多重耐藥大腸埃希菌基因分型及其與耐藥表型的關(guān)系

1、多重耐藥大腸埃希菌基因分型及其與耐藥表型的關(guān)系 作者：李彬， 黃心宏， 傅薔， 曹穎平， 潘玉紅【摘要】 目的 分析福州地區(qū)臨床分離的多重耐藥大腸埃希菌的基因型及其與細(xì)菌耐藥表型的關(guān)系。 方法 收集臨床分離的多重耐藥大腸埃希菌88株，采用KB法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，多重PCR法進(jìn)行基因分型。 結(jié)果 多重PCR法可將大腸埃希菌分為4個(gè)基因型，其中檢出D型42株，B2型17株，A型17株，B1型12株。4組基因型對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和妥布霉素的耐藥率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 多重耐藥大腸埃希菌對(duì)多種抗生素具有很高的耐藥性?；蚍中鸵灾虏⌒暂^強(qiáng)的B2型與D型

2、為主，應(yīng)采取相應(yīng)措施預(yù)防院內(nèi)感染。 【關(guān)鍵詞】 大腸桿菌O157;藥物耐受性; 聚合酶鏈反應(yīng);基因型;序列分析 大腸埃希菌是醫(yī)院感染最常見的革蘭陰性條件致病菌，可在醫(yī)院環(huán)境中長(zhǎng)期存在，尤其當(dāng)患者免疫力低下時(shí)，常引起泌尿系統(tǒng)、下呼吸道、胃腸道、手術(shù)切口及燒傷感染和菌血癥，病死率高。近年來(lái)醫(yī)院獲得性感染的發(fā)病率逐年上升，且由于抗生素的不合理應(yīng)用和耐藥基因的廣泛播散，大腸埃希菌對(duì)抗生素的耐藥問題日益突出，多重耐藥臨床分離株愈發(fā)常見。筆者對(duì)臨床分離多重耐藥大腸埃希菌進(jìn)行遺傳分型，以期獲得流行病學(xué)資料，便于進(jìn)一步研究。1 材料與方法1.1 菌株 收集檢驗(yàn)科2008年8月-2009年2月臨床分離的多重耐藥

3、大腸埃希菌共88株，標(biāo)本來(lái)源包括痰、尿液、膽汁、創(chuàng)面分泌物、血液等。多重耐藥菌定義為對(duì)任何不同三種類型以上抗生素耐藥的臨床分離株1。1.2 儀器及試劑 常規(guī)藥敏紙片氨芐西林每片10 g、氨芐西林/舒巴坦每片20 g、阿米卡星每片30 g、環(huán)丙沙星每片5 g、左氧氟沙星每片5 g、亞胺培南每片10 g、復(fù)方新諾明每片25 g、妥布霉素每片10 g、哌拉西林/他唑巴坦每片100 g/10 g、頭孢唑啉每片30 g、頭孢呋辛每片30 g、頭孢曲松每片30 g、頭孢他啶每片30 g、頭孢噻肟每片30 g、頭孢吡肟每片30 g、頭孢噻肟/克拉維酸每片30 g/10 g、頭孢他啶/克拉維酸每片30 g/1

4、0 g均購(gòu)自英國(guó)Oxid公司;基因分型引物、dNTP Mix(10 mmol/L)、Taq酶、瓊脂糖、Loading Buffer(6×)、Marker(100600 bp)均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。MH瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIORAD公司);全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(VITEK60型，法國(guó)梅里埃公司)。1.3 質(zhì)量控制 質(zhì)控菌株為衛(wèi)生部臨檢中心的大腸埃希菌ATCC 25922。1.4 方法1.4.1 菌株鑒定 采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定菌株。1.4.2 藥敏試驗(yàn) 采用KB法，判斷結(jié)果參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI標(biāo)準(zhǔn)2。1

5、.4.3 多重PCR 引物參照文獻(xiàn)3煮沸法提取細(xì)菌DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為總體積20 L，引物各為1 mol/L，dNTP Mix 200 mol/L，Taq酶2.5 U，模板2 L。循環(huán)參數(shù)為94 5 min94 30 s55 30 s72 30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后1次延伸時(shí)間為7 min。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。表1 多重PCR引物序列1.4.4 基因分型 根據(jù)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，按照?qǐng)D1進(jìn)行分型3：chuA、yjaA和TspE4.C2為多重PCR檢測(cè)的目標(biāo)基因; A、B1、B2和D分別表示大腸埃希菌的四個(gè)基因型.1.5 統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)處理、采用WHONE T4.0軟件分析數(shù)據(jù)。根據(jù)遺傳分型結(jié)果分為A、B1、B2、D四組，采用行列表資料的2檢驗(yàn)對(duì)藥敏結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 多重耐藥大腸埃希菌耐藥譜分析 多重耐藥大腸埃希菌除對(duì)亞胺培南全部敏感外;對(duì)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率<14%，可作為除亞胺培南之外的臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥首選;對(duì)其他常用抗生素的耐藥率均>60%;其中頭孢菌素、氟喹諾酮類耐藥率高達(dá)80%以上(表2)。表2 多重耐藥大腸埃希菌藥敏情況2.2 基因分型 采用多重PCR分析88株多重耐藥大腸埃希菌，根據(jù)PCR產(chǎn)物片段大小結(jié)

7、合圖1的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因分型得出結(jié)果(圖2)。本研究中的大腸埃希菌檢出D型占總數(shù)47.73%(42/88);其次為A和B2型，各占19.32%(17/88);B1型最少，占13.63%(12/88)，說明次實(shí)驗(yàn)收集到的多重耐藥大腸埃希菌中，大多數(shù)存在較強(qiáng)的致病力。2.3 不同基因分型的藥敏情況 將88株多重耐藥大腸埃希菌以不同基因型分為A、B1、B2、D 4組，并對(duì)其對(duì)15種抗生素的耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，4組對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和妥布霉素的耐藥率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A和B2型對(duì)阿米卡星的耐藥率為0，較B1和D更為敏感;B2和D型對(duì)頭孢他啶和頭

8、孢曲松的敏感性不如A和B1型;D型對(duì)頭孢噻肟最為敏感，B2對(duì)妥布霉素最敏感(表3)。表3 不同基因分型對(duì)藥物耐藥率比較3 討 論筆者采用文獻(xiàn)3方法對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行快速分型。該法快速、高效、準(zhǔn)確，可在很短的時(shí)間內(nèi)將大腸埃希菌分為4種主要的親緣群體，分別是A、B1、B2以及D型。Clermont等在對(duì)230株大腸埃希菌進(jìn)行基因分型時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌主要為B2型，其致病性最強(qiáng);其次為D型的致病性稍弱;而體內(nèi)共生的大腸埃希菌主要是A型3。本組多重耐藥大腸埃希菌中B2型占19.32%;D型檢出比例更高，占47.72%，表明在多重耐藥的大腸埃希菌中致病力較強(qiáng)的兩種亞型B2和D型共占67.04%，較國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的7

9、3%略低4。Zhang等人報(bào)道尿路感染的大腸埃希菌中B型占69%，并推斷腸道外感染的大腸埃希菌其約2/3為B2亞型5，與本研究中D型占多數(shù)的比例不同，可能是標(biāo)本組成不同造成差異，也可能是地區(qū)差異的緣故，因需進(jìn)一步研究。研究還發(fā)現(xiàn)，A型感染占19.32%，與B2型占的比例相同，由于此型常見于人體內(nèi)共生菌的亞型3，是否這些臨床分離菌屬于患者體內(nèi)共生菌異位感染還有待進(jìn)一步研究。本組多重耐藥臨床分離菌株藥敏結(jié)果顯示，其對(duì)大部分內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥，而對(duì)哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星敏感性較高;其中對(duì)亞胺培南的敏感性為100%。盡管亞胺培南對(duì)該組細(xì)菌具有高敏感性，但因其價(jià)格昂貴，臨床上并不將

10、其作為治療的首選用藥，因而臨床上可選用哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星作為經(jīng)驗(yàn)性用藥。結(jié)合基因分型研究與藥敏結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)各種基因型藥物敏感性存在一些差異，即多重耐藥大腸埃希菌的四種基因型雖然對(duì)大多數(shù)抗生素的耐藥情況大致相同，但腸外致病較強(qiáng)的B2型和D型在對(duì)三代頭孢類抗生素的耐藥性均較A型和B1型強(qiáng)。氨基糖苷類抗生素對(duì)需氧革蘭陰性桿菌具有強(qiáng)大的抗菌活力，但耐藥菌株可以通過鈍化酶破壞其分子結(jié)構(gòu)造成細(xì)菌耐藥。本組B2型較其他基因型對(duì)阿米卡星的敏感性較好，有待進(jìn)一步探究。通過根據(jù)基因分型結(jié)果能明確感染的病原生理學(xué)，判斷醫(yī)院感染或是感染復(fù)發(fā)6;明確不同基因型的親緣種群與毒力的關(guān)系，提示感染致病菌來(lái)源。腸道內(nèi)

11、或腸道外的感染與不同的基因片段相關(guān)5，并可作為篩選致病菌的工具，作為感染暴發(fā)的篩查和流行病學(xué)調(diào)查?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 戴自英. 多重耐藥菌感染在臨床上的重要意義J. 中華傳染病雜志, 1999,17(2);7778.2 Clinical and Laboratory Standads Institute. Performance standards for Antimicrobial susceptibility testing ;18th Informational Supplement S . 2008, M100S18.3 Clermont O,Bonacorsi S,Bingen E.

12、Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic groupJ. Appl Environ Microbiol, 2000,66(10):45554558.4 劉 玲,鄭 鈴,陳建玲. 福州市飲食行業(yè)從業(yè)人員腸道大腸埃希菌耐藥及產(chǎn)ESBL狀況J.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,42(1):6569.5 代杰志,陸 茜,蔡成松,等. 大腸埃希菌的分型研究J. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2008,20(5):443445.6 Zhang L X,Foxman B,Marrs C. Both urinary and rectal