腎上腺髓質(zhì)素抑制溶血磷脂酸的促平滑肌細胞增殖作用

1、腎上腺髓質(zhì)素抑制溶血磷脂酸的促平滑肌細胞增殖作用摘要目的和方法：在培養(yǎng)的家兔血管平滑肌細胞上，觀察了腎上腺髓質(zhì)素(Adm)對溶血磷脂酸(LPA)誘導(dǎo)的DNA合成和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性途徑激活的影響。結(jié)果：LPA使3H-TdR摻入和MAPK活性增加，Adm對基礎(chǔ)水平的MAPK活性和3H-TdR的摻入并無顯著影響，但Adm對LPA刺激3H-TdR摻入和MAPK活性具有抑制作用。結(jié)論：Adm和LPA相互作用參與血管平滑肌細胞增殖的調(diào)節(jié)。主題詞肌，平滑，血管；細胞；家兔 Adrenomedullin inhibits the lysophosphatidic acid-induced p

2、roliferation of vascular smooth muscle cellsWANG Xiao-Hong,SU Jia-Lin,LI Xia,AN Guo-Shun,AN Song-Zhu, TANG Jian,TANG Chao-Shu,WANG Shu-Heng,LIU Nai-KuiInstitute of Cardiovascular Basic Research,Beijing Medical University,Beijing(100083)AbstractAIM and METHODS:The effect of adenomedullin(Adm) on lyso

3、phosphatidic acid(LPA)induced DNA synthesis and mitogen-activated protein kinase(MAPK) activity in cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs) of rabbit was observed.RESULTS：LPA enhanced the cultured VSMCs 3H-TdR incorporation and increased MAPK activity concurrently. Adm could not affect basal MAP

4、K activity or 3H-TdR incorportion,but inhibit LPA-induced 3H-TdR incorporation and MAPK activity in a concentration-dependent manner.CONCLUSION：The action between Adm and LPA may play an important role in regulating the proliferation of VSMCs.MeSHMuscle,smooth,vascular;Cell;Rabbits血管平滑肌細胞(vascular s

5、mooth muscle cells,VSMCs)增殖在高血壓、動脈粥樣硬化和血管形成術(shù)后再狹窄等心血管疾病中具有重要發(fā)病學(xué)意義，確切增殖機理目前尚未完全闡明，已知受到體內(nèi)多種神經(jīng)-內(nèi)分泌因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)所控制1。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是近年新發(fā)現(xiàn)的磷脂類信號分子，心血管組織富含其受體，本室實驗表明LPA是VSMC的強效絲裂素原，促增殖作用與激活細胞內(nèi)絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑有關(guān)。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,Adm)是強效舒血管肽，具有抑制血清、生長因子和內(nèi)皮素等

6、激活MAPK和促進平滑肌細胞增殖的作用2。本工作在培養(yǎng)的家兔血管平滑肌細胞上，觀察Adm對LPA誘導(dǎo)的DNA合成和MAPK途徑激活的影響，以認識Adm與LPA對VSMC增殖調(diào)節(jié)的相互作用。材料與方法大耳白兔由軍事科學(xué)院動物中心提供；18：1-LPA為Sigma產(chǎn)品；Adm由Phoenix Pharmaceutical,Znc(USA)惠贈；32P-ATP購自Dupont NEN(111 TBqmmol)；MAPK單克隆抗體為Zymed Lab Inc產(chǎn)品；EMEM培養(yǎng)基，髓磷脂化堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)為Sigma產(chǎn)品。余為市售分析純產(chǎn)品。1.VSMC培養(yǎng)：

7、取3月齡大耳白兔胸主動脈，以貼塊法3在37通有95%空氣的含有20%小牛血清的EMEM培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，實驗用第四代細胞，按5105cell孔接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h,用無血清EMEM液再孵育24 h，按下列不同藥物進行實驗。實驗分組：(1)對照組：不加特殊試劑；(2)LPA組：加LPA 10-8molL；(3)Adm組：加Adm 10-7molL；(4)LPA+Adm組：在加入10-8molL LPA基礎(chǔ)上，分別加入10-9、10-8、10-7molL Adm.2.DNA合成測定4：按上述分組加入不同藥物孵育4 h后，加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine,3H-

8、TdR)1.85104Bq孔，再孵育10 h。冷PBS液終止反應(yīng)，在Millipore 儀器上經(jīng)微孔濾膜(0.45m)收集并洗凈細胞，濾膜干燥后加入閃爍液，在閃爍計數(shù)儀上測定3H放射活性。3.MAPK活性測定：參照本室以前報告的方法5，按前述分組加入不同藥物后孵育10 min，用冷PBS液洗滌細胞，加入細胞溶解液并超聲破碎細胞，細胞溶解液與按MAPK的單克隆抗體孵育提取免疫復(fù)合物以MBP為底物，加入-32P-ATP始動反應(yīng)，用濾紙(P81phosphocelluse)測定MAPK活性。6次實驗每次進行雙平行孔操作，結(jié)果以s表示，方差分析組間q檢驗作統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果一、腎上腺髓質(zhì)素抑制溶血磷脂酸

9、誘導(dǎo)的3H-TdR摻入：在對照組，培養(yǎng)VSMC 3H放射性活度為7563105 counts.min-1孔，10-8molL LPA可使VSMC 3H-TdR摻入增加34%(P0.01)，LPA分別與10-9，10-8，10-7molL Adm合用時，VSMC3H-TdR摻入較LPA單用時分別低9%(P0.05)，12%和17%(P分別0.05和0.01)。單用Adm 10-7molL對3H-TdR摻入無明顯影響(7020940 counts.min-1孔，與對照組比較，P0.05)。結(jié)果如1所示。Fig 1Effect of Adm on LPA-induced 3 H-TdR incorp

10、oration in cultured rabbit VSMC(s，n=6) *P0.01 vs control; #P0.05,P0.01，vs LPA；AAdrenomedulin1腎上腺髓質(zhì)素對溶血磷脂酸誘導(dǎo)的兔血管平滑肌細胞3H-TdR摻入的影響二、腎上腺髓質(zhì)素抑制溶血磷脂酸誘導(dǎo)的絲裂素活化蛋白激酶激活：在對照組，MAPK活性為(2157105) counts.min-1孔，10-8molL LPA可使MAPK活性增加49%(P0.01)，LPA(108mol/L)與109、108、107molL Adm合用時，MAPK活性分別降低11%(P0.05)、32%和67%(P分別0.05和

11、0.01)。單用Adm10-7molL對MAPK活性無明顯影響(199713 counts.min-1孔，與對照組比較P0.05)。結(jié)果如2所示。Fig 2Effect of Adm on LPA-induced MAPK activation in cultured rabbit VSMC(s,n=6) *P0.01 vs control；P0.05，#P0.01，vs LPA2腎上腺髓質(zhì)素對溶血磷脂酸誘導(dǎo)的兔血管平滑肌細胞MAPK活性的影響討論LPA由膜磷脂經(jīng)過磷脂酶D和磷脂酶A降解生成，是血清中的正常成分，主要以結(jié)合蛋白的形式存在。血液中LPA主要來源于活化的血小板，也可由成纖維細胞和V

12、SMC受刺激后產(chǎn)生。LPA具有促平滑肌收縮和增殖作用，其絲裂原效應(yīng)通過MAPK途徑介導(dǎo)6。MAPK途徑是細胞外信號引起細胞增殖、分化等核反應(yīng)的共同途徑或會聚點。興奮G蛋白偶聯(lián)受體的物質(zhì)和激活酪氨酸激酶的物質(zhì)刺激細胞分裂時，都要通過激活MAPK，使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達水平。最近發(fā)現(xiàn)Adm可以抑制他們的絲裂素作用2。本工作發(fā)現(xiàn)，LPA促進平滑肌細胞增殖，表現(xiàn)為3H-TdR摻入、MAPK活性增加，與文獻報道一致7。VSMC富含Adm受體，血管內(nèi)皮細胞是血漿和血管組織Adm的主要來源，通過循環(huán)分泌和旁分泌方式不僅調(diào)節(jié)血管張力，而且調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖。本工作發(fā)現(xiàn)，Adm對VSMC基礎(chǔ)水平的M

13、APK活性和3H-TdR摻入并無明顯影響，但Adm對LPA刺激的3H-TdR摻入和MAPK活性具有抑制作用。有報道，Adm通過第二信使cAMP發(fā)揮作用。推測cAMP促進蛋白激酶A激活從而抑制Ras到Raf-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而阻斷MAPK的激活抑制平滑肌細胞增殖8。Adm與LPA相互作用對VSMC增殖調(diào)節(jié)的生理、病理生理意義值得進一步研究。作者單位：北京醫(yī)科大學(xué)心血管基礎(chǔ)研究所(北京100083)參考文獻1Schwartz SM,Majesky MW,Murry CE.The intima:development and monoclonal responses to injury.Athero

14、sclerosis,1995,118(Supple):S125.2李田昌，田青，趙東，等.腎上腺髓質(zhì)素抑制內(nèi)皮素的促平滑肌細胞增殖作用.高血壓雜志，1996，4：171.3Hirata Y,Taragi,Takata S. CGRP receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1988,15:1113.4李田昌，龐永政，唐朝樞，等.絲裂素活化蛋白激酶活性測定.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1996，16：155.5李田昌，佟利家，龐永政，等.絲裂素活化蛋白激酶參與內(nèi)皮素刺激的兔主動脈平滑肌細胞增生.生理學(xué)報，1996，48：337.6Tokumura JA,Limori M,Nishioka Y,et al.Lysophophati