登革熱檢測規(guī)程

1、登革熱（一）登革病毒感染與機體免疫反應登革病毒感染后，潛伏期為314天，通常47天，潛伏期內(nèi)采集的患者標本尚不能檢出登革病毒或相應的機體免疫反應。發(fā)病后，病毒在血液中存在的時間（病毒血癥期）約為7天，病毒NS1抗原在血液存在的時間略長。發(fā)病后45天內(nèi)，可在病人的血清、血漿、白細胞、腦脊液和尸檢組織標本中分離到病毒，病毒核酸及NS1抗原在這個時期的檢出率高。病人血液中抗體水平，因個體免疫狀態(tài)不同而具有顯著差異。若以前沒有感染過登革病毒或其他黃病毒，或接種過黃病毒疫苗（如：乙腦、黃熱等），病人首次感染抗體免疫反應呈現(xiàn)為特異性抗體水平緩慢升高，IgM抗體出現(xiàn)最早，隨后出現(xiàn)的是IgA和IgG抗體。在發(fā)

2、病后35天的患者中IgM抗體檢出率約為50%發(fā)病后第5天的患者中檢出率約為80%而在發(fā)病后第10天患者中，約99%的患者可檢出。IgM抗體水平在發(fā)病后2周達高峰，然后逐步下降，可保持23個月。IgA抗體出現(xiàn)略晚于IgM抗體，可保持約45天。在發(fā)病一周后，可在血液標本中檢出較低滴度的IgG抗體，之后抗體滴度緩慢升高，可持續(xù)存在多月甚至終生。如果病人屬于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染過登革病毒，有時可能是曾接種其他黃病毒疫苗或感染過其他黃病毒），抗體滴度可快速升高并可和多種黃病毒產(chǎn)生反應。主要為高水平的IgG抗體，在急性期即可檢出，可持續(xù)存在10個月以上，甚至終生。IgA抗體也可在急性

3、期標本中檢出。再次感染登革病毒的病人恢復期早期的IgM抗體滴度明顯低于首次感染，甚至無法檢出，通過計算IgM/IgG 抗體比例，可以區(qū)分首次或再次登革病毒感染。IgA抗體檢測試劑在臨床診斷中的應用尚處于評價階段。登革病毒IgM/IgG 抗體檢測規(guī)程【方法】 膠體金法【預期用途】登革熱（Dengue Fever ）是 一種由登革病毒引起的急性傳染病，主要流行于熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)。登革病毒為單股正鏈 RNA病毒，在分類學上屬于黃病毒科，黃病毒屬（flavivirus ）。病毒核心為RNA與蛋白質組 成的20面立體對稱的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組成的包膜，包膜含有型和群特異性抗原。病毒基因編碼

4、3個結構蛋白（核衣殼蛋白C，膜蛋白M，包膜蛋白E）和7個非結構蛋白（NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5 ）。登革病毒感染可導致機體產(chǎn)生免疫應答，并產(chǎn)生病毒特異性的抗 體。初次感染者，發(fā)病后 3 - 5天可在血液中檢出病毒 IgM抗體，發(fā)病2周后達到高峰，可維持 2 - 3個月， 發(fā)病1周后可檢出病毒IgG抗體，IgG抗體可維持數(shù)年甚至終生。檢測臨床登革熱癥狀的病人樣本中登革病毒 抗體，有助于登革熱的輔助診斷。【檢驗原理】Au-Dengue-Ag ）和羊IgG檢測線，IgM檢采用膠體金免疫層析技術，在玻璃纖維上預包被膠體金標記的登革病毒抗原（IgG（Au-羊IgG），

5、在硝酸纖維素膜上測線和對照線處分別包被鼠抗人IgG單克隆抗體，鼠抗人IgM 單克隆抗體和鼠抗羊IgG單克隆抗體。檢測陽性標本時，樣本中登革熱病毒與 Au-Dengue-Ag結合形成復合物，由于層析作用復合物沿紙條向前移動，經(jīng) 過IgG單抗（或鼠抗IgM 單抗）形成 Au-Dengue-AgIgM單抗）固相材料”夾心物而富集顯色，膠體金標記 羊IgG單克隆抗體結合富集顯色，陰性標本則僅在對照線處顯色。線）時與預包被的鼠抗 人人IgG單抗（或鼠抗 人IgG抗體（或IgM抗體）IgG檢測線 IgM檢測（或病毒抗體-鼠抗DengueIgG則在對照線與鼠抗羊【試劑組成成分】1，登革病毒IgM/IgG 抗

6、體試劑檢測線：鼠抗人 IgM抗體、鼠抗人IgG抗體對照線：鼠抗羊 IgG抗體結合墊：膠體金標記登革病毒抗原和膠體金標記羊IgG2，梓品稀釋液3, 2uL吸管【樣本要求】1 ,檢測樣本為血清或血漿，避免溶血。 血漿可用肝素、檸檬酸鈉2 ,或EDTA抗凝。2- 8C密封保 7天，長期保存需冷-20C，忌反復凍3 ,采集后的標本及時檢測，存凍融?！緳z驗方法】檢測前先將冷藏的試劑和待測樣本恢復至室溫1 ,處理好樣本，取出試劑檢測卡，水平放置并作好標記。S1孔）2uL刻線，滴加在檢測卡樣本孔2 ,用移液器吸取樣本2uL，或以試劑配置吸管吸取樣本至（在檢測卡稀釋液孔）樣品稀釋液3 ,（S 孔）滴加 2 滴

7、（70-100UL4 ,20分鐘同觀察記錄結果?！窘Y果報告】陽性:質控線（質控 線（質 控線（陰性：C）和檢測線（C）和檢測線（C）和檢測線 （G）、檢測線（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病 毒0）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgG抗體。M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgM抗體IgM/lg 抗體。G僅在質控線C）出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測區(qū)（ （毒抗體或抗體濃度低于試劑的檢出水平。M ）、檢測區(qū)G）未出現(xiàn)紫紅色帶，表示樣品中沒有登革?。l無效：質控線（C）未出現(xiàn)紫紅色條帶，表示操作不當或者試劑失效，應重新檢測【報告方式】檢測線（G）、檢測線M ）都出現(xiàn)紫紅色條

8、（帶抗體測定：IgM陽性（+ ）|gG陽性 +）登革熱病毒IgM/IgG（【注意事項】1 ，檢測按照傳染病實驗管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定操作，實驗后按傳染性廢物處理。2，操作應嚴格按說明書進行。3，保持良好的實驗室環(huán)境。4，嚴格控制在20分鐘內(nèi)觀察結果，20分鐘后觀察結果無效 ?！緜魅拘詮U物處理】1 ，所有實驗室工作人員應熟知并遵守本制度；由專職清潔人員負責實驗廢棄物處理。實驗室放置裝有垃圾袋的有蓋污物桶，并貼有明顯標識。2，每天實驗結束后，及時清理并妥善包裹廢棄物，送出實驗室并作好實驗室廢棄物處理記錄。3，不具有傳染性的實驗室廢棄物（如產(chǎn)品包裝材料和廢紙等辦公垃圾），應與傳染性廢棄物區(qū)分開

9、來，作為普通廢棄物單獨送醫(yī)療廢物集中處理中心統(tǒng)一處理。4，血袋、裝血液的試管、離心管、吸頭等由科室洗滌人員用有效氯濃度0.3 %的愛爾施消毒液充分浸泡（60120分鐘），進行初步消毒處理。5 ,進行初步消毒處理的血袋、試管和與受血液污染的棉球、紙片、一次性口罩、帽子等傳染性或可疑傳染性廢棄物一起放入黃色膠袋中，由廢物集中處理中心無害化處理中心封 閉運輸至焚燒中心進行無害化焚燒處理。6 ,每天實驗前，在清洗盆中加入半盆有效氯濃度0.3 %的愛爾施消毒液，實驗中將玻片、離心管、吸管、吸頭等回收物品充分浸泡（60 120分鐘），進行初步消毒處理。7,收集一天的污染物品用流動水沖洗，然后進行高壓滅菌處

10、理。登革熱NS1抗原檢測規(guī)程【方法】膠體金法【預期用途】本試劑采用免疫層析技術，定性檢測人血清、血漿或者全血中的登革熱NS1抗原。適用于登革病毒感染的早期輔助診斷和篩查。登革熱是由登革病毒（分4個血清型，DEN 1 - 4 ）引起的，通過伊蚊傳播的急性傳染病，多見于熱帶和亞熱帶地區(qū)。臨床類型可分為登革熱、登革熱出血熱和登革休克綜合征三種，該病傳播迅速，主要臨床表現(xiàn)包 括發(fā)熱、頭痛、全身肌肉關節(jié)疼痛、極度乏力、皮疹、淋巴結腫大、白細胞減少。初次感染登革熱病毒患者， 一般臨床表現(xiàn)較輕，可表現(xiàn)為無癥狀隱性感染，或輕型、典型登革熱；再次感染異型登革病毒時，病情較為 嚴重，臨床上出現(xiàn)登革出血熱和休克綜合

11、征的概率增加，病死率高，是一種具有嚴重危害性的傳染病。【檢驗原理】本試劑方法采用免疫層析法，應用雙抗體夾心法定性檢測登革熱NS1抗原。登革熱NS1抗原測試條的硝酸纖維素膜檢測區(qū)（T）上包被有抗登革熱病毒NS1蛋白單克隆抗體，質控區(qū)（C）上包被有抗鼠IgG多克隆抗體，當樣本中含有登革病毒NS1抗原且濃度高于最低檢出限時，標記有膠體金的抗登革病毒NS1蛋白單克隆抗體下血清、血漿或全血中的登革病毒NS1抗原結合形成反應復合物，在層析作用下復合物沒著硝酸纖維素膜向前移動，與硝酸纖維素膜上檢測區(qū)（T）預先包被的抗登革熱NS1抗原單克隆抗體結合形成復合物，并最終形成一條肉眼可見的紅色反應線，此時的結果為陽

12、性。相反，當樣本中不含有登革病毒NS1抗原且濃度低于最低檢出限時，則檢測區(qū)（T）無紅色反應線出現(xiàn)，此時結果為陰性。無論樣本中是否有NSI抗原，在質控區(qū)（Q都會形成一條紅色反應線?！局饕M成成份】試劑盒由測試卡和吸管組成。測試條由硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水紙、PVC板等其他支持物組。硝酸纖維素膜包被有抗登革病毒 NS1蛋白單克隆抗體和抗鼠IgG多克隆抗體，結合墊含有膠體金標記的抗登革病毒NS1蛋白單克隆抗體。【樣本要求】血清、血槳、全血樣本均可用于測1 , 試。2-8C 冷藏，全血樣本需在32 ,全血樣本采集后盡可能立即使用，如不能立即檢測可蔣樣本放置于天內(nèi)完成檢測。血清/血槳如不能及時

13、測試應放置2-8C冷藏，可保存兩周，如需長期保存應-20C冷凍保存，3 , 于置測試前注意恢復至室溫。4 ,注意高濃度的黃疸樣本、高度溶血樣本、或肉眼可見多絮狀沉積的乳糜血樣本，將對檢測結果的干擾，因此在使用樣本前注意樣本的外觀?！緳z驗方法】檢測前先將冷藏的試劑和待測樣本恢復至室溫1,取出測試卡平放于臺上，并做好標記，有吸管吸取樣本血清/ 血槳/全血樣本，垂 2-3滴（約60- ）于加樣孔2直加入80uL中，3，15-20 分鐘觀察顯示結果，30 分鐘后顯示結果無臨床意義?！窘Y果報告】NS1抗原陽性：兩條紅色線，即在檢測區(qū)（T）及質控區(qū)（C）各出現(xiàn)一條紅色線。NS1抗原陽性：一條紅色線，即在質控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紅色。無效：即在質控區(qū)（C）無紅色反應線出現(xiàn)。此時建義重測?！緳z驗方法局限性】1，當測試樣本中登革病毒NS1抗原低于最低檢出限或在感染的某個階段不存在將會