口腔鱗狀細(xì)胞癌近紅外拉曼光譜特征及其診斷價(jià)值研究

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌近紅外拉曼光譜特征及其診斷價(jià)值研究        【摘要】     目的 探索近紅外拉曼光譜技術(shù)及化學(xué)計(jì)量法在口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集正?？谇火つそM織10例、鱗狀細(xì)胞癌組織20例、白斑30例進(jìn)行近紅外拉曼光譜掃描，分析不同病變類型的特征性光譜，通過化學(xué)計(jì)量法進(jìn)行分析建模，并評(píng)價(jià)其分類診斷效力。結(jié)果 相對(duì)于正常組織，鱗狀細(xì)胞癌及白斑中DNA、蛋白及脂類合成增強(qiáng)，表現(xiàn)出較明顯的增殖活性。在對(duì)鱗狀細(xì)胞癌和正常組織的建模比較中，診斷準(zhǔn)確度98

2、.81%;在鱗狀細(xì)胞癌與白斑建模診斷中，診斷準(zhǔn)確度96.30%。結(jié)論 近紅外拉曼光譜檢測結(jié)合支持向量機(jī)分類建模技術(shù)，可以檢測到口腔正常黏膜、白斑及鱗狀細(xì)胞癌樣本中的生化物質(zhì)變化，并進(jìn)行準(zhǔn)確分類建模診斷。     【關(guān)鍵詞】  口腔鱗狀細(xì)胞癌; 白斑; 近紅外拉曼光譜; 支持向量機(jī); 診斷    Near infrared Raman spectral character and diagnostic value of squamous cell carcinoma of oral mucosa LI Yi

3、1, WEN Zhi-ning2, LI Long-jiang1，3, LI Meng-long2, ZHANG Zhuang1, GAO Ning1. (1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Analytical Chemistry, College of Chemistry, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 3. Dept. of Head and Neck Oncology, We

4、st China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)Abstract Objective To evaluate the value of the near infrared Raman spectroscope in diagnosing oral squamous cell carcinoma(OSCC). Methods Near infrared Raman spectra of ten normal mucosa, twenty OSCC and thirty oralleukoplak

5、ia(OLK) cases were collected in the research. Based on the previous researches, the information of the sub-tracted spectra of compared group was gained by the characteristic band in them. A Gaussian radial basis function support vector machine was used to classify spectra and establish the diagnosti

6、c models. The efficacy and validity of the algorithm were evaluated. Results By analyzing the subtracted mean spectra, the increasing peak intensity in wavenumber range of 500-2 200 cm-1 hinted us of the high contents of DNA, protein and lipid in OSCC, which elucidate the high proliferative activity

7、. The increasing peak intensity in the wavenumber range of 500-2 200 cm-1 hinted us of the high contents of DNA, protein and lipid in OSCC, which elucidate the high proliferative activity, but the difference between OLK and OSCC was not as much as that between normal and OSCC. The Gaussian radial ba

8、sis function support vector machine showed powerful ability in grouping and modeling of normal and OSCC, and the specificity, sensitivity and accuracy were 100%, 97.44% and 98.81% correspondingly. The algorithm showed good ability in grouping and modeling of OLK and OSCC, the specificity, sensitivit

9、y and accuracy were 95.00%, 86.36% and 96.30%. Conclusion Combined with support vector machines, near infrared Raman spectroscopy could detect the biochemical variations in oral normal, OLK and OSCC, and establish diagnostic model accurately.Key words oral squamous cell carcinoma; oral leukoplakia;

10、near infrared Raman spectra; support vector machine; diagnosis口腔癌的發(fā)病率位居全身惡性腫瘤發(fā)病率的前10位，是威脅人類健康的主要疾病之一1。目前雖然出現(xiàn)了多種全新治療方法，使患者治療后的生存質(zhì)量明顯提高，但生存率卻無明顯改善2，術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因。究其死亡根本原因在于早期診斷方法匱乏，錯(cuò)失了治療的最佳時(shí)機(jī)。研究3表明，拉曼光譜技術(shù)對(duì)構(gòu)成人體的基本生化物質(zhì)非常靈敏，通過光譜分析可以獲得大量有關(guān)生化成分含量、構(gòu)型構(gòu)象、組成及構(gòu)成比的信息。拉曼光譜技術(shù)在惡性腫瘤的診斷和治療等方面已得到跨越式發(fā)展。應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測消化

11、系統(tǒng)、乳腺、女性生殖系統(tǒng)等癌變細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)的變化發(fā)現(xiàn)，通過組織細(xì)胞光譜特征的檢測可有效地在微觀水平反映組織形態(tài)學(xué)的細(xì)微變化，為癌癥的早期診斷提供強(qiáng)大的理論依據(jù)4-7。本研究采用近紅外拉曼光譜技術(shù)及化學(xué)計(jì)量法，對(duì)口腔正常黏膜、白斑(oral leukoplakia，OLK)及口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)組織標(biāo)本內(nèi)組織及細(xì)胞生化物質(zhì)的變化進(jìn)行檢測，應(yīng)用徑向基核函數(shù)支持向量機(jī)對(duì)不同病變進(jìn)行分類建模，并驗(yàn)證其分類準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，以了解口腔黏膜細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的光譜學(xué)變化規(guī)律，為應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)早期診斷口腔黏膜惡性病變奠定理論基礎(chǔ)。1 材料和方

12、法1.1 臨床資料收集2006年1月2007年12月在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頜面外科進(jìn)行治療的30例口腔黏膜白斑患者和20例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的病理切片，所有病理切片均根據(jù)世界衛(wèi)生組織腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)(2005年版)8診斷。同時(shí)收集10例人群的口腔正常黏膜組織，常規(guī)固定，石蠟包埋。對(duì)每一標(biāo)本連續(xù)切片，厚度為5 m，隨機(jī)選取相鄰2張并貼片。其中1張切片以蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，邀請(qǐng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)豐富的2位病理學(xué)家及1位頭頸腫瘤外科醫(yī)生，將HE切片置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行會(huì)診，精確定位黏膜白斑及鱗狀細(xì)胞癌所在區(qū)域，并在切片上標(biāo)示;另1張切片于定制的CaF

13、2晶片上貼片，常溫下風(fēng)干后，以純二甲苯脫蠟30 min，浸入95%乙醇內(nèi)洗滌30 min，風(fēng)干，對(duì)照HE切片，確定此切片的組織病理類型及相應(yīng)病損區(qū)域。1.2 傅立葉轉(zhuǎn)換近紅外拉曼光譜檢測采用Nicolet Nexus670型紅外顯微拉曼光譜儀(Nicolet公司，美國)對(duì)病損區(qū)域進(jìn)行掃描，獲得其特征性拉曼光譜。掃描的具體參數(shù)為：激光功率1 W，波長1 064 nm，波數(shù)范圍1003 800 cm-1。應(yīng)用光譜處理軟件OMNIC for Raman 6.0對(duì)獲取的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正，獲得不同分類組織的平均光譜，通過分類平均光譜相減獲得正常組織、白斑、鱗狀細(xì)胞癌光譜間的差異光譜，結(jié)合以往拉曼光譜

14、研究中所獲得峰位置歸屬指認(rèn)差異光譜中特征峰所代表的化學(xué)物質(zhì)變化信息。1.3 化學(xué)計(jì)量法分析對(duì)基線校正的譜圖采用Matlab軟件的小波函數(shù)bior4.4進(jìn)行平滑處理，采用四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析化學(xué)教研室編寫的Matlab支持向量機(jī)程序建立不同疾病的拉曼光譜數(shù)據(jù)診斷模型，采用“留一法”校驗(yàn)診斷模型的準(zhǔn)確度，計(jì)算其特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度、Matthew相關(guān)系數(shù)9和預(yù)測穩(wěn)定性10。相關(guān)公式如下：特異性Sp=;靈敏度Se=;準(zhǔn)確度Acc=;Matthew相關(guān)系數(shù)MCC=;預(yù)測穩(wěn)定性error=;R=。其中，TP為正樣本預(yù)測正確數(shù)，F(xiàn)P為正樣本預(yù)測錯(cuò)誤數(shù)，TN為負(fù)樣本預(yù)測正確數(shù)，F(xiàn)N為負(fù)樣本預(yù)測錯(cuò)誤數(shù)。2

15、結(jié)果本研究共獲得正常、白斑及鱗狀細(xì)胞癌病變區(qū)域的特征性拉曼光譜154張，其中正常組織46張，輕度異常增生40張，中度異常增生16張，重度異常增生32張，鱗狀細(xì)胞癌20張。正常組織、白斑及鱗狀細(xì)胞癌的平均光譜見圖1。從圖1可見，不同病變類別的光譜在6001 800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)存在一定的差異。從上到下依次為鱗狀細(xì)胞癌、白斑及正常組織的平均光譜。圖 1 正常組織、白斑及鱗狀細(xì)胞癌的平均光譜Fig 1 Mean Raman spectrum of normal tissue, OLK and OSCC2.1 平均差異光譜分析鱗狀細(xì)胞癌與正常組織、白斑與正常組織、鱗狀細(xì)胞癌與白斑間的差異光譜見圖

16、24。從圖2可見，口腔正常黏膜與鱗狀細(xì)胞癌的平均光譜差異明顯，主要在5002 200 cm-1范圍內(nèi)，其中747、897、930、1 060、1 092、1 125、1 610及1 666 cm-1峰位的增強(qiáng)提示在鱗狀細(xì)胞癌中DNA、蛋白及脂類合成增強(qiáng)，表現(xiàn)出較明顯的增殖活性，而在3 250 cm-1峰位的減弱提示其蛋白質(zhì)N-H伸縮震動(dòng)降低，也可作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)。白斑與正常組織相比其差異沒有鱗狀細(xì)胞癌與正常組織明顯，具有意義的是，751、780和1 071 cm-1峰位的增強(qiáng)提示其色氨酸、DNA及脂質(zhì)含量升高，顯示較強(qiáng)的增殖活性，而白斑在3 250 cm-1峰位的降低也可作為診斷依據(jù)(圖3)。鱗

17、狀細(xì)胞癌相對(duì)于白斑，其差異主要在5002 200 cm-1范圍內(nèi)，其中747、897、1 060、1 092、1 125、1 344及1 610 cm-1峰位的增強(qiáng)，提示在鱗狀細(xì)胞癌中DNA、蛋白及脂類合成較白斑增強(qiáng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖活性，但此差別較鱗癌與正常組織差別明顯減弱(圖4)。圖 2 鱗狀細(xì)胞癌與正常組織間的差異光譜Fig 2 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OSCC圖 3 白斑與正常組織間的差異光譜Fig 3 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OLK2.2 化學(xué)計(jì)量法

18、診斷分類在經(jīng)過小波變換后，對(duì)不同分類組織的拉曼光譜信息通過支持向量機(jī)進(jìn)行分析。選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=2，在46個(gè)正常組織的拉曼光譜中，45個(gè)樣本被歸于正常組，正確率97.83%;在20個(gè)鱗狀細(xì)胞癌的拉曼光譜中，全部光譜都被劃分于鱗狀細(xì)胞癌組，正確率100%。圖 4 鱗狀細(xì)胞癌與白斑間的差異光譜Fig 4 Subtracted mean spectrum of OLK and OSCC選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=2，在46個(gè)正常組織的拉曼光譜中，27個(gè)樣本被歸于正常組，正確率58.70%;在88個(gè)白斑的拉曼光譜中，74個(gè)樣本歸于白斑組，正確率84.09%。去除輕度異常增生的拉曼

19、光譜后，選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=4，在46個(gè)正常組織的拉曼光譜中，有38個(gè)樣本被歸于正常組，正確率82.61%;在48個(gè)白斑的拉曼光譜中，39個(gè)樣本被歸于白斑組，正確率81.25%。選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=1，在20個(gè)鱗狀細(xì)胞癌的拉曼光譜中，19個(gè)樣本被歸于鱗狀細(xì)胞癌組，正確率95.00%;在88個(gè)白斑的拉曼光譜中，85個(gè)樣本被歸于白斑組，正確率96.59%。去除重度異常增生的拉曼光譜后，選擇正則化參數(shù)C=3，核函數(shù)寬度=1，結(jié)果在38個(gè)鱗狀細(xì)胞癌拉曼光譜中，所有樣本都被歸于鱗狀細(xì)胞癌組，正確率100%;在56個(gè)白斑的拉曼光譜中，53個(gè)樣本歸于白斑組，正確率94.64%。根

20、據(jù)以上結(jié)果，計(jì)算所得診斷模型分類的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度、Matthew相關(guān)系數(shù)和預(yù)測穩(wěn)定性見表1。3 討論近紅外拉曼光譜具有以下特點(diǎn)而適合于人體組織檢測3：1)人體組織對(duì)近紅外波長激發(fā)光的消光系數(shù)較小，光束能夠更深地進(jìn)入組織，為較大組織塊和表面下層組織的研究提供機(jī)會(huì);2)更小的光吸收可降低樣品的光分解作用，從而可應(yīng)用更高的激光能量激發(fā)試樣，獲得更強(qiáng)烈的拉曼散射效應(yīng);3)近紅外波長的激發(fā)光能輕易通過光導(dǎo)纖維傳遞，為近距離獲得組織樣本的診斷性拉曼光譜提供可能;4)水份對(duì)近紅外激光的吸收作用很弱，從而在近紅外拉曼光譜檢測中消除了水份干擾，在水份構(gòu)成70%95%細(xì)胞組分的情況下，這一特點(diǎn)尤為重要。K

21、rishna等4應(yīng)用顯微拉曼光譜儀結(jié)合近紅外拉曼光譜儀分析，發(fā)現(xiàn)正常組織、良性腫瘤及惡性腫瘤的平均光譜存在明顯差異;惡性腫瘤的平均光譜與正常組織差別較大，最明顯的表現(xiàn)為酰胺帶強(qiáng)度下降、CH2帶輕微位移、8001 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)多個(gè)譜帶及酰胺帶強(qiáng)度相對(duì)改變，這可以作為區(qū)分不同病變的標(biāo)準(zhǔn)。Kumar等5對(duì)正常和惡變的新鮮胃黏膜進(jìn)行近紅外拉曼光譜掃描發(fā)現(xiàn)，在酰胺、帶和CH2相應(yīng)波數(shù)范圍內(nèi)，正常胃黏膜中含有更高的脂質(zhì)成分，而惡變黏膜中蛋白質(zhì)成分更加豐富。本研究通過不同組織分類的平均差異光譜發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正?？谇火つ?，白斑和鱗狀細(xì)胞癌在活躍增殖過程中，由于其分裂、生長加速而伴有明顯的遺傳物質(zhì)含

22、量升高、細(xì)胞合成功能增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RNA、DNA及相應(yīng)核苷酸、蛋白質(zhì)及脂類含量升高，在其拉曼光譜上以特征峰或相應(yīng)峰值升高表現(xiàn)出來，可以用作鑒別診斷。拉曼光譜數(shù)據(jù)中包含大量無關(guān)緊要的信息，在保證拉曼光譜基本特征不變的前提下，需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取其中有意義的內(nèi)容，并去除偽峰干擾以建立判別模型，為惡性腫瘤診斷和治療提供客觀依據(jù)。本研究采用支持向量機(jī)進(jìn)行分析，它是一種具有學(xué)習(xí)功能的計(jì)算分析方法，其最大的特點(diǎn)在于其所需的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集較小，結(jié)果比較穩(wěn)定，鑒于研究中樣本數(shù)量限制及診斷準(zhǔn)確性的要求，這一點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中尤為重要。在對(duì)鱗狀細(xì)胞癌和正常組織的建模比較中，診斷模型的分類功能較強(qiáng)大，其對(duì)于鱗癌

23、和正常組織的分類結(jié)果較準(zhǔn)確，并且診斷模型預(yù)測穩(wěn)定性較高。白斑與正常組織的分類比較結(jié)果并不十分理想。在去除訓(xùn)練集中輕度異常增生的數(shù)據(jù)后，其分類效果有所提高，由此可知白斑與正常組織的拉曼光譜存在客觀差別，但鱗癌和正常組織的差別明顯減小，這說明白斑在正常組織和鱗癌間處于過渡狀態(tài);在去除輕度異常增生的訓(xùn)練數(shù)據(jù)后，兩者間的分類效力提高，其原因可能在于輕度異常增生與正常組織差別較小，從而在所有白斑樣本和正常組織的對(duì)比中削弱了中、重度異常增生的光譜特異性，導(dǎo)致白斑總體與正常組織的分類效力降低。鱗狀細(xì)胞癌與白斑的分類比較結(jié)果較為理想。在去除訓(xùn)練集中重度異常增生的數(shù)據(jù)，其分類效果有所提高，尤其是分類準(zhǔn)確度和穩(wěn)定

24、性提高明顯。由此可以推論鱗狀細(xì)胞癌與白斑存在較明顯的差異，其差異程度較白斑和正常組織更大，說明白斑在組織分化上更靠近正常組織;在去除重度黏膜異常增生的訓(xùn)練數(shù)據(jù)后，模型分類效果有所提高，這一結(jié)果與病理分類相互印證，即在病理分類中，重度黏膜異常增生已表現(xiàn)明顯的惡性傾向，發(fā)生惡變的關(guān)鍵性突變機(jī)會(huì)較輕、中度異常增生更大;此外，在病理分類中的誤判也可能造成以上分類結(jié)果的改變，即將鱗狀細(xì)胞癌誤分于重度黏膜異常增生組，從而導(dǎo)致差異減小，影響分類效力。    【參考文獻(xiàn)】  1 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Estim

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