高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血清中苯妥英、卡馬西平的濃度

1、    高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血清中苯妥英、卡馬西平的濃度        摘要：目的:建立HPLC法同時(shí)測(cè)定血清苯妥英（PHT）與卡馬西平(CBZ）濃度。方法:以C18反相柱為色譜柱，甲醇-水（5545）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；用乙酸乙酯作為提取劑。結(jié)果:PHT、CBZ平均回收率各為99.5%和100.5%,日內(nèi)和日間RSD均低于6.6%(n=5)；分析方法的定量測(cè)定下限：PHT為1.2 ?.ml-1，CBZ為0.2 ?.ml-1。分析方法的檢測(cè)下限：PHT為0.4

2、?.ml-1；CBZ為0.1 ?.ml-1。PHT在540 ?.ml-1 濃度范圍線性關(guān)系良好，r=0.998;CBZ在2.525 ?.ml-1 濃度范圍線性關(guān)系良好,r=0.998。結(jié)論:方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于PHT和CBZ臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。關(guān)鍵詞苯妥英；卡馬西平；血藥濃度；高效液相色譜法中分類(lèi)號(hào)：R969.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1001-5213（2000）11-0645-03 Determination of phenytoin and carbamazepine in blood serum by RP-HPLC with UV detectionCHEN LingLUO We

3、n-hongLI Hui(The Central Laboratories, Shantou University Medical College, Guangdong Shantou 515031)ABSTRACTOBJECTIVE：To develop an HPLC method for quantitative determination of phenytoin and carbamazepine in blood serum. METHODS：Blood serum samples were extracted with hexane to remove lipid and int

4、erfering substances , phenytoin (PHT) and carbamazepine (CBZ) were then extracted with ethyl acetate. The residues dissolved were analyzed with a reverse phase HPLC system (C18 column, 4.6 mm×250 mm; Mobile phase, MeOH-H2O( 5545); UV detection, 240 nm).RESULTS：The average recoveries for PHT and

5、 CBZ were 99.5% and 100.5%, respectively. The within-day and day-to-day relative standard deviations for both compounds were all smaller than 6.6% (n = 5). The calibration curves for both compounds had good linearity, r = 0.998 for PHT within a concentration range of 540 g.ml-1, and r = 0.998 for CB

6、Z within a concentration range of 2.525 g.ml-1. The limits of detection (LODs) for PHT and CBZ were 0.4 g.ml-1 and 0.1 g.ml-1, and the limits of quantitation (LOQs) for PHT and CBZ were 1.2 g.ml-1 and 0.2 g.ml-1, respectively.CONCLUSIONS：The method provides a sensitive, accurate, precise and reliabl

7、e analytical procedure for clinical monitoring of blood serum PHT and CBZ.KEY WORDSphenytoin;carbamazepine;serum concentration;HPLC為了提高臨床用藥的有效性和安全性，減少不良反應(yīng)，抗癲癇藥物如苯妥英和卡馬西平的血藥濃度監(jiān)測(cè)非常必要。用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定抗癲癇藥物已有不少報(bào)道，但流動(dòng)相多使用容易損耗儀器的磷酸緩沖液1或需昂貴的乙腈及改性劑2。樣品處理大都用乙腈或二氯甲烷沉淀蛋白或藥物的提取3.4，樣品中雜質(zhì)較多，干擾較大。我們將方法進(jìn)行改進(jìn)后，操作步驟簡(jiǎn)便

8、，樣品回收率高，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料1.1儀器惠普（HP）1090高效液相色譜儀（HPLC），配二極管陣列紫外檢測(cè)器（DAD）。1.2藥品和試劑苯妥英鈉(PHT)，卡馬西平(CBZ)均為Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸乙酯、正己烷、磷酸氫二鉀均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠提供；水為Milli-Q去離子超純水；正常人空白血清由汕頭市中心血站提供。2方法和結(jié)果2.1色譜條件色譜柱：Phenomenex® Luna5m C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為甲醇-水（5545），流速1 mlmin-1，柱溫40 ，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。2.2樣品處理

9、L-1磷酸鹽緩沖液200 l，加甲醇600 l，再加正己烷1.5 ml，旋渦振蕩1 min, 3 000 rmin-1 離心5 min。用細(xì)尖玻璃吸管吸棄上層正己烷，下層加1.0 ml超純水和1.5 ml乙酸乙酯，旋渦振蕩1 min，3 000 rmin-1 離心5 min，用細(xì)尖玻璃吸管小心將上層（乙酸乙酯）吸至另一干凈試管中，下層加乙酸乙酯再萃取一次。合并兩次乙酸乙酯萃取液，于50水浴中用氮?dú)獯蹈?，加?00 l甲醇和100 l超純水，溶解后進(jìn)樣10 l。2.3血藥濃度的定量每批實(shí)驗(yàn)前，精確配制含PHT 10 gml-1和CBZ 10 gml-1的正常人血清200 l，按樣品處理方法處理后

10、進(jìn)樣分析，以此作為定量標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算公式：樣品的濃度 = （樣品的峰面積÷標(biāo)準(zhǔn)的峰面積）× 標(biāo)準(zhǔn)的濃度2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線用甲醇配制濃度為1 mgml-1的PHT和1 mgml-1的CBZ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)藥物的有效血藥濃度范圍5，用正常人空白血清200 l配制成含藥物2.540 gml-1的血清樣品，其中PHT的濃度分別5, 10, 15, 20, 40 gml-1；CBZ的濃度分別2.5, 5, 10, 20, 25 gml-1 。按樣品處理程序處理后進(jìn)樣分析，以樣品的濃度為X，峰面積為Y, 得回歸方程：PHT：Y = 3.21X + 1.14, r = 0.998CBZ：Y =

11、19.81X + 3.13， r = 0.9982.5檢測(cè)下限和定量測(cè)定下限分析方法檢測(cè)下限（LOD）和定量測(cè)定下限(LOQ)：根據(jù)文獻(xiàn)6，LOD等于樣品空白加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差，；LOQ等于樣品空白加10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果，分析方法的定量測(cè)定下限：PHT為1.2 ?ml-1，CBZ為0.2 ?ml-1；分析方法的檢測(cè)下限：PHT為0.4 ?ml-1，CBZ為0.1 ?ml-1。2.6日內(nèi)誤差及回收率用正常人血清配制3個(gè)不同濃度的PHT、 CBZ血清樣品各5份，標(biāo)準(zhǔn)血清（PHT 10.34 gml-1、CBZ 10.10 gml-1)2份，經(jīng)樣品處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算其濃度值， 結(jié)果見(jiàn)表1。表 1測(cè)

12、定血清PHT和CBZ濃度的日內(nèi)誤差及回收率藥物加入量gml-1測(cè)得量RSD/%回收率/%±s，gml-1PHT5.174.99±0.122.396.510.3410.5±0.43.910120.6820.9±1.15.3101CBZ5.054.93±0.132.697.610.1010.4±0.43.710215.1515.4±0.95.91022.7日間誤差用正常人血清配制3個(gè)不同濃度PHT, CBZ的血清樣品各5份，保存于-20 冰箱，各濃度每天取一份進(jìn)行分析測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5 d，結(jié)果見(jiàn)表2。 表 2測(cè)定血清PHT和CB

13、Z濃度的日間誤差藥物加入量/gml-1測(cè)得量RSD/%±s，gml-1PHT5.175.4±0.46.610.3410.7±0.65.220.6822.5±1.25.3CBZ5.055.01±0.183.710.1010.4±0.44.315.1515.0±0.74.43討論 3.1樣品的預(yù)處理血清樣品需經(jīng)預(yù)處理后才能進(jìn)行色譜分析。文獻(xiàn)報(bào)道14.7大都采用二氯甲烷、乙腈等有機(jī)溶劑一次萃取或用甲醇沉淀蛋白后進(jìn)樣分析，雖然方法簡(jiǎn)捷，但其上清液中仍含有雜質(zhì)，血清中的脂溶性殘留物很難溶解于流動(dòng)相中，且對(duì)色譜柱造成污染，干擾PHT、C

14、BZ的測(cè)定。此外，進(jìn)口色譜柱十分昂貴。因此，我們先用正己烷萃取，去除血清中脂類(lèi)等雜質(zhì)后，再用乙酸乙酯萃取，這樣可明顯減少對(duì)色譜柱的污染，提高色譜柱的使用率。正己烷并不影響藥物的提取回收，實(shí)驗(yàn)證明，本方法的萃取回收率達(dá)95% 以上。3.2色譜條件我們選用甲醇-水(5545)作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。樣品處理后經(jīng)氮?dú)獯蹈?，再?00 l甲醇、100 l超純水重溶后進(jìn)樣，無(wú)須在流動(dòng)相中加入改性劑如正丁胺、乙二胺或冰醋酸等，而使PHT、CBZ分離良好，峰型窄而尖銳。本方法的LOD與LOQ遠(yuǎn)低于PHT與CBZ的有效血藥濃度范圍，完全適合于PHT與CBZ血藥濃度的定量測(cè)定。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道用內(nèi)標(biāo)法測(cè)

15、定，本文采用外標(biāo)法，其藥物回收率達(dá)100%左右，日內(nèi)和日間RSD低于6.6%，方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。陳玲（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室, 廣東 汕頭 515031）羅文鴻（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室, 廣東 汕頭 515031）李慧（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室, 廣東 汕頭 515031）張?jiān)矗ㄉ穷^大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室, 廣東 汕頭 515031）參考文獻(xiàn)：1邵志高,張宏文,張靜，等. 高效液相色譜法測(cè)定三種抗癲癇藥血濃度及其臨床應(yīng)用J.南京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,11(1):232徐家明,周愛(ài)華,劉思忠，等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血清中苯妥英、卡馬西平、苯巴比妥J.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1991,11(5):1953吳永麟,劉曉英,瞿治平.同時(shí)快速測(cè)定血清苯妥英與卡馬西平濃度的高效液相色譜法J.藥物分析雜志,1989,(5):2754杜國(guó)有,吳闖.同時(shí)測(cè)定血清中苯巴比妥、苯妥英及卡馬西平的反相高效液相色譜法J.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,20(1):215侯熙德主編.神經(jīng)病學(xué)M.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1995.18