費烏瑞它三個品種，收獲后直接入窖貯藏，窖溫保持在4攝氏度。三個品種都采用壓熱法測定抗性淀粉含量，用3,5-二硝基水楊酸比色法測定淀粉-糖代謝酶中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性動態(tài)變化，通過數(shù)據(jù)比較的方法，研究馬鈴薯抗性淀粉和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過塊莖中蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉含量的相關(guān)性可知，馬鈴薯塊莖中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉含量有顯著的相關(guān)性，其中費烏瑞它（R=0.988）,中薯10號相關(guān)系數(shù)為（ R=0.

2、854），中薯17號相關(guān)系數(shù)為（R=0.999）。三個馬鈴薯品種均呈負相關(guān)。即蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性越強，則抗性淀粉含量越低。關(guān)鍵詞：馬鈴薯；貯藏期；抗性淀粉；蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性Abstract The experimental materials are Inner Mongolia field uniform harvest of potato tubers in selection in potato, 10 potato, 17 and Favorita three v

3、arieties,harvested directly into the storage pit, pit temperature maintained at 4 degrees celsius. Three species are used for the determination of resistant starch content in hot press method, determination of the dynamic changes of the

4、0;activity of invertase of starch sugar metabolic enzymes by 3,5- two nitro salicylic acid colorimetry method, through the data comparison, correlation of Potato Resistant Starch and sucrose invertase activity. The results sh

5、owed: Through the correlation that invertase activity and the resistant starch content of tuber, from potato tuber invertase activity and resistant starch content had significant correlation, which Faye U Ray Tia (R= 0.988), in th

6、e potato 10 correlation coefficient (R= 0.854), in the potato 17 correlation coefficient (R=0.999). Three potato varieties were negatively correlated. That is, the stronger the invertase activity is lower, the resistant starch content.

7、Keywords: potato; storage period; resistant starch; invertase activit目錄1引言61.1 馬鈴薯淀粉61.2馬鈴薯抗性淀粉61.3蔗糖轉(zhuǎn)化酶81.4本實驗研究的目的和意義82馬鈴薯抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性分析102.1材料與方法112.1.1材料112.1.2儀器設(shè)備和試劑112.2抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的測定方法112.2.1馬鈴薯淀粉的制備112.2.2抗性淀粉的制備（壓熱處理法）122.2.3抗性淀粉含量的測定122.2.4葡萄糖標準曲線制定132.2.5蔗糖轉(zhuǎn)化酶的提取和

8、活性檢測143統(tǒng)計與分析163.1結(jié)果與分析163.1.1馬鈴薯塊莖貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化163.1.2馬鈴薯塊莖貯藏期抗性淀粉含量變化163.1.3三種馬鈴薯貯藏期抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性分析183.2結(jié)論20展望21致謝22參考文獻231引言1.1 馬鈴薯淀粉馬鈴薯為茄科植物是世界第四大糧食作物，以塊莖為食用器官。馬鈴薯的人工栽培地最早可追溯到大約公元前8000年到5000年的秘魯南部地區(qū)。如今中國的馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)是西南山區(qū)，西北，內(nèi)蒙古和東北地區(qū)且我國馬鈴薯種植面積居世界第二位。馬鈴薯深受人們的喜愛，含有豐富的維生素A和維生素B以及礦物質(zhì)和木質(zhì)素，優(yōu)質(zhì)淀粉含量約為16.5%

9、。馬鈴薯作為主糧被譽為人類的“第二面包”；作為菜品是現(xiàn)如今營養(yǎng)學家青睞的蔬菜明星；作為工業(yè)原料更是被市場大量需求。目前，馬鈴薯加工產(chǎn)品主要為四大類，馬鈴薯食品，馬鈴薯粉條粉絲，馬鈴薯淀粉和馬鈴薯全粉。因此把握好馬鈴薯的深加工將會帶來巨大的經(jīng)濟效益。馬鈴薯淀粉是薯類淀粉中的一種，由于其特殊品質(zhì)而受到特別青睞。馬鈴薯淀粉是一種優(yōu)質(zhì)淀粉，具有其他任何淀粉不能替代的獨特品質(zhì)和功能，比如顆粒大，高粘性，易膨脹，口味溫和無刺激，糊化溫度低，糊化透明度高等。它也是造紙業(yè)，紡織業(yè)，食品加工業(yè)，飼料工業(yè)，油工業(yè)，鑄造業(yè)等工業(yè)重要原材料。1.2馬鈴薯抗性淀粉抗性淀粉由于其具有無法被淀粉酶水解，也不能在人體的胃和小

10、腸中消化及吸收的良好理化特性和生理功能，1996年，抗性淀粉的概念被歐洲消化淀粉協(xié)會（EURESTA）做了界定與規(guī)范，即在健康人體小腸中不被消化和吸收的淀粉及其分解物的總稱。1抗性淀粉本身仍是淀粉，其化學結(jié)構(gòu)不同于纖維，但其性質(zhì)類似溶解性纖維，因此被認為是膳食纖維的一種，但仍與膳食纖維有著本質(zhì)的不同。抗性淀粉是一類具有低持水性，、無異味、多孔等特性的白色粉末。根據(jù)淀粉的來源和抗酶解性，將其分為四類，物理包埋淀粉（Physically inaccessible），抗性淀粉顆粒（Resistant Starch），回生淀粉（Retrograded Starch），化學改性淀粉（Chemically

11、 Modified Starch）。抗性淀粉擁有優(yōu)良的生理功能，可以調(diào)節(jié)血糖代謝和控制胰島素水平，改善腸道機能，促進鋅，鈣，鎂離子的吸收，又因為抗性淀粉幾乎不含熱量，食用高含量抗性淀粉的食品能有效地減少對熱量的攝取并增加脂肪的排泄，從而控制體重2?？剐缘矸鄄粌H對人體有著極大的益處，在食品加工業(yè)中也扮演者重要角色。它可以作為食品增稠劑，膨化和脆性食品的改良劑，熱量添加劑張，膳食纖維營養(yǎng)強化劑4。因此馬鈴薯淀粉經(jīng)過深加工后產(chǎn)生的抗性淀粉具有極大的經(jīng)濟價值，抗性淀粉自1983年被發(fā)現(xiàn)以來，抗性淀粉產(chǎn)業(yè)便得到了飛速發(fā)展5。自上世紀90年代以來，抗性淀粉已成為研究熱點。研究學者以馬鈴薯淀粉，大米淀粉為原

12、料探究抗性淀粉的制備工藝，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉更適合用來生產(chǎn)抗性淀粉。1.3蔗糖轉(zhuǎn)化酶大多數(shù)植物收獲后仍然是一個活的機體，在貯藏過程中仍然進行著新陳代謝，這是影響植物貯藏的主要因素?！?】馬鈴薯抗性淀粉含量是內(nèi)部和外部各因素綜合作用的結(jié)果，但外部環(huán)境因素十通過改變內(nèi)部代謝強度和方向來實現(xiàn)的。馬鈴薯塊莖發(fā)育和貯藏過程中淀粉-糖代謝相關(guān)酶的活性直接決定淀粉中抗性淀粉的含量。馬鈴薯塊莖中淀粉可以轉(zhuǎn)化為蔗糖和還原糖，使塊莖“糖化”，“糖化”后的塊莖中蔗糖和還原糖又可以轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸?，這些變化的方向和速率取決于品種，塊莖的生理狀態(tài)和貯藏條件。【7】現(xiàn)在研究學者對淀粉-糖代謝的酶已經(jīng)研究的比較深入，幾乎涵蓋所有相關(guān)

13、的酶類。根據(jù)目前研究結(jié)果，腺苷二磷葡糖焦磷酸化酶，淀粉合成酶和分支酶是淀粉合成的三個關(guān)鍵酶?！?】蔗糖轉(zhuǎn)化酶是植物體內(nèi)有關(guān)蔗糖代謝的一類關(guān)鍵酶，又稱 蔗糖酶或-呋喃果糖苷酶，它不可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。馬鈴薯低溫貯藏期間，淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖過程中，淀粉酶，淀粉磷酸化酶和轉(zhuǎn)化酶也發(fā)揮著重要作用 。本實驗主要研究蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉相關(guān)性。1.4本實驗研究的目的和意義了解并掌握馬鈴薯塊莖中抗性淀粉與淀粉-糖代謝酶中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性；了解不同時期及收獲后不同貯藏期馬鈴薯塊莖中抗性淀粉的含量及與之相關(guān)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性，從而分析兩者之間的相關(guān)性。本試驗通過對不同品種馬鈴薯塊莖抗性淀

14、粉與蔗糖轉(zhuǎn)化酶的相關(guān)性的分析，為今后馬鈴薯抗性淀粉的高效利用和優(yōu)良品種的選育提供了一定的理論依據(jù)。2馬鈴薯抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性分析馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）塊莖中含有豐富的碳水化合物，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。早先馬鈴薯在我國主要做鮮食，近年來馬鈴薯加工業(yè)的迅速發(fā)展顯示出馬鈴薯生加工在未來市場的高價值前景，工業(yè)對加工原料的品質(zhì)要求越來越高，干物質(zhì)，淀粉，可溶性糖含量就是很重要的指標?！?】淀粉是馬鈴薯塊莖中的主要貯藏物質(zhì)，其含量是評價馬鈴薯品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標之一。抗性淀粉（Resistant Starch,簡稱 RS）又是淀粉中最有研究意義的一類，是

15、不被健康人體小腸吸收的淀粉及其水解物總稱【9,10】，具有增加腸胃蠕動，降低餐后血糖濃度，減少心臟病發(fā)生頻率等有重要作用的保健功能和醫(yī)療作用。馬鈴薯中的抗性淀粉有著非常大的價值，讓國內(nèi)外的研究學者對其進行更多更深入的研究，但大多只針對馬鈴薯數(shù)量性狀相關(guān)性分析或數(shù)量性狀及產(chǎn)量的相關(guān)性分析，而沒有對抗性淀粉和淀粉-糖代謝酶活性的相關(guān)性分析，淀粉和蔗糖，還原糖之間的轉(zhuǎn)換勢必會影響到抗性淀粉的含量及性質(zhì)等。故本實驗主要研究抗性淀粉和淀粉-糖代謝酶中蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性。以期為今后馬鈴薯抗性淀粉的高效利用提供一定的理論基礎(chǔ)。2.1材料與方法2.1.1材料實驗材料:窖藏（4-6）6個月的3個馬鈴薯品種（

16、中薯10號、中薯17 號、費烏瑞它），烏蘭察布市農(nóng)業(yè)科學研究所提供。2.1.2儀器設(shè)備和試劑儀器設(shè)備：恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、低速離心機、電子天平、萬能粉碎機，恒溫滅菌器 ，打孔器，研缽，量筒，燒杯，容量瓶，培養(yǎng)皿，錐形瓶，精密移液器，玻璃棒等。試劑：-淀粉酶, 普魯蘭酶, 胃蛋白酶。常規(guī)化學純：1mol/l NaoH,1mol/l HCL,葡萄糖淀粉酶，無水乙醇，2mol/l KOH，3,5-二硝基水楊酸（DNS）；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 （G-6-PDH）;葡萄糖 磷酸變位酶（PGM）; AGPase 抽提緩沖液； 0.1·mol.L-1 磷酸 二氫鉀-檸檬酸緩沖

17、液（pH 5.0）、0.1 mol·L-1蔗糖； DNS 試劑；80 mmol·L-1 Mes 緩沖液；5 mmol·L-1 NaF；100 mmol·L-1 蔗糖，5 mmol·L-1 UDP。2.2抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的測定方法2.2.1馬鈴薯淀粉的制備 將馬鈴薯清洗、剝皮并切成絲狀放在小水桶里【11】，薯水比為1：3，靜置時間為7h,然后攪拌用紗布過濾，用水洗滌，濾渣繼續(xù)加水靜置7h，把過濾出的淀粉乳液放在水桶里靜置7h，倒掉上層液體，加第二次過濾的淀粉乳液，重復三次。最后加水攪拌繼續(xù)靜置7h。洗滌次數(shù)為23次，得到濕淀粉，把濕淀

18、粉放入60烘干箱烘干即得淀粉成品。2.2.2抗性淀粉的制備（壓熱處理法）將濃度為10%的淀粉乳，壓熱溫度120分別處理60 min，取出后自然冷卻，放置在4的冰箱儲藏24h，取出至室溫，加入1 u/g耐高溫-淀粉酶，90水浴震蕩30min，取出后自然冷卻，加入4 u/g普魯蘭酶，60水浴震蕩60 min，然后80烘干，粉碎，過100目篩，測定其抗性淀粉的含量，重復兩次。2.2.3抗性淀粉含量的測定A.稱取0.1g的淀粉樣品，加入5ml的蒸餾水，調(diào)ph為2，再加入0.05g胃蛋白酶，37.c恒溫水浴震蕩1h，取出。B.冷卻至室溫，調(diào)節(jié)ph為6.0，加入300u耐高溫a-淀粉酶，置于90.c的恒溫

19、水浴振蕩箱中震蕩30min，水解其中的可消化淀粉。C.取出，冷卻至室溫，調(diào)ph為4.5，加入0.05g葡萄糖淀粉酶，60.c恒溫水浴震蕩12h，徹底水解可消化淀粉并轉(zhuǎn)化成葡萄糖。D.取出，用無水乙醇沉淀，3500r/min離心10min，棄去上清液，沉淀用80%的乙醇洗3遍，徹底洗去葡萄糖。E.加入4ml2mol/l的koH，加熱使沉淀充分溶解。F.冷卻至室溫，調(diào)ph為4.5，加入0.1g葡萄糖淀粉酶，60.c恒溫水域震蕩75min徹底水解溶解后的抗性淀粉。G.取出，3500r/min離心10min，收集上清液于50ml的容量瓶，用蒸餾水洗滌沉淀，離心，合并上清液，重復3次。H.吸取1ml上清

20、液作還原糖含量測定，還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。抗性淀粉含量為還原糖的量乘0.9。2.2.4葡萄糖標準曲線制定葡萄糖標準曲線的制定：取7支25ml刻度試管，編號，按如下操作。表2-1操作項目 管 號0 1 2 3 4 5 6葡萄糖標準液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸餾水（ml）2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3,5-二硝基水楊酸（ml）1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5吸光度（A540）0.000 0.081 0.217 0.331 0.467 0.575 0.648 將各管搖勻，在沸水中加熱5min

21、，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25min，用試管塞塞住試管口，顛倒混勻。在540nm波長下，用0號試管調(diào)零，分別讀取16號管的吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄樣毫克數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。2.2.5蔗糖轉(zhuǎn)化酶的提取和活性檢測取樣方法：塊莖取樣參照 Tauberger 等方法：在04 條件 下進行。先用打孔器沿塊莖的頂部至基部方向取樣 35 次（較小塊莖 3 次，大塊莖 45 次），然后垂 直于上述方向再取樣 3 次，將取下的樣品切成 12 mm 薄片并混勻，組成平均樣品。（1）蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的測定：3,5二硝基水楊酸比色法【12】稱取1g冷凍后的樣品，加入4ml檸

22、檬酸緩沖液（0.5mol/L,ph=5.0）冰浴研至勻漿，冰凍離心5min，上清液于4度透析1h。于15ml刻度試管中加入0.6ml檸檬酸緩沖液，0.3ml蔗糖溶液（0.2mol/L），粗酶液1ml，以蒸餾水做空白，30水浴加熱10min，加入0.5ml氫氧化鈉溶液（1mol/L）終止反應，搖勻，加入2ml3.5-二硝基水楊酸，沸水浴加熱5min，冷卻定容至刻度，測定540nm下吸光度值?；钚杂嬎悖好糠昼娝猱a(chǎn)生1µmol葡糖糖所需要的酶量，定義為酶的一個活性單位（U）。蔗糖酶活性（U/g）=(r×n×v×1000)/(W×t)式中：r標準曲線

23、查得還原糖的量（mg）； n稀釋倍數(shù)； v酶液總體積（ml）; W樣品重（g）; t時間（10min）; 1000毫摩爾轉(zhuǎn)化為微摩爾的倍數(shù)。3統(tǒng)計與分析3.1結(jié)果與分析3.1.1馬鈴薯塊莖貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化 圖3-1是不同品種的馬鈴薯塊莖在貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的變化，由圖1可看出隨著時間的增加，費烏瑞它、中薯10號、中薯17號中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性都在增加，其中費烏瑞它蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性最強，變化幅度也最大，中薯10號、17號變化幅度較小。圖3-1馬鈴薯塊莖貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化3.1.2馬鈴薯塊莖貯藏期抗性淀粉含量變化 圖3-2是三種馬鈴薯塊莖貯藏期抗性淀粉含量變化的趨勢圖，由圖可見三種馬鈴

24、薯塊莖的抗性淀粉含量都在下降，其中費烏瑞它下降幅度最大，中薯10號下降幅度最小，并且下降趨勢隨時間增加有所減緩。圖3-2馬鈴薯塊莖貯藏期抗性淀粉含量變化3.1.3三種馬鈴薯貯藏期抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性分析圖3-3費烏瑞它貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉含量的相關(guān)性圖3-4中薯貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉含量的相關(guān)性圖3-5中薯17號貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉含量的活性由圖3-3、3-4、3-5可見在貯藏期，費烏瑞它、中薯10號、中薯17號的抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性都呈現(xiàn)出負相關(guān)的趨勢。費烏瑞它相關(guān)系數(shù)（R=0.988）,中薯10號相關(guān)系數(shù)為（ R=0.854），中薯17號

25、相關(guān)系數(shù)為（R=0.999），表明馬鈴薯貯藏期其抗性淀粉含量和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性有顯著的相關(guān)性。蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性越強，抗性淀粉含量越低。蔗糖轉(zhuǎn)化酶能夠不可逆的催化蔗糖的水解反應，生成葡萄糖和果糖，增加了可溶性糖含量?？剐缘矸坌纬傻挠绊懸蛩睾芏嗪芏啵梢院唵蔚姆譃閮?nèi)因、外因。內(nèi)因如植物的種類、材料的大小、直鏈淀粉含量/支鏈淀粉含量，植物成分中的可溶性糖的含量，抗性淀粉含量和可溶性糖含量相關(guān)性為（R=0.17216）【13】。Farhat的研究結(jié)果認為可溶性糖和淀粉競爭與水的結(jié)合，大大的推遲了淀粉的糊化，從而使其重結(jié)晶度降低，嚴重的抑制了老化過程，降低了抗性淀粉的含量?！?4】。本實驗研究結(jié)果與其相符，

26、在馬鈴薯貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性和抗性淀粉含量呈負相關(guān)，即隨著蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的增強，抗性淀粉含量降低。3.2結(jié)論馬鈴薯貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性和抗性淀粉含量的相關(guān)性分析表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與抗性淀粉含量存在著顯著的負相關(guān)性。這為選育不同類型馬鈴薯提供了理論基礎(chǔ)。我們在選育高抗性淀粉馬鈴薯品種時，可間接選育在貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較低的品種，如本實驗的中薯10號。也可以進行研究出新方法抑制馬鈴薯貯藏期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，來提高抗性淀粉含量。本實驗的研究對進一步提高馬鈴薯內(nèi)抗性淀粉含量提供了一定的理論依據(jù)。展望 本實驗僅研究了貯藏期馬鈴薯抗性淀粉含量和淀粉-糖代謝酶中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的相關(guān)性。而淀粉-糖代謝酶種

27、類較多，如腺苷二磷葡糖焦磷酸化酶，淀粉合成酶和分支酶淀粉酶，淀粉磷酸化酶等，它們在淀粉-糖代謝中都有著不可忽視的作用，與抗性淀粉含量變化都可能有著重要關(guān)系，需要進一步深入研究，以期促進馬鈴薯抗性淀粉研究的進步，提高抗性淀粉產(chǎn)量，產(chǎn)生更大的價值。致謝 本論文是在導師霍秀文教授的耐心指導下完成的。從一開始確立研究課題到研究中注意點，到最后論文的完成，霍老師提出了許多指導性建議。讓我們明確自己的研究方向，讓我們有信心完成這份論文。在實驗過程中我們認識到了很多實驗儀器的使用，學習到許多實驗規(guī)則，看到了嚴謹、細心、耐心的重要性。這些優(yōu)秀的品質(zhì)將會影響我們未來的人生道路。 在試驗期間，也獲得了魏娜，楊文等

28、師姐的幫助，對我們的實驗進行輔導，給我們提供各種資料，遇到試驗中存在的小問題時也積極想辦法幫我們分析，提出建議和意見。這一路走來有過困難，有過分歧，感謝但因為有你們支持，讓這些都成為我們前進的動力。在以后的學習工作中定會嚴格要求自己，繼續(xù)努力，不讓你們失望。 參考文獻【1】Bajhurst R A.Dietary fiber,nonstarch polysaccharide and resistant starch J.Food Australia,1996,48(3):1-35【2】Ranhotra GS, Gelroth JA, Glaser BK. Effect of resistant starch on blood and live lipids in hamsters,Cerel Chem”1996a 73(2):176-178【3】張靈超. 馬鈴薯塊莖抗性淀粉形成的影響因素及理化特性的研究D. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2014【4】Yue P,Waring S.Functionality of resistant starch in food applications J.Food A