細(xì)胞融合操作規(guī)程1

1、細(xì)胞融合一、實(shí)驗(yàn)材料手術(shù)剪，鑷子，離心機(jī)，蠟盤等。二、實(shí)驗(yàn)所配試劑1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液：取一包 1640干粉，溶于 1000 mL 雙蒸水中， 慢慢加入2.5 g NaHCOs, 0.22呵濾膜過濾除菌，分裝，4C冰箱保存 備用。青鏈霉素溶液（100X）：取青霉素100萬單位和鏈霉素1 g,無 菌溶于100mL已滅菌的三蒸水中，0.22 g濾膜過濾除菌，1 mL/管 分裝，-20 C凍存?zhèn)溆谩?640完全培養(yǎng)液：向 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入 10的小牛血清和 1%青鏈霉素溶液（100X）（為養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，建議不加最好）， 搖勻，4 C冰箱保存?zhèn)溆谩T 培養(yǎng)液：在 100 mL 含 15

2、%血清的 1640完全培養(yǎng)液中加入 1 mL 100X的HT溶液，搖勻，4C冰箱保存?zhèn)溆?。HAT 培養(yǎng)液：在 100 mL 含 15%血清的 1640完全培養(yǎng)液中加入 2 mL 50X的HAT溶液（使用前HAT有部分白色沉淀應(yīng)充分混勻），搖 勻，4 C冰箱保存?zhèn)溆谩NK 溶液：準(zhǔn)確稱取 KCL 0.4g , NaCL 8g , Na2HPO4 2H2O 1.77g（Na?HPO4 2H2O 3.56g）, NaH2PO4 H2O 0.69g（NaHzPO4 2 H2O 0.78g）,酚紅0.01g,葡萄糖2g,加DDW 定容至1000mL,調(diào)節(jié)pH值 至7.2, 115C高壓滅菌，4C保存?zhèn)?/p>

3、用。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 免疫小鼠選擇6-8周齡的Balb/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量 50創(chuàng)只， 皮下注射。免疫程序如下：首次免疫：100抗原+100讓弗氏完全佐劑/只加強(qiáng)免疫：100抗原+100山 弗氏不完全佐劑/只，于首免后2 周后進(jìn)行。共免疫 3 次，每次間隔 2周。第二次免疫后的第十天斷尾 采血（一般尾部采血4山，溶于200山PBS混勻備用）檢測效價(jià)，如 果效價(jià)很低或沒有效價(jià)，建議直接放棄，不用繼續(xù)再免疫。如果效價(jià) 可以，在二免后的 2 周進(jìn)行三免，最后一次免疫 10天后，斷尾采血， 用適當(dāng)?shù)目乖M(jìn)行包被，用間接 ELISA 檢測抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到 1:1600 以上即可進(jìn)行細(xì)胞融合。

4、超強(qiáng)免疫：最后一次加強(qiáng)免疫后 2 周，細(xì)胞融合前 35天，尾靜 脈或腹腔注射50血純抗原。2. 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備融合前1-2 d制備飼養(yǎng)細(xì)胞。取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清， 以供篩選時(shí)用該血清做陰性對照） ， 75%酒精消毒體表，無菌手術(shù)剪 刀輕輕剝?nèi)バ∈蟮母共科つw，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用 5mL注射器和16號針頭將5mL預(yù)冷的HAT打入小鼠腹腔，輕輕壓擠 腹部，重新吸出注入的液體（在吸取過程中為防止污染， 避免針頭刺 破腸管），收取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。用 HAT稀釋至40ml, 100uL/孔添加到4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二 天檢查有無污染情況。

5、3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)為保證NS0細(xì)胞在融合時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)和咼活力，建議在融合時(shí)前一天給所需的每瓶 NS0細(xì)胞換液，以備融合時(shí)使用。80%左右NS0的細(xì)胞計(jì)數(shù)(三次平均數(shù))：(11.6X 105+9X 105+3.7 x 105) /3=8.1 x 105/mL脾細(xì)胞計(jì)數(shù)6.5XlO6/mL,大約是40mL有2.6 x 108個(gè)細(xì)胞，兩次計(jì) 數(shù)相差不大，所以脾細(xì)胞數(shù)可固定為 2.6 x 108個(gè)/40mL。NS0細(xì)胞計(jì)數(shù)：3.7 x 105 個(gè)/mL( 70%9X 105個(gè)/mL (80%)11.6 X 105個(gè)/mL (90%脾細(xì)胞計(jì)數(shù):4. 細(xì)胞融合在40C水浴中預(yù)熱 GNK溶液、PEG和HAT溶

6、液；免疫小鼠采血并分離血清，然后致死浸泡到酒精中；收集NSO細(xì)胞于50 mL離心管中（為保證高融合率建議大于 4瓶 90%的NS0細(xì)胞），1000 r/min離心10 min,棄上清，用GNK洗一次； 5小鼠脾細(xì)胞的制備依次剪開小鼠皮膚，腹膜暴露腹腔（建議為防止污染，建議至少 用兩套手術(shù)刀具，一套用于剝開小鼠外部皮膚和腹膜， 另一套用于取 出小鼠脾臟），取脾臟放置與尼龍紗布上充分研碎，并用GNK洗下去，收集脾細(xì)胞于50 mL離心管中，1000 r/min離心10 min,棄上清， 打散細(xì)胞團(tuán)；將脾細(xì)胞與NS0骨髓瘤細(xì)胞混合于50 mL離心管中，力口 GNK溶 液至40 mL，1000 r/mi

7、n離心10 min，棄上清，打散細(xì)胞團(tuán)（充分打 散細(xì)胞團(tuán)，以保證融合時(shí)的高融合率）；為保證融合時(shí)的溫度可以事先將混勻好的細(xì)胞在40 C水浴預(yù)熱兩 分鐘，然后在另一剛?cè)〕龅?0C水浴燒杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管將預(yù)熱的50%PEG（ pH8.0）滴加到融合管中，邊加邊輕輕 搖動融合管， 1min 或 80s 內(nèi)加完，并繼續(xù)在水浴中緩緩搖動融合管 1.5min。立即緩慢滴加37C預(yù)熱的GNK溶液15mL。加入步驟為：1mL/30s, 3 mL/30s , 11 mL/30s。然后慢慢補(bǔ)加 GNK 溶液至 40mL, 37C水浴靜置 5min, 1000 r/min離心10 min,棄上清

8、。打散細(xì)胞團(tuán)，加 40mL HAT 完全培養(yǎng)具吹打混勻，加到含飼養(yǎng)細(xì) 胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100，置37C 5% CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。克隆細(xì)胞的篩選、轉(zhuǎn)孔及亞克隆一、融合細(xì)胞的培養(yǎng)1、融合后的細(xì)胞置于 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日檢查有無污染, 如發(fā)現(xiàn)污染立即滴加 1%的 NaOH。2、一般23d可見小克隆；7d時(shí)于出現(xiàn)克隆的孔內(nèi)半量換液（注 意：37 C預(yù)熱HAT培養(yǎng)基）；3、10d左右可以吸取少量上清用于篩選（一般吸取 50100山）, 并補(bǔ)加等量的 HAT 培養(yǎng)基（換液時(shí)應(yīng)輕柔,以減少對克隆細(xì)胞的損 傷）；4、14d 左右對所篩選的陽性孔可半量更換 HT 培養(yǎng)基,同時(shí)對篩 選陽性

9、孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)至 24 孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng),準(zhǔn)備克隆化。在篩選 過程中將 HAT 培養(yǎng)基逐漸更換為完全培養(yǎng)基 RPMI1640/10。、篩選(1)包被。將抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每塊酶標(biāo)板以5-20ug 抗原為宜(如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)， 則需要加大包被量， 如果是純化病毒根據(jù)病毒的濃度做 1 :400- 1 000倍稀釋) 。每孔的包被 體積為50ul。37C包被2h或4C包被過夜。( 2 )封閉。倒掉抗原，拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，5% 脫脂牛奶 ( PBST溶解)或其它無關(guān)物種血清于 37C封閉2h,封閉完后可立即使用， 也可以洗滌一次置于4C密封保存以備后面使用。(

10、3)一抗。封閉完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，用封閉液1:1 稀釋待檢測克隆孔上清，每孔 50ul 為宜。同時(shí)做陽性(融合小鼠血清 1:500-1000倍稀釋) 和陰性(所制備飼養(yǎng)細(xì)胞小鼠血清 1:200倍稀釋) 及空白對照(所稀釋抗體用封閉液) 和無克隆孔上清對照。在每塊板 子上做好標(biāo)記。37 C孵育30min。( 4)二抗。孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以 PBST 洗滌 3 次，每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋二抗至適當(dāng)比例，每孔加入 50ul, 37C孵育 30min。(5)顯色。孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑，37C 顯色5-10min,拍照記錄檢測結(jié)果，篩選出陽性較強(qiáng)的克

11、隆進(jìn)行特異 性檢測。三、特異性篩選對篩選的強(qiáng)陽性克隆孔進(jìn)行特異性篩選, 如果是用大腸桿菌表達(dá) 的蛋白, 可以用載體蛋白、 正常大腸桿菌上清以及其它無關(guān)蛋白進(jìn)行 包板檢測；如果是細(xì)胞毒免疫的可以用正常細(xì)胞的裂解液包板檢測；如果是組織毒免疫的可以用正常動物組織包板檢測。其檢測方法同 上，注意設(shè)立對照組。同時(shí)對篩選的特異性較強(qiáng)的陽性孔轉(zhuǎn)至 24 孔 培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，準(zhǔn)備克隆化。四、陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)孔1、為保證轉(zhuǎn)孔成功，建議當(dāng) 96 孔板細(xì)胞長至 80%時(shí)轉(zhuǎn)孔。2、按常規(guī)方法轉(zhuǎn)孔前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞， 24 孔板每孔加入 0.5-1ml 的飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，第二天檢查有無污染情況。 （轉(zhuǎn)孔時(shí)所用培養(yǎng)基和 轉(zhuǎn)孔

12、前所用培養(yǎng)基應(yīng)保持一致） 。3、收集待轉(zhuǎn)孔的陽性細(xì)胞上清，做好標(biāo)記保存?zhèn)溆?，添加已預(yù)熱的HAT 和 HT 培養(yǎng)基 1:1 混合（因此時(shí) 96 孔板克隆已半量過度到 HT 培養(yǎng)基）各100ul/孔。4、用 200ul 移液器輕輕吹下細(xì)胞，為減少對克隆細(xì)胞的刺激，吹打 過程應(yīng)輕柔，然后將細(xì)胞懸液加入至 24 孔板中，為保證細(xì)胞均勻分 布到板底， 可以用振蕩器輕輕混勻， 做好標(biāo)記。同時(shí)，對所轉(zhuǎn)孔細(xì)胞 補(bǔ)加新的培養(yǎng)基，保留原始孔以避免轉(zhuǎn)孔失敗。五、轉(zhuǎn)孔后的檢測當(dāng)轉(zhuǎn)孔后細(xì)胞長至 50%時(shí)，用 ELISA 檢測方法及時(shí)進(jìn)行效價(jià)檢 測和特異性檢測， 檢測方法同上， 篩選出效價(jià)高和特異性較強(qiáng)的準(zhǔn)備 亞克隆。同

13、時(shí)在篩選過程中對 24孔板的細(xì)胞逐步更換至 1640完全培 養(yǎng)基。六、雜交瘤細(xì)胞的克隆為保證克隆細(xì)胞的活性和數(shù)量， 建議當(dāng)待克隆的細(xì)胞孔長至 80% 時(shí)進(jìn)行有限稀釋。 提前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞， 收集待轉(zhuǎn)孔細(xì)胞的培養(yǎng)上 清保存?zhèn)溆?，加入已預(yù)熱1640不完全培養(yǎng)基1ml （其目的是該孔細(xì) 胞被有限稀釋后可以凍存該孔細(xì)胞。凍存方法為：直接吸取 500 ul 該孔細(xì)胞懸液，再加入 400 ul 胎牛血清和 100 ul DMSO 混勻， 1ml/ 管，做好標(biāo)記，按照正常程序凍存細(xì)胞） ，輕輕吹打混勻細(xì)胞，取出 少許細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)， 采用有限稀釋法對陽性孔的融合細(xì)胞進(jìn)行克 隆化。其步驟如下：1、用 10

14、ul 臺盼藍(lán)和 10ul 細(xì)胞懸液于 PCR 管中等比例混合后， 在顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)公式：細(xì)胞數(shù) /mL = N/4 x 103 X 10 X稀釋倍數(shù)（N為顯微鏡下四角4個(gè)大方格的活細(xì)胞總數(shù)）來計(jì)算每 毫升細(xì)胞懸液所含的活細(xì)胞數(shù)，然后取適量的細(xì)胞懸液，用 1640 培 養(yǎng)基（此時(shí) 24 孔板克隆細(xì)胞過度到那種培養(yǎng)基就用那種培養(yǎng)基做有限稀釋）稀釋到10mL,并且要含有2X 103個(gè)活細(xì)胞（稀釋度I）;2、 取1mL稀釋度I的細(xì)胞懸液加 9mL1640完全培養(yǎng)基（稀釋 度H）；3、取3mL稀釋度H的細(xì)胞懸液加 7mL1640完全培養(yǎng)基（稀釋 度皿）;4、 用稀釋度I的細(xì)胞懸液鋪板半塊 96孔板，100 /孔，20個(gè) 細(xì)胞/孔；用稀釋度H的細(xì)胞懸液鋪板另半塊 96孔板，100此/孔，2 個(gè)細(xì)胞/孔；用稀釋度皿的細(xì)胞懸液鋪一塊 96孔板，100 gL/孔，0.6 個(gè)細(xì)胞 /孔；5、將上述培養(yǎng)板置于 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng) 7d 后，對單克隆 孔進(jìn)行標(biāo)記并半量換液，當(dāng)