垂體瘤轉(zhuǎn)化基因在多發(fā)性骨髓瘤患者中表達(dá)的研究

1、垂體瘤轉(zhuǎn)化基因在多發(fā)性骨髓瘤患者中表達(dá)的研究 作者：王昭鹿全意陳萍張鵬叢雅琴 【摘要】 為了研究垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor-transforming gene, PTTG）在老年多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）患者中的表達(dá)并分析它與MM發(fā)生的關(guān)系，采用RT-PCR方法檢測(cè)33例MM患者及10例正常對(duì)照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中PTTG的表達(dá)。 結(jié)果表明： MM患者PTTG在MM中的表達(dá)水平(0.34150.2172 )明顯高于正常對(duì)照組(0.05900.0233) (P<0.05)。 結(jié)論： PTTG的過(guò)度表達(dá)可能與MM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這為MM的發(fā)病機(jī)

2、制及其基因靶向治療的研究提供了新的思路。 【關(guān)鍵詞】 垂體瘤轉(zhuǎn)化基因多發(fā)性骨髓瘤 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)垂體瘤Expression of Pituitary Tumor-Transforming Gene in Patients with Multiple MyelomaAbstractTo explore the expression of pituitary tumor-transforming gene (PTTG) in elderly patients with multiple myeloma （MM）and its relationship with MM, the expressi

3、ons of PTTG mRNA were detected in bone marrow mononuclear cells （BMMNC） from 33 patients with MM and 10 normal controls by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) . The results showed that the expression of PTTG mRNA in MM patients (0.34150.2172) was significantly higher than

4、that in normal controls (0.05900.0233) (P0.05). It is concluded that the overexpression of oncogene PTTG may be related to genesis and progression of MM. It provided a new ideas to study the pathogenesis and gene therapy for MM patients.Key wordspituitary tumor-transforming gene； multiple myeloma; r

5、everse transcription-polymerase chain reaction; pituitary tumor多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞惡性增生性血液腫瘤，患者骨髓內(nèi)有大量異常漿細(xì)胞增殖，血清中出現(xiàn)異常的單克隆免疫球蛋白。發(fā)病率占血液腫瘤的10，中、老年人中發(fā)病率較高。新近報(bào)道的癌基因垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor-transforming gene , PTTG），其高表達(dá)在促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生中具有十分重要的作用, PTTG在惡性腫瘤中的高表達(dá)和轉(zhuǎn)化能力證實(shí)了其與腫瘤的發(fā)生有關(guān)1。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道PTTG在胃癌2和乳腺癌 3等多種腫瘤中高表達(dá)，但

6、PTTG在MM中的表達(dá)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們用RT-PCR方法檢測(cè)33例MM患者中PTTG的表達(dá)情況,進(jìn)一步分析PTTG與MM的關(guān)系。材料和方法臨床資料33例MM患者來(lái)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2003年3月至2005年5月的門(mén)診及住院病人，其中初診MM 14例、復(fù)治19例。全部病例均經(jīng)骨髓涂片、免疫球蛋白定量、血清M蛋白電泳、X線等檢查確診。33例病人中男22例，女11例，年齡54-76歲，中位年齡66歲。按照M蛋白免疫學(xué)分型：IgG型18例，IgA型7例，IgD3例，輕鏈型5例。住院患者應(yīng)用MP方案(馬法蘭、潑尼松)、M2方案（馬法蘭、潑尼松、長(zhǎng)春新堿、環(huán)磷酰胺）、VAD方案（長(zhǎng)春新堿、阿霉素、地塞

7、米松）并配合應(yīng)用反應(yīng)停多次化療。10例對(duì)照者為門(mén)診同期就診的良性血液病患者（缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血和白細(xì)胞減少癥），男6例，女4例，年齡18-64歲，中位年齡38歲。試劑與儀器PBS（pH 7.4）緩沖液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自濟(jì)南愛(ài)博公司。 -80超低溫冰箱為日本Sanyo公司產(chǎn)品，TGL16B型臺(tái)式高速離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器廠制造， RT-PCR試劑盒（購(gòu)自Progoma公司）由下列成分組成： GIT變性液（10 ml）， 2 mol/L NaOAc (pH 4.0)(1 ml)，MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶200 U/l(20 l)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，Taq DNA

8、聚合酶1 U/l (40 l)，PCR反應(yīng)體系，去RNase水。水平電泳槽為北京六一試驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；PTC-150型PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)MJ Reseach公司產(chǎn)品；EC250-90多功能電泳儀為美國(guó)EC公司產(chǎn)品；ZF-4型多功能紫外投射反射分析儀為上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀器廠制造； 1D Image Analysis Software凝膠分析系統(tǒng)為美國(guó)Kodak公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)方法分離單個(gè)核細(xì)胞所有病例均在無(wú)菌條件下抽取骨髓2 ml并將其注入EDTA抗凝試管中, 加入4 ml PBS(pH 7.4)緩沖液稀釋。采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，-80保存?zhèn)溆谩？俁NA的提取采用異硫氰酸胍

9、苯酚氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA。所抽提總RNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定260和280 nm處吸光度（A）值，A260/A280值在1.85-1.98者用于RT-PCR。引物設(shè)計(jì)PTTG引物序列： P1 5-CGATGCCCCACCAGCCTTACC-3，P25-CAAGCTCTCTCTCCTCGTCAAGG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物317 bp； -actin引物序列: P1 5- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3， P2 5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物539 bp。 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）在經(jīng)DEPC處理過(guò)的0.5 ml E

10、ppendorf管中加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系： 細(xì)胞總RNA 1 g, MMLV-RT（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, MMLV RT） 1 l, dNTP 1 l, DTT 2 l, buffer 4 l, 下游引物1 l, 去RNase水10 l?？焖匐x心混勻；37 1小時(shí)，95 10分鐘滅活MMLV； 快速離心使蒸汽沉于管底。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在上述20 l RT產(chǎn)物的0.5 ml Eppendorf管中加入PCR反應(yīng)體系：dNTP 1 l, buffer 10 l, MgCl2 8 l, Taq酶2 l，上游引物P

11、1 1 l，超純水 58 l?？焖匐x心混勻；95 5分鐘，冰浴冷卻,然后快速離心使蒸汽沉于管底.加入2 l(1 U/l)Taq DNA 聚合酶,快速離心混勻,加入60 l液體石蠟。循環(huán)條件: 94 1分鐘、581分鐘、72 1分鐘；共35個(gè)循環(huán),最后72延伸7分鐘,然后進(jìn)行電泳鑒定。定量分析凝膠電泳圖像輸入Kodak 凝膠分析系統(tǒng), 應(yīng)用1D Image Analysis Software 進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。結(jié)果判斷以同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參照-actin 的表達(dá)強(qiáng)度為基準(zhǔn),各細(xì)胞因子的表達(dá)強(qiáng)度按下式計(jì)算：表達(dá)強(qiáng)度(相對(duì)系數(shù)) = 細(xì)胞因子A值/-actin A值相對(duì)系數(shù)> 0.1 為陽(yáng)性,未觀察

12、到陽(yáng)性電泳條帶或條帶位置不正確為陰性。統(tǒng)計(jì)處理時(shí)按< 0.1 計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ SD）表示，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素的方差分析, P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果PTTG在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞PTTG表達(dá)的電泳結(jié)果見(jiàn)附圖和表1。 從電泳圖及表達(dá)水平差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以看出，MM患者組PTTG的表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。Table 1. Expressions of PTTG in controls

13、 and MM patients (略)MM按不同M蛋白免疫學(xué)分型PTTG的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。按照M蛋白免疫學(xué)分型，PTTG在IgG型、IgA型、IgD和輕鏈型中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.554， P>0.05）。Table 2. Expressions of PTTG in different immunologic subtypes of MM (略)討論P(yáng)TTG是 Pei等4在垂體瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)化基因，在正常垂體細(xì)胞中不表達(dá)。但大量研究顯示，這一新基因在大多數(shù)正常成人組織只有弱表達(dá)，甚至檢測(cè)不到，而在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系，如乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤中表達(dá)明

14、顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，將PTTG cDNA的NIH3T3細(xì)胞做無(wú)胸腺裸鼠皮下種植，3周內(nèi)能誘發(fā)腫瘤形成。PTTG的過(guò)度表達(dá)能引起P53依賴性和非P53依賴性的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞非整倍體的形成5。腫瘤的發(fā)生是多基因多步驟下發(fā)生的，PTTG與大多數(shù)腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，PTTG在腫瘤形成過(guò)程中究竟和其它癌基因之間有何聯(lián)系尚待進(jìn)一步的研究。多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一個(gè)多因素參與的多階段惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，包括癌基因與抑癌基因在內(nèi)的多種基因結(jié)構(gòu)及功能的改變，基因的選擇性表達(dá)決定細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為相關(guān)。但MM發(fā)病的分子機(jī)制仍不清楚。PTTG作為一種新發(fā)現(xiàn)的癌基因，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生

15、發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵差異表達(dá)基因的分離和克隆，可以從分子水平進(jìn)一步闡明多發(fā)性骨髓瘤的分子機(jī)理，并為疾病的早期診斷和基因靶向治療提供理論依據(jù)。為了研究PTTG在MM中的表達(dá)情況及它們的關(guān)系，我們應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)33例MM患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞PTTG的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示： PTTG在MM中表達(dá)升高，明顯高于對(duì)照組，推測(cè) PTTG的過(guò)度表達(dá)可能與MM的發(fā)生有關(guān)。在我們的數(shù)據(jù)中分析中，PTTG在MM的IgG型、IgA型、IgD和輕鏈型不同M蛋白免疫分型中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)論尚有待于多中心大樣本資料證實(shí)。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)： PTTG的過(guò)度表達(dá)抑制了姐妹染色單體的分離，破壞細(xì)胞分裂，導(dǎo)致染色

16、體不穩(wěn)定性6。PTTG誘導(dǎo)腫瘤形成是由于姊妹染色單體不能分離，導(dǎo)致非整倍體的形成，進(jìn)而導(dǎo)致惡性克隆的形成。通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MM中存在多種染色體的異常，因而推測(cè)PTTG的過(guò)量表達(dá)可能參與了MM的發(fā)生。但PTTG的表達(dá)在MM發(fā)病中的具體機(jī)制，及其治療前表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系，目前尚不清楚，我們將繼續(xù)進(jìn)一步深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Dominguez A, Ramos-Morales F, Romero F, et al. hpttg, a human homologue of rat pttg, is overexpressed in hematopoietic neopl

17、asms. Evidence for a transcriptional activation function of hPTTG. Oncogene, 1998; 17:2187-21932 Wen CY, Nakayama T, Wang AP, et al. Expression of pituitary tumor transforming gene in human gastric carcinoma. World J Gastroenterol, 2004; 10:481-4833 Saez C， Pereda T， Borrero JJ， et al. Expression of hpttg proto-oncogene in lymphoid neoplasias, Oncogene, 2002; 21 : 8173-81774 Pei L, Melmed S. Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene(PTTG). Mol Endocrinlol , 1997; 11:433-4415 Yu R, Heaney AP, Lu W, et al. Pituitary tumor transforming gene causes aneu