種酶的測定--關(guān)松蔭資料

1、cellulase纖維素酶1分析意義 纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壊的碳水化合物的重 要組分之一“在纖維素酶作用下它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖。在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖。所以，纖維素酶是 碳素循環(huán)中的一個(gè)重要酶。臨方法選擇及原理在纖維素酶參與下，纖維素最終水解生成葡萄糖。測定土壊纖維素酶主要有以下幾種方法t測定加到土壞中的 纖維素物質(zhì)（布.紙等）的重量變化（剩余量”根據(jù)纖維素水解 產(chǎn)物葡萄糖與某些物質(zhì)（蔥酮、二硝基水楊酸生成著色化 合物進(jìn)行比色測定*測定加入土壤的纖維素物質(zhì)的質(zhì)變化，如粘 度法（纖維素分解時(shí)，溶液粘度降低，用粘度計(jì)測定人Reese（1951）曾把纖維素酶分為&酶（

2、用不溶纖維素作基 質(zhì)）和Cx酶（用可溶性拔甲基纖維素作基質(zhì)人測定纖維素酶選 用的緩沖體系包括磷酸鹽緩沖液（pH55或6.8幾 醋酸鹽緩沖液 （PH5.5J和檸樣酸鹽磷馥鹽緩沖液（pH55）。蕙酮比色法1試劑配制（1）1%敷甲基纖維素溶液。<2）甲苯。（3 ） PH5.5醋酸鹽緩沖液口（4 ）鋁鉀磯。（5 ）恿酮試劑豈0.2%恵酮溶液（用95%濃HaSO4配制片 往5 mt水中加入100ml濃H2SO4,冷卻后加入200ml恿輒 于冰上放置4嘉試劑不穩(wěn)定，需用前配制。（6）標(biāo)準(zhǔn)葡萄憐濬液1ml標(biāo)準(zhǔn)液含10200嚴(yán)號葡萄糖九 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶戒2.5ml移于 耐熱試骨

3、中*將試管戲置在冰上.緩加5 ml恿酮試劑，搖勻后置于沸水浴中加熱lOmin,加熱前于試管口放一小玻璃球。取下冷 卻后,于分光光度計(jì)上54062(Mrn處比色測定。以光密度值為 縱坐標(biāo)，以葡萄糖浹度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2操作步驟 取土壤置于50ml三角瓶中，用E5ml甲 苯處理并加5ml酷酸鹽緩沖液(pH55)° 15min后，再加入5 mH%竣甲基纖維素溶液。然后將三角瓶放在37力恒溫箱中，培養(yǎng) 72h。培養(yǎng)結(jié)束后，將瓶加熱至1009以終止反應(yīng)。為使未水解的 按甲基纖維素絮凝和沉淀，再加入03g鉛鉀磯。過濾后移于50 ml容量瓶中定容。取2,5ml此液移于耐熱試管中加5ml蔥酮

4、試 劑，再按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法步驟進(jìn)行比色。每一試驗(yàn)處理均應(yīng) 設(shè)置以5ml水代替基質(zhì)的對照，為檢驗(yàn)試劑純度應(yīng)設(shè)無土壤的對 照。纖維素酶活性，以72h后，10g 土壤生成的葡萄糖的毫克數(shù) 表示。硝基水楊酸比色法試劑配制<1)1%拔甲基纖維素溶液。(2 ) pH55磷酸鹽緩沖液，由0.06MKH2PO4和NaJIPO. 唇液混合制成。(3) 甲苯。(4) 3, 5二硝基水楊酸溶液(見蔗糖酶測定)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液ln)l移于 25ml容量犧中，加3ml二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水 簾上5mim然后迅速冷卻3min。定容,i5min后在分光光度計(jì)上于波長540n

5、m處比色測定。以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖 濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2操柞步驟 稱10g 土壤置于50wI三角瓶中,加20ml 1 % 敷甲基纖維素溶液.5nil pH55磷酸鹽緩沖液及1.5ml甲苯，將三角瓶放在379恒溫箱中培養(yǎng)72ho培養(yǎng)結(jié)束后，過濾并定容25ml0取1 ml濾液，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測定。設(shè)置對照要求同蔥酮比色法。纖維素酶活性，以72h, 10g 土攘生成筋荀糖毫克數(shù)表示。sucrose invertase蔗糖轉(zhuǎn)化酶（1蔗糖IS1分析童義蔗糖酶是根據(jù)其酶促基質(zhì)蔗糖而得名的。艾叫轉(zhuǎn)化酶或B-咲晡果糖甘酶。它對増加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)起著重嬰的作用。研究證明，蔗

6、糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性。 如與土壤有機(jī)質(zhì).氮*磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)。-般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越強(qiáng)。它不僅於夠表征土壤生物學(xué)活性強(qiáng)度，也可以做為評價(jià)土壤熟化程度和土壤肥力水平的一個(gè)指標(biāo)。簽方法選擇及原理蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果 糖。蔗糖酶活性的測定方法有用酶學(xué)的方法測量所產(chǎn)生的葡萄糖 滴定法或重量法或是根據(jù)蔗糖的非還原性，用生成物（葡蔔糖和果糖/能夠還原菲林整液中的銅，再根據(jù)生成的氧化亞銅的員求出糖的含量°也可根據(jù)蔗糖水解的生成物與某種物質(zhì)（3,5 二硝基水暢酸或磷酸銅）生成的有色化合物進(jìn)行比色測定。還有 一種方法，根據(jù)蔗糖液酶促反應(yīng)前后光偏振

7、面的變化（旋光法） 進(jìn)行測定？目前，我國常用的主要是硫代硫酸鈉滴定法，它是測定土壤 蔗糖酶活性的經(jīng)典方法。3,5二硝基水楊酸比色法重現(xiàn)性較好， 且手續(xù)較簡便，適于成批樣品測定。測定土壤蔗糖酶活性時(shí)，均以蔗糖為基貞，蔗糖液濃度范圍 為5-20%o在酸性介質(zhì)中，蔗糖酶活性最大。為保持該酶最適pH,多使用下列緩沖液，醋酸鹽緩沖液pH45-55，磷酸 鹽緩沖液（pH4955片 醋酸鹽一磷酸鹽緩沖液（pH55。比色法（1）1試劑配制（1）3,5-二硝基水楊酸溶液；稱05g二硝基水楊酸，溶 于20ml 2N氫氧化鈉和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水 稀釋至100ml （不超過7天兒（2）pH55磷

8、酸緩沖液：1/I5M璘酸氫二鈉（11.867gNa.HPO42HQ溶于11蒸愜水中0>5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9078g KH2PO4溶于H蒸憎水中95ml即成。（3）8%蔗糖溶液。（4甲苯。（5）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，將葡萄糖先充50-58沁條件下， 真空干燥至恒重。然后取500 mg溶于100 ml苯甲槪溶液中（5 mg還原Sf/ml）,即成標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。再用標(biāo)準(zhǔn)液制成1 ml含 0.01O.5iug葡萄糖的工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取lml不同濃度的工作液，并按與測定蔗糖酶活性同樣的方法進(jìn)行顯色，比色后以光密度值為縱座標(biāo)，葡萄糖濃度為橫座標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。2操作步驟 稱5g風(fēng)干土，

9、置于50ml三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH55隣酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物 后,放入恒溫箱，在37P下培養(yǎng)24h°到時(shí)取出，迅速過濾。從中吸取濾液1D11,注入50ml容量瓶中，加3ml 3,5二硝基水楊酸，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min,隨即將容量瓶移至自來水 流下冷卻3mino溶液因生成3 氨基-5 硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸 憎水稀釋至50ml,并在分光光度計(jì)上于渡長508nm處進(jìn)行比 色。為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土 樣需做無基質(zhì)對照，整個(gè)試驗(yàn)需做無土壤對照。3結(jié)果計(jì)算 蔗糖酶活性以24h后土壤葡萄糖的毫克數(shù)表 示。葡萄糖(毫克

10、=a x 4式中a從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖毫克數(shù)4換算成lg 土的系數(shù)比色法C2)厶試劑配制(1) 20%蔗糖。(2) 甲苯。PH5.5醋酸鹽緩沖液:取120ml冰醋酸用水稀釋至lL(a), 取164莒無水CHsCOONa溶于水并稀釋至lL(b)o將(a與(b) 二液按1 : 8混合再用電位計(jì)校正pH。(4) 0.2M Na2HPO4*12H2OQ <5)鉗溶液：配制5%鉗酸錢水溶液(a),再取200ml濃ESO加800ml水(b)Q使用前將(a), (b)二液按1 ： 1混合。(6) 銅試劑：取50gCuSO4-5H O溶于500ml水中(a),取 25gNa2CO 25g酒石酸鉀鈉、2

11、0gNaHCO3和20臨恥於0幡于 水并稀釋至1L再加幾滴甲苯(b)。使用前將(a), (b)二液泡合。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，將比色法(1)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成lm含lmg還原糖工作液。然后'取不同體積(0.5-50ml>工作液 移于lOOmt容量瓶中，加10mlpH5<5醋酸鹽緩沖液，用水稀釋至刻度宀吸取此液5ml移于100ml容量瓶中，加4ml銅試劑在 鈉和5ml鉗溶液，顯色lmiri定容，在分光光度計(jì)上于578nm處 比色。根據(jù)光密度值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線口梆騰水裕上®S25mina冷卻至室溫丁再加2ml0.2M磷酸二氫2操作步驟取土壤置于IQOm】容量瓶中，加2ml

12、甲苯。 laming加10ml2D%就糖和lOmlpHs.S醋酸鹽緩沖液，置于379 恒溫箱中培養(yǎng)24九 培養(yǎng)結(jié)束后，過濾并定容，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 操作步驟顯芭，比色。試驗(yàn)設(shè)用水代穢基質(zhì)的對照。應(yīng)糖醸活性，以24hJ§10g土壤中葡萄糖毫克數(shù)表示。滴定法1試劑配制(1) 20%蔗糖(2) 甲苯(3) PH5.5醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(4) 33% KI 液(5) H2SO4 (1： 3)(6) 淀粉指示劑：取 0.5g淀粉溶于少許水中，加10ml煮沸的25%NaCI 液，煮沸 1min(7) 0.1N Na2S2O3滴定液：配制方法與標(biāo)定方法見多酚氧化酶測定(8) 菲林溶液：取34.64

13、 g CUSO4.5H2O溶于蒸餾水，并稀釋至500ml(a) 取173g酒石酸鉀鈉和50gNaOH溶于蒸餾水，并稀釋至500ml(b) ,使用前將(a)( b)按1:1混合2操作步驟取10g 土壤置于100ml三角瓶中，用1.5ml甲苯處理15min。加10ml 20%蔗糖和10ml PH5.5醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液，搖勻后放在37 C恒溫箱中培養(yǎng)24h培養(yǎng)結(jié)束后，加50ml蒸餾水，搖蕩后過濾。取20ml濾液移于100ml 三角瓶中，加10ml菲林溶液。在沸水浴上放置10min，冷卻至室溫 后再加 3ml 33%KI 溶液和 4ml H2SO4（ 1:3）。然后用 0.1N Na2S2O3 滴

14、定，至終點(diǎn)前加淀粉指示劑，再滴定至藍(lán)色消失。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)以水（20ml ）代替基質(zhì)的對照蔗糖酶活性，用對照與試驗(yàn)的0.1N Na 2S2O3滴定毫升數(shù)之差表示B-glucosidase伊葡糖苷酶4分析意文多聚糖是土壤簡單的含碳化合物的聚合物。在 纖二耦酶作用下，多聚糖和d葡糖芹製僦為葡萄糖口酶促作用產(chǎn) 物是微生物、植物的營養(yǎng)源，纖二糖酶是參與碳素生物循環(huán)的一2方法原理纖二糖醐能裂解A葡糖甘生成葡萄糖，所以又 稱A葡糖昔酶°測定纖二糖酶常用容量法（滴定還原糖量和比色法（比色靛酚和對硝基酚）。采用的基質(zhì)有纖維二糖、龍膽二糖熊果葉昔 等,緩沖體系有pH62磷酸鹽緩沖液.PH6.2醋酸鹽緩沖液-

15、 PII4-8磷酸一檸檬酸緩祁液。靛酚比色法】在纖二糖酶作用下，水楊酸甘（爐葡糖昔2 起甲基苯酚）水解生成的水楊醇能與2 ,6 -二氯代二澳對苯醒 亞胺，在PH9.6時(shí)起反應(yīng)生成蘭色靛酚，然后比色測定。硝基酚比色法，以對硝基苯葡糖昔為基質(zhì)，在纖二糖 酶作用下，水解產(chǎn)生對硝基酚，比色測定。容覺法1試劑配制（1）10%熊果葉昔（少葡糖昔-苯二酚兒（2）甲苯。（3）pH62磷酸緩沖液 其他試劑按測定蔗糖酶容量法而定。2操作步取5 g土壤置于200 ml三角瓶中，加5滴甲苯和15mlpll6.2磷酸緩沖液。15min后，注入5m】10%熊果葉昔 溶液。搖勻混合物后，置于379恒溫箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)

16、束后，加80ml水，搖勻并過濾。吸取20ml濾液，按蔗糖酶羿j纖二糖酶活性,以0.1NNa2S2Os毫升數(shù)表示。試驗(yàn)設(shè)JS用水代替基質(zhì)的土壤和無土壤的熊果葉昔為對照.靛酚比色法1試劑配制（1）水楊酸甘溶液*取l<1532g純水楊昔溶于1L蒸憎水中 （每毫升含50mg水楊昔）。（2） pH62醋酸鹽緩沖液：董取120mlCH3COOH溶于IL 蒸憾水中（a）,再取164g無水CH3COON,溶于1L蒸館水中（b）o將a）與（b）按1 混合后，用pH計(jì)調(diào)至6.2。(3 )甲苯&(4 )PH9.6硼酸鹽緩沖液。(5 ) 20%NaOH°（6）顯色劑（02%2,6 -氯二漠對苯

17、醍亞胺的乙醇溶液）。（7）酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液*取O.lg苯酚溶于1L水中（每毫升含O.lmg苯酚），保存在棕色瓶中。酚的工作溶液：取10ml標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋至100ml （每毫升含O.Olm g 苯酚）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，取工作液0, 2.52, 12.63和2526ml分別 加入100m】容量瓶中，再分別加入67ml酷酸緩沖液，即成每3m） 含0、10、50和lOOFg水楊醇液。另取3.79m】酚標(biāo)準(zhǔn)液，加 67ml醋酸緩沖液，即成每3m!含150卩g水楊醇液。最后均稀釋至100ml。取5m此液移于50ml容量瓶中，加2mlpH96硼酸鹽勻混合緩沖液，再加05m】0.2%2,6-氯代二浪對苯醍亞胺。:物

18、后，在室溫下放置lh,顯色后稀釋至刻度。在分光光度計(jì)上于578nm處比色。以光密度值為縱坐標(biāo)，以水楊醇濃度為橫坐 標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2操作步驟 稱土置于50m!三角瓶中，加1.5ml甲苯處 理土壤。15min后，加10ml水楊昔溶液和20m】pH6.2醋酸鹽緩 沖液。放在37七恒溫箱中培養(yǎng)24»培養(yǎng)結(jié)束乩 過濾混合物。取5ml濾液移于50ml容量瓶中, 按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪涮方法進(jìn)行顯色,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出水楊醇的含量。纖二糖酶活性，以24h后，lg 土壤中水楊醇的毫克數(shù)表示。 設(shè)以水代替基質(zhì)的土壤和無土壤的水楊酸甘為對照。硝基酚比色法兒試劑配制Cl) 0.05M對硝基苯4D 葡糖昔。(2)甲苯

19、，(3 ) pH4*8磷酸-檸檬酸緩沖液：取98.6mi0.2MNaiHPO4 溶液與lOlmlO.lMC.H.OrHiO溶液混合。(4) 乙醇。(5 ) 2M三輕甲基氨基甲烷溶液r取242咅三輕甲基氨基 甲烷溶于水，并稀釋至200mlD(6)對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液配制lml含lFmol的標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制=取I ml含有0,0-2 ,0-4 , 06* 0.F和l.Omol的標(biāo)準(zhǔn)腹2ml移于25ml量瓶中加入2ml三輕甲基氨基甲 烷。定容混勻后在分光光度計(jì)上與400nin處比色測定.繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。2.操作步驟 取0鷗土壤置于25ml三角瓶中，加0.1ml甲 苯和0.9ml蒸憎水，lOmin

20、后加1.5mlpH4,8g!|酸-檸檬酸緩沖液. 再加0.6毫升QJ5M對硝基苯中-D-葡糖苜溶液。混合均勻后， 在30弋:恒溫箱中培養(yǎng)丄h,然后加8 ml乙醇搖勻后過濾，取2ml 濾液移于25nd量瓶中，加2m!三技甲基氮基甲烷，定容后在波 長400nm處比色測定。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)以水代替基質(zhì)的土壤和無土壤的對硝基苯-Q-D 葡 糖昔為對照Dperoxidase過氧化物酶 HRP<=)過顰化物屬4分析意義過氧化物酶能氧化七壤吉機(jī)物質(zhì)° 一些過氧化 物是土壇微生物生命活動(dòng)的結(jié)果，也與某些氧化酶(如尿酸鹽氧 化酶)的作用有關(guān)。所以過氧化物舸在腐殖質(zhì)的形成過程中具有電要的作用。2方法選擇與

21、原理 過氧化物醸禱促有機(jī)物質(zhì)氧化成齪?？?通過有色化合物(如紫色沒食子比色測定，也可用碘量法滴 定測得酶促反應(yīng)生成的氧化產(chǎn)物，用于衰示酶的活性。測定過氧 化物誨的方法原理基本與多酚氧化酹的相同。比 色 法1 試劑配制(1) 1%鄰苯三酚溶液。(2) 0.5%H2O2 溶液。(3 )乙瞌< 4) 0.5N HC1。(5) pH45檸穢酸一磷酸緩沖液。(6) 重幣酸悍標(biāo)準(zhǔn)洛液及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制見多酚氧化酶測 定。2操作步驟 取lg 土壌.置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1%磷苯三酚溶液和2ml 0. 5 % HA溶液。振蕩后按測定多酚氧 化酶步驟萃取、比色。過氧化物辭活性，以2h后,ig

22、±壊中生成的紫色沒令了索 亳克數(shù)表示。容 量 法1試劑配制(1 ) 0.02M鄰苯二酚溶液(見多酚氧化酶測定九<2 ) 04%HQ2。(3 ) 0<1%抗壞血酸溶液。<4) pH4.7醋酸鹽緩沖液。cs> io%usro4溶液。C6) 0.01N 4的標(biāo)準(zhǔn)滴定液(見多酚氣化醍測定人N挫作步驟 稱Sg土壤置于50ml三角瓶中，加入26mlpH 仁7酷酸鹽緩沖液，搖勻后放置2h并過濾。取iml濾液移于另一50ml三角j瓦中，力JUnil 0*4%HxOz ?f? 掖、2ml 0.1%抗壞血酸和1ml 0. 02M鄰苯二瞬溶液。將混合物 搖勻后，置于20七水浴上培養(yǎng)

23、2mina隨后加lml 10%H卍0, 飩化酶°最后用0.01N良滴定混合物至黃色(顏色穩(wěn)定io15s)o 用充分煮沸的土壤浸提液作對照。過氧化物酶活性以1呂土壤消耗的O.OIN匚標(biāo)準(zhǔn)液的毫升 數(shù)敢示pxylanase 木聚糖酶(六)木聚犧酶九分析意義 木聚糖是半纖維素的組成成分。迸入土壊的禾 本科牧草含有大量木聚糖。在木聚糖酶作用下，木聚糖製解生成 木第口酶促作用產(chǎn)物是土壤微生物的能量物質(zhì)"木聚糖酶在自然 界的碳素循環(huán)中起看重要的作用。2方法原理 以木聚糖為基質(zhì)，酶促作用生成的木糖，通過 碘量法，測出反應(yīng)混合物的還原力竹目前，測定木聚糖酶的方法，主塵根據(jù)Sorense (

24、 1957 ) 提出的礁量滴定法進(jìn)行。氐試劑配制(!)木聚貓搏就乂舷成熟小麥桔稈用硫提取，然后用醇沉淀而成。配制濃度為1%(2) 甲苯(3) PH6.50.15M磷酸鹽緩沖液(4) 銅-磷酸鹽試劑：取28g無水K2HPO4和40g酒石酸鉀鈉， 溶 于 700ml 水 中 ， 加 100ml 1N NaOH ， 然 后 加 入 80ml 10%CuSO4.5H2。溶液。溶解后，加入180g無水Na2SO4，將溶液稀 釋至1L并過濾后備用( 5) 0.005N KI(6) 2N H2SO4(7) 0.005N Na 2S2O3。5哉0溶液。該工作夜由 0.1N NazS?。?原 液稀釋而成。為防止

25、大氣中 CO2 的影響，稀釋 1L 溶液加 2ml 10% NaOH(8) 木糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液( 1ml 含 0.2mg 木糖)4 操作步驟取 5g 土置于 50ml 三角瓶中，加 2ml 甲苯。 10min 后，加 5ml PH6.5 磷酸緩沖液和5ml 1%木聚糖溶液。放在37 C恒溫箱中培養(yǎng)5晝夜。培養(yǎng)結(jié)束后，取 5ml 濾液移于大試管中，加 5ml 銅-磷酸鹽試劑。 塞好試管后，放在沸水浴上加熱 10min 。這時(shí)，有紅色氧化亞銅沉淀 析出。待冷卻后，為使亞銅氧化，沿管壁加 5ml 0.005N KI 溶液(不 要混合)。然后迅速注入1.5 ml 2N H 2SO4,并立即搖動(dòng)混合液。剩余

26、 的KI用0.005 Na 2S2O3進(jìn)行回滴。根據(jù)KI的差，得出與當(dāng)量銅量結(jié) 合的碘化鉀量。為了計(jì)算反應(yīng)液中生成的木聚糖，得到 1mg 木糖的 0.005N CuO 的毫克數(shù)，可用標(biāo)準(zhǔn)木糖液5ml，按上述方法沉淀，銅用硫代硫酸鈉 滴定。根據(jù)用于氧化銅的 KI 的量，查知其當(dāng)量數(shù)(以 0.005N CuO的毫克數(shù)表示）木聚糖酶活性，以1ml反應(yīng)混合物中木糖的毫克數(shù)表示。 試驗(yàn)設(shè)置以水代替基質(zhì)的對照phenol oxidase多酚氧化酶 PPO1分析意義多酚氧化酶參與土壤有機(jī)組分中芳香族化合物的轉(zhuǎn)化作用。土壤中的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下氧化生成醌。醌與氨基酸等通過一 系列生物化學(xué)過程所合成最

27、初的胡敏酸分子， 所以，多酚氧化酶是腐 殖化的一個(gè)媒介。它是土壤氧化花園酶中了解得比較多的一種酶。2方法選擇與原理在空氣存在的情況下，多酚氧化酶能酶促一:元酚、二元冊或三元酚氧化成鬧少以鄰苯二酚氧化成相應(yīng)的01為例，反應(yīng)式如下*根錨花匪的變化，測定多酚氧化離的三測方法知下<1 ）比色法工多酚氧化更麗促籍苯三酚，用乙朋提取生血 的紫色沒食于素，比色著色的乙醴相，用紫色沒食子素量衷示旌 活性&此法具有速度快的優(yōu)點(diǎn)，挖色技術(shù)姿求較嚴(yán)，培養(yǎng)混合液 pH要準(zhǔn)確，且范用較窄&是冃前廣為次用血一種方法口（2碘量滴建法本法決拱多躋氧化恥踰促基質(zhì)生成的 齪，衣酸性條件下，用標(biāo)準(zhǔn)腆溢漩定生丘

28、穩(wěn)定的藍(lán)隹絡(luò)合物，氐 碘的儂積表示醮的活性右此法要注竄保證反應(yīng)所需赳恢茲 對賊 性土壊應(yīng)加過:fi的酸，才易于列斷適定終蟲°(3) 測壓法：右法用Warburg呼吸器，測定在多酚徒化 廨作用下消耗用于氧化多酚化合物的氧量.求示醜活性。此法要 求儀器設(shè)簽，且測定樣品所需時(shí)聞較長。測定多酚氧化爾常用的基質(zhì)有鄰苯二酚和鄰苯三酚，由于測 定多酚氧化酚是基于測定加入土壤的多酚的氧化速度，一般鄰苯 三酚銳比得最快，故常用鄰苯三酚為基質(zhì)，以比色法進(jìn)行測定。比 色 法1試劑配制(1) 1%鄰苯二酚涪液。(2) 乙瞇。(3 ) 0.5N 鹽酸。(4) 重俗酸鉀標(biāo)誰溶0.75gK2Cr2O,溶于1 L0

29、.5 N HC1 (相當(dāng)于50ml®中含5mg紫色沒食子素)。(5pH45檸檬酸礴酸緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：匪重銘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用05N HCI稀釋成 各種不同濃度°定容后，在分光光度計(jì)上于430nm處比色測定。 以光密度值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2換作步驟 取lg 土樣(過0.25mm篩)，置于50ml三角 瓶中，然后注入10ml 1%鄰苯三酚溶液，將瓶內(nèi)含物搖蕩后放 在30七恒溫縉巾培養(yǎng)2h。取岀后加4ml pH45檸檢酸磷酸 怨沖液，再加35m乙讎，用力搖蕩數(shù)次，萃取30mino最后， 將含落解的紫色沒食子素的著色乙醴相進(jìn)行比色。比色時(shí)用波長 為430nm

30、的濾光片.為防止因乙醛引起的泯差，每比色次用 無水乙醇洗滌比色液槽一次。為了消除土壤中原有的讎溶性有機(jī)物質(zhì)而引起的誤差及校正 沒食子酚的純度，需設(shè)無基質(zhì)的土壤和無土壤的基質(zhì)作對照。在 無基質(zhì)的土壊的對廉中，用水代種基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。3活性衣示紫色沒食子索的量，根據(jù)用重偌酸鉀繪制的標(biāo) 準(zhǔn)曲線查知。多酚氧化酶活性，以2h后lg 土壤中紫色沒食子素的毫克 數(shù)表示。碘量滴定法1試劑配制(1) 0.1%抗壞血酸。(2) 10% 磷酸'(3) i %可溶注淀粉。(4) 002乂令牯二酚：取055g鄰苯二酚加1000ml燕他 水即以(50.01N応的標(biāo)準(zhǔn)滴覽液$1) 12溶液的配制取l-3gl：和2gK

31、I不含KIO,), 加20ml水?dāng)嚢瑁怪芙?。然后稀釋至IL,保存在棕色瓶中待 用Na2SA標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定。2) 0.01N良標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)定取Na2SzO3標(biāo)準(zhǔn)液25ml, 放入250ml三角瓶中，加50ml蒸館水和5ml淀粉溶液，用I, 溶液滴定至溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色。計(jì)算爲(wèi)溶液的當(dāng)量濃度。3) NaSjOj 標(biāo)準(zhǔn)液配制 稱2» Sg'NaiSiOjSHiO,溶解 在剛煮沸而冷卻了的蒸館水中，加入少許Na2CO3,稀釋至1L。 保存在棕色瓶中待用標(biāo)定劑(KzCiOJ標(biāo)定°4) K2Ct2O7標(biāo)定劑的配制準(zhǔn)確稱取0.1500g分析純KxCrA于500ml三角瓶中，加入30ml蒸館水，加2呂KI和5ml6N H01,在暗處放5min,然后用水稀釋至200ml,用NatStOs標(biāo)準(zhǔn)液