全菌體滅活菌苗現(xiàn)狀和新策略

1、全菌體滅活菌苗現(xiàn)狀和新策略    摘要 對全菌體滅活菌苗（WCV）防治傳染病已進行了廣泛的研究，WCV是預(yù)防疾病的一種經(jīng)濟、安全、有效的方法，但WCV的缺點是，胃腸外免疫能引起不良反應(yīng)，而口服免疫常需大劑量，縣免疫力短暫。近期研究表明，能提高WCV免疫原性和增強口服免疫應(yīng)答的新方法極有希望提高這些菌苗的效力。 動物模型和人研究顯示，WCV口服或胃腸外免疫均具有免疫原性，也具有預(yù)防呼吸道、腸道和全身性細菌感染的效力。雖然僅百日咳WCV被普遍應(yīng)用，但其他WCV也具有普遍應(yīng)用的潛力。本文報道了WCV研制的進展，重點闡述了制備更優(yōu)質(zhì)菌苗制劑的可能性。 腸道菌苗

2、空腸彎曲菌 空腸彎曲菌是引起胃腸炎的主要原因，估計全世界每年發(fā)病4億多例。某些地區(qū)的罹患率高達2.5萬4萬/10萬。這種病原菌感染的主要后遺癥是Guillain-Rarré綜合征。一種傳統(tǒng)的空腸彎曲菌菌苗已在動物中進行試驗，這種菌苗（福馬林和加熱共同滅活，3劑）通過口飼給予小鼠，每劑間隔2天，并以大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT，25g）為佐劑。免疫后4周在口服攻擊模型中評估各種劑量的含和不含佐劑菌苗（105、107或109個細菌）的效力。用活空腸彎曲菌（108個細菌，100×半數(shù)定居量）攻擊動物，并監(jiān)測排菌情況。最大劑量菌苗和較小劑量含LT菌苗能預(yù)防定居，含或不含佐劑的菌苗均能

3、預(yù)防細菌全身播散。兩種配方的菌苗接種小鼠后，均檢得空腸彎曲菌特異性血清IgA和IgG升高，但僅在含LT菌苗免疫小鼠中檢得腸道IgA。 這種菌苗還在恒河猴中進行試驗。猴子間隔14天接種2劑1010空腸彎曲菌菌苗加0.51000gLT，未見不良反應(yīng)。部分動物在6周時接受1劑加強免疫。不管菌苗（福馬林滅活）是否含LT，接種者對空腸彎曲菌的特異性T細胞應(yīng)答均增強。由于初免程序后已獲得最大應(yīng)答，因此無需加強免疫。免疫后7天，IgA分泌細胞在含LT菌苗接種動物中增多。 第2種空腸彎曲菌菌苗已產(chǎn)生，目前正在進行期攻擊研究評估。這種菌苗是利用能生產(chǎn)“抗原增強”菌苗的營養(yǎng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（NST）技術(shù)制備的。制備菌苗所

4、用的細菌是通過專門方法培養(yǎng)的，其對INT-407和Ca-Co-2人腸上皮細胞的粘附力和侵襲力均增強，并在福馬林滅活前與剛果紅的結(jié)合力提高。這些表型被認為是空腸彎曲菌和其他腸道病原菌毒力和相關(guān)抗原表達的重要標志。為了獲得這些特征，可將細菌置于含0.1%脫氧膽酸鈉的腦心浸液肉湯中，37、10%CO2條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期。 用上述細菌制備的NST菌苗在動物中的免疫原性強于傳統(tǒng)方法制備的菌苗。NST菌苗免疫鼠腸道產(chǎn)生的抗原特異性IgA大于傳統(tǒng)菌苗免疫鼠?？诜琇T nST菌苗的雪貂產(chǎn)生的血清IgG水平比含佐劑傳統(tǒng)菌苗免疫雪貂高15倍。用同源泉空腸彎曲菌口飼攻擊雪貂，17%的NST菌苗免疫動物發(fā)病，而接受

5、傳統(tǒng)菌苗的動物的發(fā)病率達67%。 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是造成兒童嚴重脫水性腹瀉的最主要細菌，估計每年發(fā)病4億例，死亡70萬例。ETEC是造成旅游者腹瀉的主要原因，僅美國就影響800萬人。表達定居因子CFA/和CFA/的ETEC經(jīng)福馬林滅活制成的菌苗已在人中進行評估。間隔2周口服3劑含或不含霍亂毒素B亞單位（CTB）的菌苗（1011個細菌/劑，5個菌毛型），免疫后7天檢測外周血抗體分泌細胞（ASC）。對CFA/ cFA/和CFA/抗原產(chǎn)生應(yīng)答的細胞主要是產(chǎn)生IgA的ASC，其次是IgM-ASC，IgG-ASC極少。2劑后的免疫應(yīng)答最強。CTB不能增強對CFA/和CF

6、A/抗原的應(yīng)答。檢得對CTB產(chǎn)生應(yīng)答的IgA-ASC，IgG-ASC，未檢得IgM-ASC，盡管對CFA的局部IgA應(yīng)答極少與血清抗體水平的升高有關(guān)。在埃及進行的ETEC/重組CTB菌苗的研究中，74名2145歲成人間隔2周接受2劑菌苗或安慰劑。受試者對CTB、CFA/、CS4、CS2和CS1的外周血IgA b細胞應(yīng)答率顯著高于對照者。對滅活WCV產(chǎn)生強免疫應(yīng)答的發(fā)現(xiàn)是重要的，因為口服純化的定居因子誘發(fā)的免疫應(yīng)答微弱，且無保護作用。對菌苗的特異性T細胞應(yīng)答也進行了評估。從接種者分離的人外周血單個核細胞中觀察到中等度的CFA依賴性體 外增殖應(yīng)答，用定居因子體外刺激應(yīng)答細胞可產(chǎn)生高水平的干擾素（I

7、FN-），未檢得白細胞介素2（IL-2）。應(yīng)答細胞主要是CD4+T細胞，CD8+細胞較少。高水平IFN-的產(chǎn)生可能具有免疫學(xué)意義。IFN-能刺激B細胞分泌抗體，增加腸細胞分泌組分的表達。這種類型的應(yīng)答除產(chǎn)生IgA分泌細胞外，還能介導(dǎo)對ETEC攻擊的防御作用。 受試者還接種了由大腸菌素E2處理滅活的ETEC菌苗。這種滅活方法能殺死菌苗，且不為化學(xué)或加熱處理所改變。間隔1個月口服2劑此菌苗（3×1010個細菌）能在77%的接種者中誘導(dǎo)腸道抗CFA/IgA應(yīng)答，86%的接種者產(chǎn)生增強的抗LT igA應(yīng)答。接種者均能抵御同源和異源菌的攻擊。 李斯德菌 單核細胞增多性李斯德桿菌是一種食物傳播的

8、病原體，人群罹患率較低，但在易感人群中的死亡率很高。最常影響的人群是孕婦或其他免疫損害者。 加熱滅活的菌苗已在小鼠中進行評估。觀察到的保護性免疫應(yīng)答的標志是誘導(dǎo)細胞毒性T細胞和IFN-。在具有或缺少CD4+細胞的動物中均可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，通過有免疫力動物CD8+細胞的導(dǎo)入可把免疫力移至無免疫力動物。菌苗是用在胰酷胨豆胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜、經(jīng)70、60分鐘加熱滅活的細菌制備的。 沙門菌 在空腸彎曲菌檢測前，沙門菌是美國引起胃腸炎的主要細菌，腸炎沙門菌仍是重要的病因。傷寒桿菌是傷寒的主要病因，全世界每年發(fā)病3000萬例，死亡50多萬例。加熱滅活的鼠傷寒桿菌菌苗已在小鼠中進行試驗，細菌在盧氏肉湯中培養(yǎng)至

9、對數(shù)生長期，用沸水浴加熱45分鐘進行滅活。菌苗可經(jīng)腹腔（ip）或皮內(nèi)（id）途徑給予。ip接種鼠的淋巴細胞增殖應(yīng)答強于id接種鼠，但在免疫后42天降至相同水平。ip接種鼠脾細胞產(chǎn)生的IL-4和IL-2水平亦較高。此外，T細胞免疫印跡檢測顯示，ip接種動物能對不同分子大小的抗原產(chǎn)生應(yīng)答，而id接種鼠主要對18kDa的抗原產(chǎn)生應(yīng)答。 福馬林、酚、丙酮滅活的鼠傷寒桿菌菌苗也在小鼠、大鼠和小牛中進行試驗，小鼠免疫丙酮滅活的WCV產(chǎn)生抗脂多糖（LPS）和全菌體（WC）抗體。小鼠免疫野型光滑株或粗糙突變株（不能產(chǎn)生O抗原）制備的菌苗所獲得的保護作用無差異。抵御致死攻擊的短期保護作用與WC凝集滴度密切相關(guān)，

10、而長期保護作用與之無關(guān)。大鼠免疫福馬林滅活的菌苗能產(chǎn)生抗鼠傷寒桿菌抗體，且能抵御低水平的攻擊，但無胸腺大鼠卻不能，且能抵御低水平的攻擊，但無胸腺大鼠卻不能。用免疫動物的血清被動免疫無胸腺大鼠無效，而將免疫動物的脾細胞移給無胸腺大鼠則產(chǎn)生保護作用。這些研究提示，對菌苗的細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答在抵御攻擊時起重要作用。 志賀菌 志賀菌引起的痢疾在全世界均有發(fā)生，估計每年發(fā)病2.5億例，死亡65萬例。幾項早期研究報道，一種滅活WCV能預(yù)防志賀菌病。有關(guān)這些菌苗組分的資料極少，但需口服大劑量才能奏 效。其他途徑免疫有反應(yīng)原性，且保護作用極小。在痢疾爆發(fā)地區(qū)給予人群口服免疫，并在這些現(xiàn)聲研究中比較免疫人群與未免

11、疫人群的罹患率。雖然這些研究沒有很好的對照組，但顯然菌苗有一定的保護作用。菌苗效力不佳部分由于這些口服WCV中并不存在高水平的相關(guān)抗原和難以刺激對死菌的口服免疫應(yīng)答。 目前已制成NST福氏志賀菌菌苗，并在小鼠鼻攻擊模型中進行試驗。與制備傳統(tǒng)菌苗的細菌相比，制備種菌苗的NST細菌具有對人腸道細胞更強烈的粘附和侵襲力，能產(chǎn)生較高水平的毒力相關(guān)蛋白，且與剛果紅的結(jié)合水平提高。這種菌苗由福氏志賀菌2457T株構(gòu)成，2457T株被培養(yǎng)于含0.1%脫氧膽酸鈉的腦心浸液肉湯中，于37培養(yǎng)至對數(shù)生長早期，然后經(jīng)福馬林滅活。在凝集測定時，用NST培養(yǎng)的福氏志賀菌免疫家兔制備的兔超免疫抗血清能與同樣培養(yǎng)的宋內(nèi)志賀

12、菌發(fā)生交叉反應(yīng)。在小鼠模型中含LT的NST菌苗與EcSf2a-2減毒活菌苗的效力相同，且比傳統(tǒng)方法制備的WCV更有效。 霍亂弧菌 霍亂是由霍亂弧菌引起的，主要特征是嚴重的脫水性腹瀉，估計每年發(fā)病700萬例，死亡10萬多例。 已在動物和人中對霍亂WCV進行了大量 的研究，用堆亂WCV+CTB胃腸外免疫小鼠能抵御霍亂毒素（CT，2.253LD50）的攻擊，這與免疫CVD103-Hg減毒活菌苗的結(jié)果相同：分別有100%和70%的小鼠能抵御2.25和3LD50的CT攻擊。小鼠口服CT能誘生產(chǎn)生IgA應(yīng)答的外周血淋巴細胞（PBL）。胃腸外免疫2劑類毒素或滅活菌苗的家兔能抵御活菌的攻擊。胃腸外和口服途徑一

13、同給予類毒素和WCV均有協(xié)同作用和保護作用。 接種者間隔2周口服3劑菌苗（含加熱滅活的稻葉型和小川型霍亂弧菌、福馬林滅活的稻葉型和小川型ElTor弧菌各2.5×1010，有時含CTB），菌苗可被很好耐受，無副作用報告。口服2劑菌苗能誘導(dǎo)相似的IgA和IgG抗毒素和殺弧菌抗體應(yīng)答。 用1×106個霍亂弧菌攻擊，64%的WCV+CTB接種者獲得保護，56%的WCV接種者獲得保護，而對照組則90%發(fā)病。此外，發(fā)病的接種者的癥狀減輕。在孟加拉國的一項WCV現(xiàn)場研究中，2年內(nèi)WCV的有效率為60%。在免疫成人中，3年中預(yù)防古典型霍亂的有效率為58%76%，預(yù)防EITor型霍亂的有效率

14、為48%64%。菌苗在25歲兒童中的有效率為40%56%，但預(yù)防ElTor型霍亂的效果較差。免疫接種后亦可觀察到死亡率降低?；魜y菌苗含有與其他致病性弧菌發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原，但接種霍亂菌苗不能預(yù)防非霍亂弧菌感染，盡管接種組的罹患率較低。在CTB+霍亂弧菌全菌體（WC-BS）菌苗的現(xiàn)場試驗中，免疫接種后能短期預(yù)防ETEC引起的腹瀉。接受WC-BS菌苗的旅游者亦能預(yù)防ETEC引起的腹瀉及ETEC與其他病原體的混合感染。 還對口服霍亂菌苗的免疫應(yīng)答進行了評估。在瑞典志愿者中，在67%的口服單劑WC-BS菌苗者的腸灌洗液樣本中檢得升高的抗毒素IgA抗體，在93%的血清樣本和64%的唾液樣本中檢得升高的抗

15、毒素抗體，接種者對菌苗的應(yīng)答情況與恢復(fù)期病人相仿。在孟加拉國現(xiàn)場試驗期間，WCV和WCV+CTB接種者的殺弧菌抗體滴度升高1.32.1倍，免疫后7個月滴度有所回落，但保護作用可持續(xù)3年。接受1劑和3劑者的抗體滴度相近，但僅接受3劑者獲得保護。接受CTB+WCV接種者的抗毒素滴度升高2.54.5倍。在其他研究中，在接受WCV者中，71%的接種者的殺弧菌抗體、57%的接種者的抗LPS和外膜蛋白（OMP）抗體、43%的接種者的抗血凝素抗體滴度升高4倍以上。在接受WC-BS者中，89%的接種者的殺弧菌抗體、68%的接種者的抗LPS和OMP抗體、32%接種者的抗毒素滴度升高4倍以上。在564歲接種者中，

16、WCV+CTB均能顯著提高IgG和IgA抗毒素和殺弧菌抗體滴度，而在412歲的接種者中僅抗毒素滴度升高?？诜臀改c外接種WC-BS菌苗均能誘生抗霍亂毒素的各類IgG和IgA1抗體，與恢復(fù)期病人產(chǎn)生的抗體相仿。反復(fù)免疫能誘生高水平的抗毒素IgG4抗體。免疫后檢測接種者的PBL顯示，口服免疫后的PBL主要產(chǎn)生IgA抗體，而胃腸外免疫后則主要產(chǎn)生IgG抗體應(yīng)答，免疫后1年，接種者中存在產(chǎn)生抗毒素的PBL，且能產(chǎn)生以IgA和IgM同型為主的回憶應(yīng)答。 霍亂弧菌滅活菌苗的制備方法可按NST空腸彎曲菌菌苗的制備方法加以改進。將霍亂弧菌569B株培養(yǎng)于含膽汁或脫氧膽酸鈉的 蛋白胨牛肉浸膏培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)至對數(shù)生長早期，即其對人腸道細胞