梅毒實驗室檢測

1、梅毒實驗室檢查的進展張國軍（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心）寫在課前的話梅毒是一種慢性、系統(tǒng)性疾病。學(xué)員通過本課件的學(xué)習，要熟悉梅毒的定義、傳播途 徑及臨床分期；掌握不同時期梅毒的治療方法；掌握梅毒實驗室檢測方法和梅毒免疫學(xué)反 應(yīng)；掌握梅毒血清學(xué)實驗的原理、特點及各自優(yōu)缺點；掌握先天性梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷 方法。.梅毒概況及臨床分期梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。人體受感染后，螺旋 體很快播散到全身，可侵犯全身各組織與器官，臨床表現(xiàn)多樣，且時隱時顯，病程較 長。梅毒早期主要侵犯皮膚及粘膜，晚期除侵犯皮膚、粘膜外，還可侵犯心臟血管系 統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等全身各個系統(tǒng)；

2、另一方面，梅毒又可多年無癥狀而呈潛伏狀態(tài)。主要傳播途徑：性接觸傳染是最主要的傳播方式；其次是垂直傳播。隨著梅毒在人 群中流行率升高，母嬰垂直傳播發(fā)生率日益上升，并伴隨著包括診斷、治療、阻斷等 在內(nèi)的一系列問題；第三，輸血傳播。輸血傳播曾經(jīng)是梅毒重要的傳播方式。但隨著 血液篩查的廣泛開展及輸血的減少，梅毒經(jīng)輸血傳播已很少發(fā)生。但近年來，由于艾 滋病的流行，梅毒仍然是輸血安全的威脅。臨床分期：一期梅毒：主要表現(xiàn)為單個、無痛性的硬下疳，通常在感染梅毒螺旋 體后3 -4 周出現(xiàn)；二期梅毒：一期梅毒不經(jīng)治療，梅毒螺旋體在幾周到幾個月后會 播散到血液中，引起二期梅毒。二期梅毒的臨床表現(xiàn)多樣，常見發(fā)熱、淋巴

3、結(jié)病、彌 漫性皮疹、生殖道或會陰濕疣等。一、二期梅毒統(tǒng)稱為早期梅毒；三期或晚期梅毒：在最初感染的數(shù)年至十數(shù)年后發(fā)生，可累及任何器官，常見梅 毒瘤性梅毒、心血管梅毒以及神經(jīng)梅毒。隱性梅毒：無癥狀但梅毒血清學(xué)試驗呈陽性。 分為早期隱性梅毒（病程一般在一年以內(nèi)）和晚期隱性梅毒（病程一般在一年以上）二.梅毒的治療非口服途徑的青霉素可用于各期梅毒的治療。早期梅毒的治療首選240萬單位節(jié)星青霉素 G單次肌肉注射。對青霉素過敏者，替代治療方案有強力霉素，口服，每次 100 mg,每日2次，持續(xù)2周，或四環(huán)素，口服，每次500 mg,每日4次，持續(xù)2周。早期隱性梅毒的治療方案與早期梅毒相同。晚期隱性梅毒的首選

4、治療方案為每周一次肌肉注射240萬單位節(jié)星青霉素 G,持續(xù)3周；對青霉素過敏者，替代治療方案有強力霉素，口服，每次 100 mg,每日2次，持續(xù)4周，或四環(huán)素，口服，每次 500 mg,每日4次，持續(xù)4周。合并HIV感染、梅毒瘤性梅毒、心血管梅毒的治療方案同晚期隱性梅毒相同。神經(jīng)梅毒治療只能采用青霉素，靜脈注射水溶性青霉素G,每4小時300 - 400萬單位，持續(xù)10 -14天，或肌肉注射普魯卡因青霉素G,每天240萬單位，持續(xù)10 -14天，同時口服丙磺舒，每日 500 mg,每日4次，持續(xù)10 - 14 天。孕婦的治療只能采用青霉素，青霉素過敏者需經(jīng)脫敏后再治療。思考* >早期梅毒應(yīng)

5、如何治療?三.實驗室檢測暗視野顯微鏡檢查法：是主要的梅毒病原學(xué)診斷方法，是最特異的一期梅毒檢測方 法。取材部位以硬下疳為主，也可從宮頸、陰道、淋巴結(jié)等處取材。陽性可確診，陰 性不能排除梅毒（需在3周內(nèi)不同的3天采樣檢測，才能得出陰性結(jié)果）。暗視野顯微 鏡法診斷的準確性受操作者的經(jīng)驗、病灶中活螺旋體的數(shù)量以及口腔、肛門破損處存 在的非致病性螺旋體等因素的影響。鍍銀染色法：與暗視野檢查法的臨床意義基本相同。該法利用梅毒螺旋體具有親 銀性，可被銀溶液染成棕黑色，再通過普通高倍顯微鏡進行觀察。直接免疫熒光法（DFA：是目前國外采用較多的方法，其特異性及敏感性均優(yōu)于 暗視野顯微鏡檢查法。將特異性的抗梅毒

6、螺旋體單克隆抗體用熒光素標記，如果標本 中存在梅毒螺旋體，則通過抗原抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見到發(fā)蘋果綠色 的梅毒螺旋體。此法可區(qū)分梅毒螺旋體和其他非致病性或條件致病性螺旋體。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR:能對生殖器潰瘍進行早期鑒別診斷，區(qū)分梅毒、生殖器皰 疹和軟下疳。它又可分為 PCR和RT-PCR PCR的設(shè)計主要針對編碼梅毒螺旋特異性抗 原和TpN47勺DNAFF放編碼區(qū)，常見的引物有 K03A、K04、47-1、47-2、47-3、47-4等。 由于在PCR中會偶然出現(xiàn)非特異的 PCR產(chǎn)物而干擾結(jié)果，因此必須用特異性DNA探針進彳T DNA-DN跺交來提高PCR的特異性及敏感性。 此外

7、，由于TpN47勺保守性，雅司螺 旋體可產(chǎn)生類似的 PCR產(chǎn)物，所以這種設(shè)計的 PCR不能區(qū)分梅毒和雅司；但可以區(qū)分 梅毒螺旋體和引博氏疏螺旋體，這就可以解決梅毒與萊姆病之間血清診斷中的免疫交叉的問題。另外一種是 RT-PCR常見的設(shè)計是針又撲!毒螺旋體的16s rRNA 366bp片段，這種方法污染少，特異性敏感性都比較高，但價格也較高。PCR在梅毒持續(xù)感染中的診斷價值目前還沒有一致的意見，理論上講PCR可以查出死亡的TP,所以?B療后 PCR陽性并不意味著治療失敗，但死亡的TP從機體內(nèi)清除比較快（15-30天），而存活的TP從機體內(nèi)清除至少需120天，所以治療數(shù)周后 PCR陽性意味著持續(xù)感

8、染的可能。此外也有將 PCRffi于產(chǎn)前診斷和神經(jīng)梅毒診斷的報道。四.免疫學(xué)反應(yīng)精選人類對梅毒沒有先天免疫性，尚無疫苗接種進行人工免疫,只能在受感染后產(chǎn)生感染性免疫。已完全治愈的早期梅毒患者仍可再感染。感染梅毒后，首先產(chǎn)生 IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染 2周后可檢出，早期梅毒治 療3 - 9個月或晚期梅毒治療2年后，大部分病人IgM可轉(zhuǎn)陰，再感染時又出現(xiàn)陽性， 所以IgM型抗體的存在是活動性梅毒的表現(xiàn)。通常感染梅毒4周左右產(chǎn)生IgG型抗梅毒螺旋體抗體，即使經(jīng)足量抗梅治療，梅毒螺旋體抗原消失后很長時間，IgG抗體仍可通過記憶細胞的作用繼續(xù)產(chǎn)生，甚至終生在血液中可檢到。另一種具有抗體性質(zhì)的物質(zhì)叫

9、反應(yīng)素，是梅毒螺旋體破壞人體組織過程中釋放出的一種抗原性心磷脂刺激機體所產(chǎn)生的抗體。反應(yīng)素一般在感染后5 - 7 周，或下疳出現(xiàn)后2-3 周產(chǎn)生，經(jīng)正規(guī)治療后可以逐漸消失。胎兒在宮內(nèi)感染梅毒螺旋體后， 胚胎的晚期6 - 9個月時，已能合成IgM型抗體，出生后第3個月開始形成IgG型抗體; IgM抗體不能通過胎盤， 而IgG型抗體能通過胎盤， 如果在患兒血清中檢出 IgM是診斷 先天性梅毒的有力的證據(jù)，但IgM陰性并不能排除先天性梅毒。五.梅毒血清學(xué)試驗（一）非特異性梅毒血清學(xué)試驗非梅毒螺旋體抗原血清試驗是以心磷脂、卵磷脂以及膽固醇作為抗原檢查血清中 的反應(yīng)素，用于初篩試驗及療效觀察。有以下四種

10、試驗，原理基本相同：性病研究 實驗室玻片試驗（VDRL。試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，并且要在顯微鏡下觀察結(jié)果，故國內(nèi)實驗 室很少采用。但 VDR提診斷神經(jīng)性梅毒最特異的血清學(xué)方法。不加熱血清反應(yīng)素試 驗（USR。試劑不需要現(xiàn)配現(xiàn)用，但仍然要在顯微鏡下觀察結(jié)果，現(xiàn)在已很少使用。快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR。在特制的紙片上進行，加入一定量特制炭粉，可使抗原抗體出現(xiàn)凝集，用肉眼可觀察結(jié)果。甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST。在試劑中以紅色的甲苯胺紅顆粒代替黑色的炭粉顆粒，使結(jié)果更容易觀察。本試驗的缺點：特異性。在多種疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、結(jié) 締組織病、腫瘤、靜脈吸毒者、老年人以及孕婦中均

11、可出現(xiàn)反應(yīng)素，所以此類試驗有 時會出現(xiàn)假陽性；敏感性。感染梅毒后反應(yīng)素的出現(xiàn)時間晚于特異性梅毒螺旋體抗體， 因此非梅毒螺旋體抗原血清試驗對一期梅毒的漏檢率比較高。RPR TRUS侑時出現(xiàn)弱陽性或陰性結(jié)果，而臨床的二期梅毒檢測需將患者血清稀釋后做定量的試驗，如果再 出現(xiàn)陽性結(jié)果，則為抗體過量引起的“鉤狀效應(yīng)”，大約1%-2%勺二期梅毒病人可出現(xiàn)假陰性。另外，晚期梅毒反應(yīng)素轉(zhuǎn)陰率較高，此類試驗對隱性梅毒不太敏感，因此此 類試驗漏檢較多。本試驗的優(yōu)點：陽性患者往往是梅毒現(xiàn)癥感染者，臨床上即可開展治療；該試驗 表現(xiàn)為滴度隨成功的治療而逐漸下降，可作為療效觀察的指標；價格低廉。測定非梅毒螺旋體抗原血清試

12、驗的滴度進行療效觀察：治療成功：早期梅毒患者在治療后6個月內(nèi)癥狀消失，并且非梅毒螺旋體抗原血清試驗滴度有至少4倍下降。晚期或隱性梅毒患者在治療后12 - 24 個月內(nèi)非梅毒螺旋體抗原血清試驗滴度有至少 4倍下降，說明治療較成功。治療失?。褐委熀蟀Y狀持續(xù)或重新出現(xiàn)；治療后非梅毒螺旋體抗原血清試驗滴 度反而上升4倍或以上；本試驗初始滴度比較高（1:32或以上），但在六個月內(nèi)沒有達 到4倍下降?？姑范局委熓〉牟∪藨?yīng)考慮是否有合并HIV感染及神經(jīng)梅毒可能性。血清固定。經(jīng)正規(guī)治療后，梅毒患者非梅毒螺旋體抗原血清試驗一般都會轉(zhuǎn)為 陰性，但是有約1% - 3%的病人即使經(jīng)足量抗梅治療，非梅毒螺旋體抗原血清

13、試驗滴 度仍然可持續(xù)呈低滴度陽性，此現(xiàn)象稱為血清固定，原因尚不清楚。血清固定患者的 滴度重又上升則提示再次感染梅毒。（二）特異性梅毒血清學(xué)試驗梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗是用梅毒螺旋體作為抗原檢測血清當中的抗螺旋體的IgM或者IgG抗體，其敏感性和特異性均高于非梅毒螺旋體抗原血清試驗，但不能用作療效觀察的指標。常用五種方法：熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗；梅毒螺旋體血球凝 集試驗；梅毒螺旋體明膠凝集試驗；梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗；梅毒螺旋體快速1. 熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）:是所有螺旋體試驗中最敏感的方法，特異性高，通常被認為是檢測梅毒的“金標準”。且該試驗可分開檢測IgM和Ig

14、G。但 是該法在技術(shù)操作上最困難，試驗操作及結(jié)果判讀都必須核實。試驗可靠性的關(guān)鍵是標準化的結(jié)果判斷、高質(zhì)量的熒光標記抗體及適當?shù)南♂尪?。由于實驗室操作繁瑣及主觀判斷經(jīng)常會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果，因此增加標記熒光標記染料的復(fù)染可以減低標準化過程中的錯誤，并增加其可讀性及重復(fù)性。由于該試驗需 要優(yōu)質(zhì)的熒光顯微鏡和技術(shù)熟練的操作人員，所以通常不被臨床實驗室作為常規(guī)方法 進行開展。2. 梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA） ：原理是用超聲裂解的梅毒螺旋體作為抗原，致敏經(jīng)醛化、鞣化的羊或禽類紅細胞，此致敏紅細胞與人血清或血漿中的梅毒螺旋體 抗體結(jié)合，可產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。TPHA的優(yōu)點：該法比 FTA-ABS

15、容易操作且穩(wěn)定性好，敏感性除早期梅毒外與 FTA-ABS相似，對大樣本進行批量檢測時，操作也較容易。不足：由于紅細胞具有生物活性，可能產(chǎn)生非特異性凝集，且保存的時間較短，批間差較大，所以在實際使用當 中也存在一些問題。目前國內(nèi)使用的商品化TPHA試劑盒均沒有通過國家批批檢。3. 梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA：原理與TPHA的原理基本相同，但它以人工 合成的惰性明月顆粒代替TPHA中的紅細胞作為載體，是TPHA勺升級產(chǎn)品。優(yōu)點：試劑穩(wěn)定，批間差小；結(jié)果判讀更為清晰明確；敏感性和特異性較TPHA®一步提高；通過了國家的批批檢。不足：結(jié)果判定主觀，較難實現(xiàn)自動化。4. 梅毒螺旋體酶聯(lián)免

16、疫吸附試驗（ TP-ELISA） ： 原理是以梅毒螺旋體抗原包被聚丙乙烯板， 再加入待檢血清及酶標記抗原，形成雙抗原夾心，同時檢測IgG 和 IgM 抗體。少數(shù)試劑采用間接法，使用酶標記的抗人IgG或IgM,可分開檢測IgG和IgM。優(yōu)點：敏感性和特異性較高；價格低廉，適合大量樣品篩查；可實現(xiàn)操作自動化、客觀化。缺點：ELISA 試劑盒品牌眾多，各家采用的抗原和工藝不同，使敏感性和特異性產(chǎn)生較大差異，臨床實驗室在選用ELISA試劑前要認真評估。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測梅毒螺旋體IgM 抗體。原理：ELISA 間接法或捕獲法，以捕獲法的敏感性和特異性為最佳。由于血液中IgG 的量遠高于IgM ， 為

17、避免交叉反應(yīng)引起假陽性，需對樣本進行預(yù)處理，事先去除其中的IgG ,然后再測定IgMo分離去除 IgG 的常用方法為柱層析法或免疫沉淀法，沉淀劑通常采用抗人IgG 等。 用途： 先天性梅毒的診斷；活動性梅毒的診斷及療效觀察；梅毒再感染的診斷。結(jié)果解釋：IgM陽性是先天性梅毒或活動性梅毒重要的證據(jù)，但是陰性結(jié)果并不能排除感染的可能性。5. 梅毒螺旋體快速檢測試驗（TP-RT） ：原理是雙抗原夾心免疫層析試驗或間接法免疫滲濾試驗，大多采用膠體金標記，可同時檢測IgG、 IgM 抗體（雙抗原夾心法），或單獨檢測IgG 抗體（間接法）。優(yōu)點是簡便、快速，不需要特殊儀器；適合單人份操作，可用于較緊急和實

18、驗室條件差的場合。缺點：臨床評估資料不多，敏感性、特異性有待考查；無法實現(xiàn)自動化，結(jié)果判讀主觀；測定結(jié)果受溫度和時間影響較大；沒 有通過國家的批批檢；價格較高。（三）免疫印跡試驗梅毒免疫印跡試驗（Western blot ）與作為HIV 抗體確認的免疫印跡試驗采用相同的原理和技術(shù)。既可檢測 IgG抗體，也可以檢測IgM抗體。目前已經(jīng)有商品化的試 劑盒供應(yīng)，但價格高昂。檢測特異性的梅毒抗體條帶，分子量分別為15.5、17、45.5和47 kdo梅毒IgG免疫印跡試驗的敏感性和特異性均可以達到甚至超過免疫熒光吸附 的水平。有文獻報道，梅毒IgM免疫印跡試驗對先天性梅毒的診斷可能很有意義，其特異 性

19、至少達到90%而敏感性可達83%以上，高于這個熒光免疫吸附試驗19S IgM 73%的水平。（四）關(guān)于梅毒血清學(xué)試驗程序的探討先以非梅毒螺旋體抗原血清試驗（RPR或TRUST等）進行初篩，再以梅毒螺旋體抗原血清試驗（TPPA TPHA ELISA等）進行確認。該方案優(yōu)點是非梅毒螺旋體抗原 血清試驗價格低廉，使梅毒檢測成本較低；缺點是非梅毒螺旋體抗原血清試驗敏感性 比較差，容易出現(xiàn)漏檢。同時進行梅毒螺旋體抗原血清試驗和非梅毒螺旋體抗原血清試驗，優(yōu)點是技術(shù)上 的最佳方案，缺點是人力和試劑成本較高。第三個方案是先進行梅毒螺旋體抗原血清試驗，陽性時再進行非梅毒螺旋體抗原 血清試驗。梅毒血清學(xué)試驗程序可

20、以如何安排？各有哪些優(yōu)缺點?六.先天性梅毒的診斷先天性梅毒的診斷要結(jié)合臨床表現(xiàn)、物理檢查、影像檢查、血清學(xué)檢查和直接顯 微鏡檢查進行綜合判斷。先天性梅毒的癥狀有：鼻音、肝脾腫大、皮膚損傷、骨軟骨炎等，50%的梅毒患兒出生時沒有異常表現(xiàn)，多數(shù)在 3周至的月時出現(xiàn)上述癥狀中的一項或幾項，可能更 晚出現(xiàn)（出生2年以后），特征有畸型、耳聾、失明、弱智等。由于母體的螺旋體直接 進入胎兒的血循環(huán)，因此先天性梅毒均直接表現(xiàn)為二期梅毒。從臍帶、胎盤、新生兒 皮損處采樣，在顯微鏡下直接檢查到梅毒螺旋體可以確診先天性梅毒。新生兒梅毒抗體滴度如果高于母親，也可以診斷為先天性梅毒，這種情況約占先天性梅毒診斷的22%但相反的情況則不能排除是先天性梅毒。新生兒梅毒特異性IgM抗體檢測陽性可診斷為先天性梅毒，但陰性不能夠排除。從母體被動獲得的梅毒 IgG抗體在新生兒體內(nèi)代謝、清除需要 12 -