骨骼肌特異性蛋白酶與蛋白降解

1、骨骼肌特異性蛋白酶與蛋白降解張 勇收稿日期： 基金項(xiàng)目: 國家自然科學(xué)基金 “鈣蛋白酶調(diào)控豬體蛋白降解的信號途徑研究”，編號30972112作者簡介: 張勇(1972-)，男，甘肅武威人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子營養(yǎng)學(xué)、飼料生物技術(shù)的研究。Emai: syndzhy 鄧 科2(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽 110866; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866)摘 要：骨骼肌特異性蛋白酶（calpain-3,p94,CAPN3）是鈣蛋白酶系統(tǒng)的一員，與肌細(xì)胞生成和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，同時(shí)也被認(rèn)為參與了蛋白降解過程。本文主要從骨骼肌特異性蛋白酶的結(jié)構(gòu)功能和生理活性，

2、并結(jié)合近年來國際上的研究成果來分析骨骼肌特異性蛋白酶在骨骼肌蛋白降解中的作用。關(guān)鍵詞：骨骼肌特異性蛋白酶;肌聯(lián)蛋白;蛋白降解骨骼肌特異性蛋白酶calapin-3（p94,CAPN3）是鈣蛋白酶（calpains）的一種。Calpain-3并不是肌肉生長所必須的蛋白酶，卻在維護(hù)肌肉完整性中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。鈣蛋白酶在骨骼肌中主要存在于Z線處，calpain-3在骨骼肌中與肌聯(lián)蛋白（titin）緊密結(jié)合在一起。肌聯(lián)蛋白有將粗肌絲與Z線相連，維持肌原纖維（myofibril）的完整性和穩(wěn)定性的功能，同時(shí)肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白（nebulin）是N2線（N2 line）的組分。肌原纖維蛋白降解的第一

3、步必須是肌原纖維分解成肌絲，超微結(jié)構(gòu)研究表明N2線是宰后鈣蛋白酶最先降解的結(jié)構(gòu)之一。因此本文依據(jù)近年來國際上的研究來討論Calpain-3在骨骼肌中的功能和作用。1 骨骼肌特異性蛋白酶的結(jié)構(gòu)鈣蛋白酶主要由兩種廣泛存在的鈣蛋白酶（ubiquitous calpains）：-鈣蛋白酶(-Calpain，Calpain-1)和m-鈣蛋白酶(m-Calpain，Calpain-2)，及骨骼肌特異性鈣蛋白酶（Calpain-3，p94）組成。前兩者都由2個(gè)亞基組成，分子量相近，但兩者表現(xiàn)最高活性所需的鈣離子濃度不同，前者為微摩爾級（112 mol/L），后者為毫摩爾級（250750 moL/L），Cal

4、pain-3與前兩者結(jié)構(gòu)相似。通過不同來源的鈣蛋白酶cDNA序列可以發(fā)現(xiàn)calpain-1和calpain-3大亞基均由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（見圖1），兩者均包含域，和，域是N-末端域，域是蛋白水解的區(qū)域，域的功能未知，域是由四個(gè)EF手組成的主要的鈣離子結(jié)合域。Calpain-3有三個(gè)額外的插入?yún)^(qū)域，即NS區(qū)，與前肽IS1區(qū)和結(jié)合肌聯(lián)蛋白的IS2區(qū)。圖1 骨骼特異性蛋白酶calpain-1和calpain-3的結(jié)構(gòu)Fig.1 Schematic of calpain-1 and calpain-3 proteins2 骨骼肌特異性蛋白酶的活性 研究表明1，全長度的calpain-3是沒有活性的，它必

5、須自溶（即水解自身）刪除IS1區(qū)（被認(rèn)為是前肽）以獲得活性（見圖1）。這個(gè)自溶過程需要鈣離子的參與2。自溶后，獲得一個(gè)可以與底物和抑制劑結(jié)合的酶活性位點(diǎn)3。通過蛋白質(zhì)電泳與免疫印跡實(shí)驗(yàn)4，可以觀察到自溶后全長度為94 kDa的蛋白，依據(jù)鈣離子濃度和時(shí)間不同，可進(jìn)一步分解成60，58和/或55 kDa的產(chǎn)物（用抗體定向到IS1區(qū)C-端）。Calpain-3在體內(nèi)最初是以它的降解形式（即有活性形式）被發(fā)現(xiàn)的，它在轉(zhuǎn)錄后會立刻自溶，因此難以提取5，目前有研究顯示4-6,calpain-3在骨骼肌細(xì)胞中低鈣離子濃度下（2.5 mol/L）與calpain-1相比在一段時(shí)間內(nèi)更穩(wěn)定。與廣泛存在的鈣蛋白酶

6、不同的是內(nèi)源性鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastain）及其它的外源性抑制劑如亮肽酶素和鈣蛋白酶抑制劑和等，對calpain-3的IS1區(qū)裂解是沒有抑制效果的3。 另外，除了通過分子內(nèi)和分子間方法水解自身外，calpain-3還沒有其它明確的內(nèi)源性底物3-7。通過確定calpain-3的生理學(xué)底物來說明它在在骨骼肌中的生理作用是很重要的。應(yīng)該指出的是calpain-3水解的目的可能不是參與一個(gè)降解過程，更可能是一個(gè)根據(jù)底物的功能不同而在一定程度上進(jìn)行的不可逆的調(diào)節(jié)過程7。如在2A型肢帶肌營養(yǎng)不良癥(LGDM2A)中肌肉營養(yǎng)不良的癥狀可能是因?yàn)榧」?jié)重塑失調(diào)，這也可以歸根于缺乏calpain-3的蛋

7、白水解底物8。很多蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中被證明可能是calpain-3的底物，但在體內(nèi)還沒有被證明。這些底物包括肌原纖維/Z線蛋白，肌聯(lián)蛋白(在PEVK區(qū)，與N2A線相鄰)，肌動蛋白C和肌球蛋白輕鏈1 等9支持calpain-3在肌節(jié)重塑中發(fā)揮作用。但有研究發(fā)現(xiàn)10，鈣蛋白酶抑制蛋白也可以在體外裂解calpain-3，而在體內(nèi)卻暫未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，所以那些經(jīng)過體外驗(yàn)證底物在體內(nèi)是否也會有相同的作用仍有待驗(yàn)證。最新研究指出11-12，calpain-3的mRNA豐度與蛋白水平表達(dá)量間可能是沒有相關(guān)性的，因此，研究在體內(nèi)全長度表達(dá)的calpain-3，必須通過更多的蛋白水平上的實(shí)驗(yàn)，獲得其與生理功能相關(guān)的

8、數(shù)據(jù)后才能準(zhǔn)確的進(jìn)行分析。3 骨骼肌特異性蛋白酶的功能和作用 Calpain-3可能在肌肉中修復(fù)和維護(hù)中起作用13，同時(shí)它也被指出參與了肌細(xì)胞生成14和細(xì)胞凋亡15-16。Calpain-3是肌肉成熟的關(guān)鍵，生理學(xué)研究顯示17，如果它不存在或不起作用，那么會在人20-40歲時(shí)患上2A型肢帶肌營養(yǎng)不良癥（LGMD2A）。因此，假定與此病相關(guān)的鈣蛋白酶都被降解和破壞，鑒于人在10歲前不患上LGMD2A，那么calpain-3就不可能是正常肌肉生長所必需的蛋白，確切的來說，它在維護(hù)肌肉完整性中有至關(guān)重要的作用13。的確，有實(shí)驗(yàn)證明18，在肌肉細(xì)胞培養(yǎng)中，只有在成肌細(xì)胞的增殖和融合后，全長度的calp

9、ain-3才開始表達(dá)。另外，在小鼠骨骼肌中缺乏calpain-3和轉(zhuǎn)基因小鼠的calpain-3過量表達(dá)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中19-20均不出現(xiàn)明顯疾病癥狀，而肌營養(yǎng)不良癥與肌炎（MDM）是一個(gè)人類疾病脛骨肌萎縮癥和LGMD2J的小鼠模型21，是由calpain-3與N2A在肌聯(lián)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)相鄰域的基因突變造成的。在MDM小鼠中，降低calpain-3表達(dá)濃度21和小鼠中calpain-3的表達(dá)過量22卻會導(dǎo)致更嚴(yán)重的肌肉營養(yǎng)不良的疾病癥狀。根據(jù)這些研究結(jié)果，有人猜測22，calpain-3的活性可能通過它與肌聯(lián)蛋白在N2A線的連接位點(diǎn)而被調(diào)控，這也許可以合理解釋calpain-3轉(zhuǎn)基因動物的健康狀況

10、。此外，calpain-3已被證明通過調(diào)節(jié)核因子IB參與了細(xì)胞凋亡16-23。4 骨骼肌特異性蛋白酶與蛋白質(zhì)降解除了鈣蛋白酶系統(tǒng)蛋外白質(zhì)降解的主要調(diào)節(jié)途徑還有溶酶體途徑，線粒體蛋白酶系統(tǒng)，泛素-蛋白酶體途徑，胞液蛋白酶水解途徑。但Calpains參與肌原纖維蛋白降解卻是蛋白質(zhì)降解過程中的限速步驟，也是家畜屠宰后早期發(fā)生肌肉嫩化的主要特征。而肌原纖維蛋白降解的第一步必須是肌原纖維分解成肌絲。肌聯(lián)蛋白是一個(gè)大型的肌節(jié)蛋白，主要存在于心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中24-25。肌聯(lián)蛋白的N端錨定在Z線，C端綁定粗肌絲，因此具有維持肌原纖維的完整性和穩(wěn)定性的功能。同時(shí)，肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白是N2線的組分，超微結(jié)

11、構(gòu)研究25-26表明N2線是宰后鈣蛋白酶最先降解的結(jié)構(gòu)之一。Calpain-3與肌聯(lián)蛋白緊密結(jié)合在一起，且其與N2A線的連接位點(diǎn)有可能能夠調(diào)節(jié)它的活性。同時(shí)在體外試驗(yàn)中肌原纖維/Z線蛋白，肌聯(lián)蛋白等均是calpain-3的底物，雖然尚未被在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明。根據(jù)這些可以猜測，在calpains參與的肌原纖維蛋白降解過程中，全長度的calpain-3受到鈣離子濃度和它與肌聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)控，降解成94kDa的活性形態(tài)，并參與肌動蛋白降解，促進(jìn)粗肌絲的釋放，從而加速蛋白降解過程，與此同時(shí)，Calpains的其它成員也會降解肌原纖維的肌節(jié)，釋放肌絲并降解為小片段，然后被溶酶體所捕獲進(jìn)一步降解。但肌原

12、纖維在體內(nèi)是否仍為calpain-3的底物及calpain-3與肌聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制不明，因此具體情況仍需要在通過實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。5 結(jié)語 骨骼肌生長速度最終取決于骨骼肌細(xì)胞的數(shù)量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、飼料添加劑的使用、營養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)管理等都能通過調(diào)節(jié)以上三個(gè)基本因素而影響整體蛋白質(zhì)的沉積速度，從而影響肌肉生長速度。至今為止，calpain-3已被發(fā)現(xiàn)有20余年，仍沒有對其生理功能的明確闡述，而國際上對其研究主要集中于它本身的生理結(jié)構(gòu)及其與肌肉運(yùn)動和營養(yǎng)相關(guān)的功能，很少有針對其在肌肉蛋白質(zhì)降解方面的研究。曾有實(shí)驗(yàn)27-28研究通過調(diào)整飼料中的蛋白濃度和方法來影響鈣蛋白酶

13、的表達(dá)量，從而提高肉品質(zhì)，但主要集中于廣泛存在的鈣蛋白酶和其內(nèi)源性抑制劑，對calpain-3的研究卻不多。因此，若是能明確calpain-3在蛋白質(zhì)降解過程中所起的作用并對其調(diào)控，從而提高肉品質(zhì)，必定能夠提高畜牧業(yè)的生產(chǎn)效益，也會為鈣蛋白系統(tǒng)的研究提供大量的科研數(shù)據(jù)。參考文獻(xiàn)1 Rey MA, Davies PL. The protease core of the muscle-specific calpain, p94, undergoes Ca2+-dependent intramolecular autolysisJ, FEBS Lett, 2002, 532: 401406.2 Ga

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