中樞嗎啡預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)

1、麻醉學(xué)基礎(chǔ)研究 中青年優(yōu)秀論文評(píng)獎(jiǎng)中樞嗎啡預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的信號(hào)機(jī)制研究安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科, 安徽 合肥 230601陸 姚, 張 野* *Tel:mail: *zhangye 【摘要】目的 觀察從側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響，探討中樞阿片受體在其中的作用及其機(jī)制。方法 建立側(cè)腦室內(nèi)置管和心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，隨機(jī)分為11組，每組6只。假手術(shù)組(Sham組)；對(duì)照組（CON組）；側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理組（MPC組），側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理方法：在缺血再灌注前30min內(nèi)，側(cè)腦室內(nèi)微量泵恒速輸注

2、嗎啡（1µg·kg-1，用生理鹽水稀釋到5µl）5min，停止注射5min，共3個(gè)循環(huán)；在側(cè)腦室內(nèi)輸注嗎啡前10min側(cè)腦室內(nèi)注射三種阿片受體阻斷劑nor-Binaltorphimine(阿片受體阻斷劑，nor-BNI+MPC組)、CTOP (阿片受體阻斷劑，CTOP+MPC組)、Naltrindole (阿片受體阻斷劑，NTD+MPC組)和鈣調(diào)蛋白特異性抑制劑三氟拉嗪trifluoperazine（TFP，TFP+MPC組）；另設(shè)三種阿片受體阻斷劑和鈣調(diào)蛋白特異性抑制劑三氟拉嗪的自身對(duì)照組(nor-BNI、CTOP、NTD和TFP組)，上述三種阿片受體阻斷劑的劑

3、量均為15 nmol(nM)，三氟拉嗪劑量為100µg，均用生理鹽水稀釋到5 µl。觀察指標(biāo)包括：平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)，計(jì)算平均動(dòng)脈壓和心率乘積(RPP)；心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR)、梗死區(qū)(IS)的體積、心肌梗死面積以IS/AAR表示；檢測(cè)血漿降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)釋放水平；測(cè)定下丘腦室旁核、心肌缺血區(qū)和非缺血區(qū)P物質(zhì)以及海馬組織鈣調(diào)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 各組在各時(shí)點(diǎn)的HR、MAP和RPP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與CON組相比， MPC組的IS和IS/AAR均明顯降低（P

4、0.01，P 0.05）；nor-BNI+MPC、CTOP+MPC、NTD+MPC和TFP+MPC組IS和IS/AAR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與CON組比較，MPC組血漿CGRP水平明顯增高（P 0.01）；nor-BNI+MPC、CTOP+MPC、NTD+MPC和TFP+MPC組血漿CGRP水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。CON組分別與Sham組和MPC組相比，其下丘腦室旁核、心肌缺血區(qū)和非缺血區(qū)P物質(zhì)表達(dá)均明顯增高(P < 0.01, P < 0.05)。與CON組相比，MPC組鈣調(diào)蛋白的表達(dá)明顯增加（P 0.01）。結(jié)論 側(cè)腦室內(nèi)注射嗎

5、啡預(yù)處理可以模擬缺血預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，并且中樞、和三種阿片受體均參與介導(dǎo)。其機(jī)制可能與鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)釋放CGRP和痛覺的干預(yù)有關(guān)。關(guān)鍵詞：?jiǎn)岱?；?cè)腦室；心肌再灌注損傷；缺血預(yù)處理；鈣調(diào)蛋白；降鈣素基因相關(guān)肽；P物質(zhì)The signal mechanism of cardioprotection induced by intracerebroventricular morphine preconditioning on ischemia/ reperfusion injury heart LU Yao, ZHANG Ye(1.Dept of Anesthesiolo

6、gy, Second Affiliated Hospital of Anhui Medical Univesity, Hefei 230022, China)Abstract: Aim To investigate the protective effect of intracerebroventricular morphine preconditioning to myocardial ischemia/reperfusion injury in intact rat heart and the mechanism of this cardioprotection. Methods Rats

7、 were established intracerebroventricular catheter placement and myocardial ischemia/reperfusion models randomly assigned to 11 group: Sham group(S); ischemia/reperfusion group (I/R); intracerebroventricular morphine preconditioning group(MPC); nor-BNI+MPC, CTOP+MPC, NTD+MPC and TFP+MPC(three kinds

8、of opioid receptor antagonist and calmodulin antagonist intracerebroventricular 10 min before intracerebroventricular morphine) and itself control(nor-BNI, CTOP, NTD and TFP). Indicators to be observed were composed of MAP, HR and RPP(MAP×HR); the volume of area at risk(AAR) and infarct size(IS

9、); and the area of myocardial infarction, which was demonstrated by IS/AAR. Meanwhile, the CGRP in the blood plasma was tested by radioimmunity protocol; the epression of calmodulin in the hippocampus was determined by Western blot; expression of SP in the hypothalamic paraventricular nucleus, ische

10、mia and non-ischemia myocardium area was determined by immunohistochemical method. Results Compared with other groups, the volume of IS and IS/AAR reduced in MPC group(P 0.01); the calcitonin gene related peptide(CGRP) in the blood plasma and expression of calmodulin in the hippocampus were higher t

11、han other groups(P 0.01); compared with CON group, integrated optical density of SP in MPC group expressed in paraventricular hypothalamic nucleus, ischemia and non-ischemia myocardial were lower(P < 0.01, P < 0.05). Conclusions Intracerebroventricular morphine preconditioning can produced car

12、dioprotective effect against ischemia/reperfusion injury, which involved in CGRP mediated by calmodulin in hippocampus and also associated with analgesia. Key words: morphine；lateral ventricle；myocardial reperfusion injury；ischemic preconditioning；calmodulin；calcitonin gene related peptide；substance

13、 P在體、離體大鼠缺血后心臟保護(hù)作用研究表明，外周靜脈給予阿片類藥物預(yù)處理對(duì)大鼠缺血后的心肌具有保護(hù)作用，并且、和三種阿片受體均參與介導(dǎo)1,2。由于成年大鼠心臟上只有只有和阿片受體，無受體3。所以我們推測(cè)可能是通過心臟以外的器官或系統(tǒng)作用，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。最近研究4,5表明通過鞘內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理可以產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，且脊髓中樞上、和三種阿片受體均參與介導(dǎo)。另外在有關(guān)預(yù)處理早期和延期心肌保護(hù)研究68發(fā)現(xiàn)，缺血或藥物預(yù)處理均可以使得內(nèi)源性的降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)釋放增加，從而認(rèn)為其可能在這種保護(hù)作用中起著關(guān)鍵的角色。嗎啡是

14、臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥物，P物質(zhì)(Substance P, SP)在痛覺的傳遞中起著關(guān)鍵的角色。下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus, PVN)對(duì)心血管功能具有調(diào)節(jié)作用9。先前的研究10表明嗎啡靜脈預(yù)先給藥可以降低急性心肌缺血大鼠心肌組織SP的表達(dá)。本研究主要觀察從側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理對(duì)在體大鼠缺血后心臟的影響，探討中樞阿片受體在其中的角色及其可能的機(jī)制。1 材料與方法1.1 動(dòng)物模型 側(cè)腦室內(nèi)置管動(dòng)物模型的建立11 SD大鼠(300±25)g，。5 %戊巴比妥鈉40 mg· kg -1，ip。麻醉后的大鼠固定在腦立體定位儀(

15、藍(lán)星B型，淮北振華生物科技有限公司)上，裸露顱骨，根據(jù)Paxinos-Watson圖譜11定位側(cè)腦室置管位置(坐標(biāo)：P1.5 mm，R1.5 mm，H3.0 mm)，用大鼠顱骨鉆鉆孔，將內(nèi)徑0.36 mm、外徑0.71 mm導(dǎo)管插入側(cè)腦室，腦脊液流出后，插入內(nèi)芯，用502膠混合牙托粉固定在顱骨上，以備側(cè)腦室給藥用，術(shù)后肌注青霉素10萬U，動(dòng)物均予以分籠單獨(dú)飼養(yǎng)3天，以備實(shí)驗(yàn)。有感覺或運(yùn)動(dòng)障礙大鼠棄去不用。 心臟缺血/再灌注損傷模型的建立1,2 所有成功側(cè)腦室內(nèi)置管的大鼠，5 %戊巴比妥鈉40 mg· kg -1，ip。麻醉后氣管切開、插管后連接動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-300型，成都泰盟生物

16、科技有限公司)行機(jī)械通氣，潮氣量24 ml/kg，頻率70-80次。右股動(dòng)脈切開置管，接壓力換能器，連接PowerLab Systems(AD公司，澳大利亞)，記錄心電圖(ECG)、血壓(BP)和心率(HR)；右股靜脈切開置管用于輸液。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在左4-5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟。在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，方法是用6-0 Prolene線(強(qiáng)生公司，美國)作一線結(jié)，把心臟放回胸腔。穩(wěn)定15 min后，收緊線結(jié)即形成左冠狀動(dòng)脈閉塞致心肌缺血，表現(xiàn)其支配的局部心肌發(fā)紺、血壓下降，ECG呈心肌梗死改變(ST段抬高或降低等)；松開線結(jié)即可實(shí)現(xiàn)再灌注

17、。實(shí)驗(yàn)結(jié)束側(cè)腦室內(nèi)注射亞甲藍(lán)，確定側(cè)腦室置管的位置準(zhǔn)確性和有無損傷腦組織。1.2 藥品試劑 嗎啡(批號(hào)070808，沈陽第一制藥廠)，nor-Binaltorphimine(nor-BNI，阿片受體阻斷劑)、CTOP(CTOP，阿片受體阻斷劑)、Naltrindole(NTD，阿片受體阻斷劑)，3種阻斷劑均購自美國Sigma公司；三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP，Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，使用濃度為100mmolL-1，磷酸鹽緩沖液pH 7.4，溶解)，兔抗大鼠SP多克隆抗體(Chemicon公司)；兔抗大鼠鈣調(diào)蛋白多克隆抗體(Cell sig

18、nalling公司)；ECL發(fā)光試劑盒(Pierce公司)；兔抗大鼠-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、S-P通用型免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司；CGRP試劑盒(解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所)。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 成功建立動(dòng)物模型的大鼠，隨機(jī)分為11組，每組6只。假手術(shù)組(Sham組)，大鼠開胸后在冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線不結(jié)扎，也不給予任何處理；對(duì)照組（CON組），在缺血再灌注前30min內(nèi)，側(cè)腦室微量泵恒速輸注0.9%生理鹽水5µl 5min，停止注射5min，重復(fù)三次；側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理組（MPC組）：在缺血再灌注前30min內(nèi)，側(cè)

19、腦室內(nèi)微量泵恒速輸注嗎啡（1µg·kg-1，用生理鹽水稀釋到5µl）5min，停止注射5min，共3個(gè)循環(huán)；在側(cè)腦室內(nèi)輸注嗎啡前10min側(cè)腦室內(nèi)注射三種阿片受體阻斷劑nor-Binaltorphimine(阿片受體阻斷劑，nor-BNI+MPC組)、CTOP (阿片受體阻斷劑，CTOP+MPC組)、Naltrindole (阿片受體阻斷劑，NTD+MPC組)和鈣調(diào)蛋白特異性抑制劑三氟拉嗪trifluoperazine（TFP，TFP+MPC組）；另設(shè)三種阿片受體阻斷劑和鈣調(diào)蛋白特異性抑制劑三氟拉嗪的自身對(duì)照組(nor-BNI、CTOP、NTD和TFP組)，上述三

20、種阿片受體阻斷劑的劑量均為15 nmol(nM)，三氟拉嗪劑量為100µg，均用生理鹽水稀釋到5 µl。1.4 觀察指標(biāo) 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定 比較各組手術(shù)穩(wěn)定后15 min(基礎(chǔ)值)、處理后、缺血30 min后和再灌注120 min后平均動(dòng)脈壓(MBP)和心率(HR)，計(jì)算平均動(dòng)脈壓和心率乘積(RPP)。 心肌梗死面積測(cè)定 在再灌注120 min時(shí)，取出心臟，去除非心臟組織，生理鹽水灌注，沖洗出血液，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈,從主動(dòng)脈用注入0.25 % Evan氏藍(lán)溶液。置-80 冰箱備用。將速凍心臟從心尖到心基平切5-6片，2 mm厚的心肌片。置1%氯化三苯基四氮唑溶液中，37 (

21、pH 7.4)溫孵15 min，染色，然后用10%福爾馬林固定，缺血危險(xiǎn)區(qū)為紅色，梗死區(qū)為白色，用SigmaScan program 4圖像分析軟件計(jì)算左心室(LV)、右心室(RV)、缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR)和梗死區(qū)(IS)體積，然后計(jì)算左心室(LV)與右心室(RV)體積之和，心肌梗死面積用梗死區(qū)與缺血危險(xiǎn)區(qū)面積之比(IS/ARR)表示。 血漿CGRP的測(cè)定 在再灌注120 min時(shí)，從股動(dòng)脈取23 ml血，加入含有100 g·L-1乙二胺四乙酸鈉30 ml和抑肽酶40 l的試管中，混勻，3000 r/min離心10 min，分離血漿，-20 下保存待測(cè)定。采用放射免疫法測(cè)定血漿中CGR

22、P含量。 P物質(zhì)(SP)表達(dá)的測(cè)定 在再灌注120 min時(shí)，快速取出心臟，并從頸動(dòng)脈逆行灌注4%多聚甲醛100 ml固定，根據(jù)Paxinos-Watson圖譜11在前囟后1.8 mm垂直冠狀面切下含有PVN的腦組織。常規(guī)固定和包埋腦和心臟標(biāo)本，用切片機(jī)連續(xù)做5 m厚的冠狀切片、脫蠟，P物質(zhì)一抗按1：7500稀釋，并按S-P法進(jìn)行免疫組化染色，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(用PBS替代第一抗體)，在倒置相顯微鏡(奧林巴斯，日本)(×400)下拍取圖像。用Image-pro plus 6.0版圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析測(cè)定累積光密度(integrated optical density，IOD)。 海

23、馬鈣調(diào)蛋白表達(dá)的測(cè)定 在再灌注120 min時(shí)，分離雙側(cè)海馬，常規(guī)提取蛋白，蛋白定量后SDS-PAGE電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔抗大鼠CaM一抗(1:1000)孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1:5000) 37 2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，曝光、顯影、定影。利用Image-pro plus 6.0版圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析測(cè)定X線片上條帶的平均光密度值，以目的蛋白條帶與-actin蛋白條帶平均光密度值的百分比值表示相對(duì)含量。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 4.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 ± s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Ne

24、wman-Keuls分析，P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 各組HR、MAP和RPP在缺血30min和再灌注120min都有降低，但各時(shí)點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。Tab 1。Tab 1 Hemodynamic parameters( ± s, n = 6).GroupBaselineTreatment30 min occlusion120 min reperfusionHR MAP RPPHR MAP RPPHR MAP RPPHR MAP RPPCON404±29117±1047±6394

25、7;21111±1644±8352±2682±1929±8325±1789±829±3MPC395±18105±1241±6376±1697±2537±11343±1568±823±4317±1978±827±5nor-BNI387±25111±2043±8379±25105±2140±8346±2373±1925&#

26、177;7332±2882±1225±5CTOP382±18110±1842±7375±18104±1539±6340±2271±524±2322±2178±1427±6NTD388±14113±2343±9377±15110±2241±9343±2272±1725±6326±2483±1525±3TFP407±151

27、06±1444±6390±9100±1039±4361±976±628±3336±1288±729±3nor-BNI+MPC390±17108±1442±7380±1595±2137±9346±1369±1224±5326±2084±1227±5CTOP +MPC390±20103±2040±7384±1197±173

28、7±6344±2171±1624±4323±2080±1027±3NTD+MPC391±20112±2244±8381±17106±1541±5345±2575±1026±3324±2779±1325±5TFP+MPC389±17111±1443±5382±15106±1341±5343±2174±725±2325&#

29、177;2179±1126±4HR: heart rate ( bpm ); MAP: mean arterial blood pressure ( mmHg ); RPP: rate pressure product ( mmHg/ min/1000 )2.2 心臟病理指標(biāo)改變 各組左心室(LV)與右心室(RV)體積之和、AAR體積差異無顯著性(P > 0.05)。與CON組相比， MPC組IS體積和IS/ARR均明顯降低 (P < 0.01)，表明側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。nor-BNI+MPC、CTOP+MPC、NTD+MP

30、C和TFP+MPC組與自身對(duì)照組(nor-BNI、CTOP、NTD和TFP組)與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)，而與MPC組相比其IS體積和IS/ARR均明顯增加(P < 0.01)，表明三種阿片受體阻斷劑和三氟拉嗪(TFP)本身對(duì)IS體積和IS/ARR沒有影響，但可消除側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。Tab 2。Tab 2 Morphometrics lateral ventricle and activity of plasma concentrations of CGRP morphine preconditioning( ±

31、; s, n = 6)GroupLV+RV volume/cm3ARR volume/cm3IS volume/cm3IS/AAR (%)CGRP(pg/ml)CONMPC0.90±0.120.41±0.070.22±0.0753.5±13.132±90.88±0.080.38±0.080.08±0.03* *20.2±6.2* *112±34* *nor-BNI0.92±0.070.42±0.040.23±0.0553.0±9.130±8CTO

32、PNTD0.89±0.070.41±0.040.22±0.0552.5±8.433±80.86±0.110.42±0.050.22±0.0553.0±9.232±8TFPnor-BNI+MPC0.84±0.050.40±0.050.21±0.0551.2±9.342±230.90±0.040.40±0.050.19±0.02# #48.5±5.3# #41±12# #CTOP+MPCNTD+MPC

33、0.92±0.090.41±0.060.20±0.06# #48.4±9.1# #47±12# #0.93±0.050.42±0.040.20±0.04# #47.8±9.7# #42±8# #TFP+MPC0.89±0.070.39±0.030.19±0.04# #49.3±7.6# #48±18# #LV：left ventricle；RV：right ventricle；AAR：area at risk；IS：infarct size. *

34、 * P <0.01 vs CON group；# # P <0.01 vs MPC group2.3 血漿CGRP指標(biāo)的變化 與CON組相比，MPC組血漿中CGRP水平明顯升高(P < 0.01)；而nor-BNI+MPC、CTOP+MPC、NTD+MPC和TFP+MPC組與MPC組相比其水平又明顯降低(P < 0.01)，表明側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理可以使得血漿中CGRP釋放增加，而應(yīng)用三種阿片受體阻斷劑和鈣調(diào)蛋白抑制劑三氟拉嗪(TFP)后又能消除血漿中CGRP釋放增加這種效應(yīng)。Tab 2。2.4 下丘腦室旁核(PVN)、心肌缺血區(qū)與非缺血區(qū)SP的表達(dá) PVN和心肌免

35、疫組化結(jié)果顯示SP陽性細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色、胞核不著色。與Sham組相比，CON組心肌有明顯的損傷，缺血區(qū)心肌纖維排列紊亂，有壞死和融合區(qū)；而MPC組可以明顯降低這種損傷。與Sham組相比，CON組下丘腦室旁核、心肌缺血區(qū)和非缺血區(qū)SP的表達(dá)水平均明顯增加(P < 0.01)；而MPC組則與CON組比較，下丘腦室旁核、心肌缺血區(qū)和非缺血區(qū)SP的表達(dá)水平明顯降低(P < 0.01，P < 0.05)。以上表明心肌缺血再灌注損傷可以使下丘腦室旁核和心肌P物質(zhì)表達(dá)顯著增加，而經(jīng)過側(cè)腦室內(nèi)嗎啡預(yù)處理后其表達(dá)均明顯降低。Fig 1、Fig 2，Tab 3。Fig 1 Expression

36、 of substance P in hypothalamic paraventricular nucleus(×400)A：Sham group；B：CON group；C：MPC group；3V：Third ventricle 3VA3VB3VCFig 2 Expression of substance P in ischemia and non-ischemia myocardial area(×400)non-ischemia myocardial area：A：Sham group；B：CON group；C：MPC groupischemia myocardi

37、al area：D：Sham group；E：CON group；F：MPC groupABCDEFTab 3 The integrated optical density(IOD) of substance P in PVN, ischemia and non-ischemia myocardial( ± s, n = 6)GroupPVNnon-ischemia myocardialischemia myocardialSham28.40±10.26315.40±90.39476.59±93.75CON86.55±13.75* *590.6

38、4±220.96* *1133.53±239.02* *MPC34.18±10.43# #362.41±140.79*617.34±147.61# #* * P <0.01 vs Sham group；* P < 0.05 , # # P <0.01 vs CON group2.5 海馬鈣調(diào)蛋白(CaM)的表達(dá) 與CON組相比，MPC組大鼠海馬中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)明顯增高(P < 0.01)；而TFP+MPC組和TFP組分別與CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)，但均高于MPC組(P < 0.01)，

39、表明側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理可以使得海馬鈣調(diào)蛋白的表達(dá)水平增高，而應(yīng)用鈣調(diào)蛋白抑制劑三氟拉嗪(TFP)后又能消除這種增加的效應(yīng)。Fig 3。-actin43 kD16.7 kDCaMTFP+MPCMPCTFPCON# #* *Fig 3 Expression of calmodulin(CaM) in the hippocampus( ± s, n = 6)* * P <0.01 vs CON group；# # P <0.01 vs MPC group3 討論本研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能由海馬組織中鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)

40、源性的CGRP的釋放所介導(dǎo)；同時(shí)這種保護(hù)效應(yīng)可能還與痛覺的干預(yù)有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，并且、和三種阿片受體均介導(dǎo)這種保護(hù)作用1。然而在成年大鼠心臟上只有和受體，無受體3，而后研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)離體大鼠心臟具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用只能被和受體，而沒有被受體阻斷劑所消除，進(jìn)一步證明心臟上只有和受體介導(dǎo)這種保護(hù)作用2。中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布有大量的阿片受體，所以對(duì)在體動(dòng)物，阿片類藥物的作用不僅僅作用于心臟阿片受體，同時(shí)也作用于中樞阿片受體。另外，已知中樞神經(jīng)系統(tǒng)阿片受體的激動(dòng)會(huì)對(duì)心血管產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能通過中樞抑制交感張力和直接或間接擴(kuò)

41、張血管作用等，并且含有阿片受體的中樞核團(tuán)參與了鎮(zhèn)痛和心血管功能的調(diào)節(jié)12。嗎啡是臨床常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥，以激動(dòng)受體為主，同樣也激動(dòng)和受體13。Groban等14研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射嗎啡可以降低心肌缺血再灌注損傷引起的心肌梗死面積，與靜脈嗎啡作用相似。我們最近的研究進(jìn)一步證明鞘內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)，并且脊髓中樞上的、和三種阿片受體均介導(dǎo)這種效應(yīng)4,5。于是我們通過側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡，其可以直接與中樞阿片受體結(jié)合，發(fā)現(xiàn)顯著降低缺血后心肌梗死面積，對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。研究15證明SP在心血管應(yīng)激反應(yīng)中起著非常重要的角色。而在心肌缺血等應(yīng)激情況下，下丘腦室旁核和心肌上SP的

42、表達(dá)顯著增加，通過應(yīng)用靜脈嗎啡預(yù)先給藥可以降低急性心肌缺血引起的SP表達(dá)的增加10,16。本研究結(jié)果表明CON組與Sham組相比，其下丘腦室旁核、心肌缺血區(qū)和非缺血區(qū)SP表達(dá)明顯增加，而MPC組與CON組相比其SP表達(dá)明顯減少，說明側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)的效應(yīng)可能與SP有關(guān)。SP是最先發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，其在痛覺傳遞、血管擴(kuò)張、胃腸運(yùn)動(dòng)等方面起著重要的作用。下丘腦參與疼痛的調(diào)節(jié)機(jī)制，在這些部位阿片受體分布極為豐富，是阿片樣物質(zhì)參與調(diào)節(jié)疼痛的重要基礎(chǔ)。另外下丘腦還是心血管功能調(diào)節(jié)的中樞。痛覺的干預(yù)是急性心肌梗死治療的中的一項(xiàng)措施，所以我們可以推測(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制

43、可能與痛覺的干預(yù)有關(guān)。CGRP是一種神經(jīng)遞質(zhì)，有強(qiáng)心、擴(kuò)張血管的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的內(nèi)源性血管舒張物質(zhì)。短暫缺血和藥物預(yù)處理均可引起CGRP的釋放增加68。而應(yīng)用CGRP灌注離體心臟或用促CGRP釋放劑(辣椒素)也可模擬IPC效應(yīng)17。心肌預(yù)處理促進(jìn)CGRP生成與釋放，而CGRP是一種內(nèi)源性的保護(hù)物質(zhì)，說明其在預(yù)處理心肌保護(hù)作用中起著很重要的作用7。CGRP的釋放不僅僅來源于外周的感覺神經(jīng)末梢，同樣也可直接來源于中樞末端。研究證明阿片類藥物與鈣調(diào)蛋白的相互作用影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放18，而且Ca2+/鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路參與CGRP的生成與釋放。鈣調(diào)蛋白廣泛分布于大腦海馬組織中，Niu等19證明

44、阿片類藥物可以調(diào)節(jié)Ca2+/鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路，并且有報(bào)道20認(rèn)為嗎啡可以增加大鼠大腦中鈣調(diào)蛋白的含量。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過從側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理，海馬組織中鈣調(diào)蛋白表達(dá)顯著增加，并且血漿CGRP釋放水平的增加與其成正相關(guān)，最終產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)。給予鈣調(diào)蛋白特異性的阻斷劑TFP后發(fā)現(xiàn)血漿中CGRP的釋放水平減少，同時(shí)這種保護(hù)效應(yīng)也被取消。所以我們推測(cè)這種保護(hù)作用可能與海馬組織中鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)源性的CGRP釋放有關(guān)。總之，側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，并且這種保護(hù)效應(yīng)機(jī)制可能涉及兩個(gè)方面：一個(gè)可能與海馬組織中鈣調(diào)蛋白的作用引起內(nèi)源性CGRP釋放水平增加有關(guān)；另一個(gè)

45、可能與痛覺的干預(yù)有關(guān)。參考文獻(xiàn)：1 Zhang Y, Irwin M G, Wong T M. Remifentanil preconditioning protects against ischemic injury in the intact rate heartJ. Anesthesiology, 2004, 101 : 918-23.2 Zhang Y, Irwin M G, Wong T M, et al. Remifentanil preconditioning confers cardioprotection via cardiac kappa- and delta-opioid

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