考馬斯亮藍法測定

1、考馬斯亮藍法測定考馬斯亮藍法測定紫菜可溶性蛋考馬斯亮藍法測定紫菜可溶性蛋白含量白含量 考馬斯亮藍法測定提綱o前言o材料與方法o結(jié)果與分析o研究目的及意義考馬斯亮藍法測定前言前言 1 紫菜的生物學(xué)特征紫菜的生物學(xué)特征 紫菜（Porphyra）屬于紅藻門（Rhodophyta）紅藻綱（Rhodophyceae）紅毛菜亞綱（Bangiophycidae）紅毛菜目（Bangiales）紅毛菜科（Bangiaceae）。目前報道的種類約有130多種，廣泛分布在世界各地。東亞地區(qū)屬紫菜盛產(chǎn)區(qū)域，條斑紫菜（Porphyra yezoensis）是中、日、韓三國共同栽培品種，在我國長江以北廣泛栽培，而在長江以

2、南栽培的壇紫菜（P. haitanensis）屬我國特有。 條斑紫菜為北太平洋西部特有的種類，自然界主要分布于我國東海北部和黃、渤海沿岸，以及日本列島和朝鮮半島沿岸。條斑紫菜藻體為葉片狀，葉形多為卵形或長卵形，隨生長環(huán)境有較大的變化。壇紫菜主要產(chǎn)于我國福建和浙江沿海，盛產(chǎn)于福建的平潭、莆田、惠安等縣，為我國特有的暖溫帶性種類，藻體披針形、亞卵形或長卵形?？捡R斯亮藍法測定紫菜的營養(yǎng)價值紫菜的營養(yǎng)價值 紫菜（Porphyra）作為一種經(jīng)濟價值巨大的栽培紅藻，以其營養(yǎng)豐富、口感良好深受特別是東亞地區(qū)人民的喜愛。 紫菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、膳食纖維、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、B2，維

3、生素C、維生素B12和膽堿等多種有機物質(zhì)，同時還含有人體所需的Ca、P、Fe、Mg、I、Se、Zn和Mn等多種礦物質(zhì)。 劉興寬，郁建平(2008)在對沿海灘涂甘紫菜營養(yǎng)成分分析中，檢測出15種游離氨基酸和16種水解氨基酸，必需氨基酸占游離氨基酸總量的2435，占水解氨基酸總量的39.81；維生素和微量元素種類多、含量高，樣品中Vc含量為17.2mg100 g；微量元素中Na的含量最高為356.7 mg100 g，其次是Ca、Mg和K，Pb和Cu的含量遠低于指標值?？捡R斯亮藍法測定o仲明等（2003）在對條斑紫菜不同采收期主要營養(yǎng)成分變化情況中指出條斑紫菜的鈣、鎂、鋅和碘含量較豐富，尤其是鈣和碘

4、含量較多，鉛、鎘含量均低于食品衛(wèi)生標準。所含的維生素種類多、含量高，明顯高于動物性食品，胡蘿卜素、維生素E含量尤為突出。o蛋白質(zhì)的含量是衡量紫菜品質(zhì)優(yōu)劣的一項重要指標。紫菜中的蛋白質(zhì)含量隨著藻的種類及生長時間、地點等而有所不同，通常蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)占紫菜干質(zhì)量的25%50% ?？捡R斯亮藍法測定o牛建峰等（2006）利用 Bradford法，測得60恒溫干燥的帶形蜈蚣藻可溶性總蛋白質(zhì)量分數(shù)為 0.33，帶形蜈蚣藻是紅藻門蜈蚣藻屬植物，其可溶性蛋白含量很少。o劉淑梅等（2009）對9份辣椒種子的可溶性蛋白含量進行了測定，結(jié)果表明辣椒種子蛋白含量為25.6529.22，遠高于其他蔬菜類作物的蛋白質(zhì)含量

5、，辣椒種子蛋白質(zhì)含量是辣椒皮的20倍，辣椒種子蛋白質(zhì)僅低于大豆的蛋白含量(36.2349.26)。這表明辣椒種子具有較高的蛋白質(zhì)開發(fā)價值。o粱月等（2010）通過對布澤烏區(qū)采集的不同品種漿果分析得出可溶性蛋白含量從22.3945.35，含量很高?？捡R斯亮藍法測定蛋白質(zhì)的測定方法蛋白質(zhì)的測定方法o在許多蛋白質(zhì)研究的領(lǐng)域中，用一種快速準確的方法來檢測蛋白濃度是必不可少的。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有多種，如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、等電點沉淀法、考馬斯亮藍染色法等幾種方法，但就方法的準確性和精密度以及應(yīng)用程度而言，國際經(jīng)典測定方法凱氏定氮法為首選?，F(xiàn)在盡管有很多先進的自動或半自動凱氏定氮儀，

6、但這些儀器不僅價格昂貴，且需專門試劑，目前尚難普及21。一種新建立的考馬斯亮藍法在許多實驗中已成為首選方法用來定量的檢測蛋白濃度?？捡R斯亮藍法測定o凱氏定氮法凱氏定氮法 測定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。在催化劑作用下,試樣用濃硫酸消煮破壞有機物,使其中的蛋白質(zhì)氮及其他有機氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮,然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,加入強堿進行蒸餾使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,測出含氮量,將結(jié)果乘以換算系數(shù),計算出粗蛋白質(zhì)含量。然而該方法存在消化時間太長,會產(chǎn)生有毒有害該方法存在消化時間太長，會產(chǎn)生有毒有害氣體，因此必須在通風(fēng)櫥中進行的弊端。宗留香

7、等人對這一傳統(tǒng)方法進行了改進，即用Se 粉作催化劑進行消化，不用通風(fēng)櫥，即實現(xiàn)了環(huán)保消化，并提高了消化效率。考馬斯亮藍法測定o考馬斯亮藍法考馬斯亮藍法 考馬斯亮藍G一250測定蛋白質(zhì)含量原理是屬于染料結(jié)合法的一種，存在紅色與藍色兩種不同的顏色形式。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合時變?yōu)樗{色?？捡R斯亮藍G250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而且穩(wěn)定，反應(yīng)2 min 左右即達到平衡，其結(jié)合物可在室溫下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定?？捡R斯亮藍G- 250 法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定方法，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1g，比Lowry法的靈敏度高約4 倍，這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化

8、很大，蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry 法要大得多。該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制；干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色?？捡R斯亮藍法測定結(jié)果與分析結(jié)果與分析o2.1 測定波長的選擇及標準曲線的繪制測定波長的選擇及標準曲線的繪制 取160ug/mL標準蛋白質(zhì)溶液用LAMBDA 25 紫外/可見光光度計450750 nm進行波長掃描 ,由掃描曲線可見標準蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長為 595 nm,，故本法選擇的測定波長為595nm。圖圖1 最大吸收峰的測定最大吸收峰的測定Fig.1 Analysia of the p

9、roper absorbing4505005506006507007500.00.20.40.60.81.0A595nm考馬斯亮藍法測定2.2 顯色穩(wěn)定性考察顯色穩(wěn)定性考察 取1ml 200ug/ml標準蛋白質(zhì)加入5 ml考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，放置 3 min 后倒入比色皿，在 595 nm 處，每隔30s 測定其吸收度，測定結(jié)果如下圖所示： 圖圖2 穩(wěn)定性考察穩(wěn)定性考察Fig.2 Investigation on the stability0123456780.00.20.40.60.81.01.21.4A595m in考馬斯亮藍法測定o陸建良等(2002)的研究表明，蛋白質(zhì)與考馬

10、斯亮藍G-250 結(jié)合后，在25min即呈最大光吸收，至少穩(wěn)定1h。我們在試驗中發(fā)現(xiàn)考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，即使在5min 到20min后，在595nm處的光吸收值也不是很穩(wěn)定，總是在一定幅度內(nèi)擺動，如果儀器的靈敏度高，這種擺動誤差就更大。為了減少試驗誤差，應(yīng)將儀器的狹縫調(diào)大些，以降低靈敏度，增加穩(wěn)定性?？捡R斯亮藍法測定 2.3 蛋白標準曲線的繪制蛋白標準曲線的繪制圖圖3 蛋白質(zhì)標準曲線蛋白質(zhì)標準曲線Fig 3 The standard curve of the proteins 一月一月 二月二月040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.0049x+0

11、.1398,r=0.9993A595蛋 白含量(ug)040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.005x+0.1262, r=0.9994A595蛋 白含量（ ug）考馬斯亮藍法測定 三月 四月040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.0049x+0.1464,r=0.9993A595蛋 白 含量（ ug）040801201602000.20.40.60.81.01.2y=0.0048x+0.1774,r=0.9992A595蛋 白 含量（ ug）考馬斯亮藍法測定o1，2，3，4月采集樣品蛋白測定的回歸方程分別為：y = 0.0049

12、x + 0.1398，r = 0.0093；y = 0.005x + 0.1262，r = 0.9994；y = 0.0049x + 0.1464，r=0.9993；y = 0.0048x + 0.2774，r=0.9992。各次測定的蛋白回歸方程式相關(guān)系數(shù)r在0.99920.9994之間，蛋白含量與595nm處吸光值線性關(guān)系良好?？捡R斯亮藍法測定2.4不同紫菜可溶性蛋白含量隨生長時期不同而變化不同紫菜可溶性蛋白含量隨生長時期不同而變化 圖圖4 不同紫菜中蛋白含量不同紫菜中蛋白含量Fig.4. The dissolvable protein contents of different Porp

13、hyramg/gSTDEV1月2月3月4月1月2月3月4月對照241.734.29 247.31 231.69 219.35 3.76 2.12 3.35 Y-L0601220.92 231.67 187.50 154.56 4.58 2.88 3.62 7.70 Y-L0602205.00 227.36 175.30 148.62 4.62 4.87 3.14 1.50 Y-06DO206.21 230.51 185.34 170.20 7.01 4.01 6.39 3.77 Y-gr282.37 290.77 208.96 192.93 12.54 5.90 5.18 1.80 壇紫菜19

14、0.60 194.91 172.72 142.11 3.23 2.41 2.75 4.43 考馬斯亮藍法測定o一月Y-gr組測得的蛋白含量最高，為282.37 + 12.54；對照組測得的蛋白含量為241.73 + 4.29，居第二；其次是Y-L0601含量為220.92 + 4.58；Y-06DO含量為206.21 + 4.01；Y-L0602含量為205.00 + 4.62；最低的是壇紫菜含量為190.60 + 3.23。o二月所有組的蛋白含量同一三四月比都是最高的，蛋白質(zhì)的含量是衡量紫菜品質(zhì)優(yōu)劣的一項重要指標，所以一二三四月中二月可能是采收的最好季節(jié)。考馬斯亮藍法測定o三月蛋白含量和二月

15、相比普遍下降，下降最明顯的是Y-gr，從二月的290.77 + 5.90 mg/g下降到三月的208.96 + 5.18 mg/g；其次為Y-L0602從二月的227.36 + 4.87 mg/g下降到三月的175.30 + 3.14 mg/g；最低的是對照組從二月的247.13 + 3.76下降到三月的231.69 + 2.12 mg/g。o四月采集的各樣品中蛋白含量是各生長時期最低的，各紫菜樣品中含量存在較大差異。對照組蛋白含量最高，壇紫菜最低。蛋白含量從高到低順序為：對照 Y-gr Y-06DO Y-L0601 Y-L0602 壇紫菜?？捡R斯亮藍法測定圖圖5 紫菜中蛋白含量隨生長時間的變

16、化紫菜中蛋白含量隨生長時間的變化Fig.5 The dissolvable protein contents of different stage of Porphyra對 照 Y-L0601 Y-L0602Y-06DOY-gr 壇 紫菜050100150200250300含量（ mg/g） 1月 2月 3月 4月考馬斯亮藍法測定o一月二月，Y-gr樣品的蛋白含量高于其他5個組，三月四月僅次于對照組。壇紫菜的蛋白含量始終最低。蛋白含量隨生長時間的變化呈明顯的規(guī)律，1，2月采集樣品中蛋白含量較高，隨后其蛋白含量均出現(xiàn)一定程度的下降。Y-gr下降程度最高，下降了28.13%，其次為Y-L0602下

17、降了 22.90%，接著是Y-06DO下降了19.60%，Y-L0601下降了19.07%，壇紫菜下降了11.38%，最低的是對照組下降了6.32%?？捡R斯亮藍法測定o以上結(jié)果均說明，紫菜中可溶性蛋白含量不僅與藻的種類及其品系密切相關(guān)，而且同一紫菜蛋白含量隨生長時期的變化有所差異。姚興存等（2002）對連云港沿海條斑紫菜一般營養(yǎng)成分進行了測定及研究與分析了隨季節(jié)變化的規(guī)律，結(jié)果表明幾種營養(yǎng)成分中，含量變動最為明顯的是蛋白質(zhì)和碳水化合物，二者之間呈顯著的負相關(guān)關(guān)系。在紫菜生長的前期蛋白質(zhì)含量高，之后隨生長時間的延長，逐漸減少，而碳水化合物則恰恰相反。分析原因是由于處在生長初期的紫菜細胞不斷地進行

18、分裂，以蛋白質(zhì)為中心的代謝十分旺盛。相反到了生長末期，細胞分裂能力下降，碳水化合物的代謝變得旺盛，使得細胞壁和細胞間隙物質(zhì)增厚增多起來。由此，生長初期的紫菜加工出來的紫菜制品，營養(yǎng)價值較高，色、香、味也達到較高水平，生長末期的加工產(chǎn)品則品質(zhì)出現(xiàn)一定程度的下降。考馬斯亮藍法測定o目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有多種 , 如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、等電點沉淀法、考馬斯亮藍染色法等幾種方法 , 但就方法的準確性和精密度以及應(yīng)用程度而言 , 國際經(jīng)典測定方法凱氏定氮法為首選?，F(xiàn)在盡管有很多先進的自動或半自動凱氏定氮儀 , 但這些儀器不僅價格昂貴 , 且需專門試劑 , 目前尚難普及。考馬斯亮藍法在許多實驗中已成為首選方法用來定量的檢測蛋白濃度。o牛建峰等（2006），建立了Bradford法測定帶形蜈蚣藻可溶性總蛋白含量的測定方法，并認為此法操作簡單，成本低廉，耗時短?？捡R斯亮藍法測定o王衛(wèi)國等（2002）用雙縮脲法、紫外吸收法、考馬斯亮藍染色法三種方法對灰樹花多糖中蛋白質(zhì)含量進行測定，并同微量凱氏定氮法進行對比。結(jié)果表明馬斯亮藍G-250染色法在包括灰樹花多糖在內(nèi)的多種真菌類多糖中蛋白質(zhì)