本科畢業(yè)論文答辯最終定稿—吳威

1、貴州師范學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計） 學(xué)科分類號 070411S 本 科 畢 業(yè) 論 文（設(shè)計） 題 目 紫擬青霉紫色色素的穩(wěn)定性及生物活性研究 姓 名 吳威 學(xué) 號 1108060540061 院 （系） 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè) 生物資源科學(xué) 年 級 2011級 指導(dǎo)教師 張延威 職 稱 教授 二一五 年 五 月貴州師范學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計）誠信聲明本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文(設(shè)計)，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權(quán)爭議，除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體均已

2、在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 本科畢業(yè)論文作者簽名： 年 月 日目 錄摘要1關(guān)鍵詞1緒論31. 紫擬青霉色素的穩(wěn)定性研究61.1材料與方法61.1.1材料61.1.2方法 61.2結(jié)果與分析81.3小結(jié)122. 紫擬青霉色素的生物活性研究132.1 抑菌性132.1.1材料與方法132.1.1.1材料132.1.1.2方法132.1.2結(jié)果與分析152.1.3小結(jié)172.2 抗氧化性172.2.1材料與方法172.2.1.1材料172.2.1.2方法182.2.2結(jié)果與分析182.2.3小結(jié)202.3 對部分癌細(xì)胞的抑制作用202.3.1材料與方法202.3

3、.1.1材料202.3.1.2方法202.3.2結(jié)果與分析212.3.3小結(jié)212.4結(jié)論223. 結(jié)語22參考文獻(xiàn)23致謝27附錄28I摘 要 以紫擬青霉紫色色素粗提物為原料，研究其在水溶液中的穩(wěn)定性及生物活性。通過紫外分光光度計測定吸光度研究色素的穩(wěn)定性及抗氧化作用；采用濾紙片法研究色素的抑菌性；采用MTT法研究色素對部分癌細(xì)胞的抑制作用。試驗結(jié)果表明：該色素水溶液在常溫、糖等條件下較為穩(wěn)定；在Cu2+、Zn2+、Fe2+和10 %的H202存在條件下穩(wěn)定性較差；pH影響色素溶液的顏色變化；色素粗提物對金黃色葡萄球菌有很好的抑制效果，對青霉菌及黑曲霉無抑制作用；色素粗提物對HO·

4、及DPPH的清除率分別為8 %和17.614 %，表明該色素具有一定的抗氧化作用；另外，色素粗提物對癌細(xì)胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用。結(jié)論：紫擬青霉色素可為一種活性天然色素，具有一定的研究與開發(fā)利用價值。關(guān)鍵詞：紫擬青霉；色素；穩(wěn)定性；生物活性Abstract In this article, the stability and bio-activity of purpureus pigment on Paecilomyces purpureus were studied. The stability and antioxidant activity of the p

5、igment were inspected by the absorbance measured using ultraviolet spectrophotometer; The antibacterial activity of the pigment was measured by the filters method; The effect of anti-cancer activity of the pigment for some cancer cells were determined by the MTT method. Results showed that the pigme

6、nt of Paecilomyces purpureus was stable in natural temperature and was stable in sugar solution; While the stability of the pigment was poor in condition of Cu2+、Zn2+、Fe2+ and 10% H202 ; The change of the color on the pigment solution was observed in different pH; The effect of antibacterial on the

7、pigment was obvious to staphylococcus aureus, but no inhibition to penicillium and aspergillus Niger almost; The clearance of the pigment to HO·and DPPH were 8% and 17.614% respectively, which showed that the pigment had antioxidant activity. In addition, the pigment had inhibitory effect on ca

8、ncer cell of MDA, BPH, PC3 and K562. So, as active natural pigment, the purpureus pigment of Paecilomyces purpureushad had great development and utilization value.Keywords：Paecilomyces purpureus; Pigment; Stability; Bio-activity 緒論 （一）天然色素和合成色素 食用色素按其來源可分為化學(xué)合成色素和天然色素?；瘜W(xué)合成色素最早出現(xiàn)于18世紀(jì)，由于其色澤鮮艷、性質(zhì)比較穩(wěn)定、著

9、色力較強、成本較低等許多優(yōu)點，得到了廣泛的應(yīng)用與推廣。然而，化學(xué)合成色素大多數(shù)對人體具有毒害作用，其不僅體現(xiàn)在一般的毒性和致瀉性，有些還具有致癌性。目前，很多地區(qū)尤其是歐美等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家已經(jīng)嚴(yán)令禁止在食品、藥物等中使用化學(xué)合成色素。相對化學(xué)合成色素而言，食用天然色素是從動物、植物和微生物中獲得的天然著色物質(zhì)，大多數(shù)為花青素類、黃酮類、類胡蘿卜素類化合物，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，安全性較高，而且很多含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。此外，還有一些食用天然色素在清除自由基、抗氧化、抑制病原菌、降壓、降血脂、調(diào)節(jié)免疫力、保肝護(hù)肝等方面有重要作用，因此食用天然色素廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)療、保健、化工等領(lǐng)域。 （1）食用天然色素的

10、來源食用天然色素的種類有很多，按取材其主要來源于植物類色素、動物類色素和微生物類色素。 1）植物類色素。該類色素大多是從植物的根、莖、葉、果實、種子等中經(jīng)提取加工制成，是目前我國研究和應(yīng)用最多的色素。屬于這類的有甜菜紅、紫甘藍(lán)、山楂、梔子、一串紅、紅藍(lán)、黑豆紅、高粱紅、玉米黃、蘿卜紅、玫瑰茄紅、 - 葫蘿卜素等。 2）動物類色素。用于食用的動物類天然色素較少，如膽紅素、食用血紅素、蟲膠紅色素等 3）微生物類色素。研究和應(yīng)用最多的天然食用微生物類色素資是紅曲色素。紅曲紅色素是我國傳統(tǒng)使用的天然色素，安全且工藝性能較好，廣泛用于肉、果醬、豆、面、果汁等類食品的著色1-11。 （2）食用天然色素的應(yīng)

11、用 1）在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。主要用作食品的添加劑，如紅曲色素主要用于釀酒、釀醋、食品著色及肉類的防腐保存，制作腐乳等；高粱紅色素在肉灌制品、糖果和糕點上用作著色劑等。 2）在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的應(yīng)用。目前研究認(rèn)為北五味子紅色素有清除羥自由基的能力，具抗氧化活性；檳榔色素對DPPH·、OH· 的清除及對脂質(zhì)體過氧化的抑制能力很強；茶色素有拮抗高同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用；梔子黃色素具有瀉火、清熱利濕、解毒等功效；葉黃素可延緩眼睛退行性疾病的發(fā)生；番茄紅色素可以防止細(xì)胞的老化和病變，具有抗癌、防癌、活化免疫細(xì)胞等作用；辣椒紅色素可用來治療腦血管病；姜黃色素具有抗腫瘤、降血脂

12、和抗動脈粥狀硬化作用；蝦青素對由紫外線造成的皮膚癌具有很好的治療效果，可防治由糖尿病引起的眼?。缓诿咨啬鼙Ｗo(hù)血管內(nèi)皮，改善缺鐵性貧血作用；花生紅衣色素具有很好的抗氧化作用。3）其它方面。大多食用天然色素還具有很好的抑菌效果，如姜黃色素對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用，可用于抗凝、抗炎、防止老年斑的形成等方面；紅曲及紅曲色素對蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、螢光假單胞菌均有較強的抑制作用12-29。 （二）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀相對于西方發(fā)達(dá)國家我國的天然食用色素研究起步較晚，目前是天然色素與合成色素并存。我國目前允許使用的天然食用色素有60多種，其中優(yōu)勢品種有：焦糖色素、辣椒紅素、紅曲

13、紅、姜黃、梔子黃、高梁紅色素等。2005年我國天然色素的產(chǎn)量比2004增長29.6 %，總產(chǎn)量近30萬噸，2007用于著色劑的有32.46萬噸的產(chǎn)量，同比增長1.4 %，表明我國的天然食用色素的產(chǎn)量正在逐年增加。在國外尤其是有些發(fā)達(dá)國家食用天然色素的使用比例近85 %，其優(yōu)勢品種有果紅、胭脂蟲紅、紫檀素、藍(lán)綠色海藻、靛藍(lán)植物等，但目前尚有些如萬壽紅等色素未獲準(zhǔn)使用30-32。采用微生物生產(chǎn)天然色素是天然色素的主要來源之一。微生物中真菌類資源研究較廣，其化學(xué)穩(wěn)定性高、化學(xué)結(jié)構(gòu)及色調(diào)多樣性。天然色素的生產(chǎn)真菌主要包括一些大型真菌和絲狀真菌，但大型真菌色素性質(zhì)不太穩(wěn)定，難以在生產(chǎn)中進(jìn)行廣泛推廣和應(yīng)用

14、。絲狀真菌中研究較多的有紅曲霉、青霉、蟲草和擬青霉等。其中，紅曲霉色素的研究最為廣泛。目前對產(chǎn)紫青霉（Penicillium. purpurogenum Fleroff）及附球菌（Epicoccum spp.）等研究報道較多，但對擬青霉色素方面的研究很少，Youn Jeung Cho，Hye Jin Hwang等研究了營養(yǎng)條件和通氣量對蟬擬青霉（Paecilomyces sinclairii）產(chǎn)紅色素的影響；Ali Asaff，F(xiàn)rancisco Escobar等研究了金屬離子對玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）產(chǎn)色素的影響；Palanivel Velmurugan，Yong

15、 Hoon Lee等研究了光對粉質(zhì)棒束孢(Isaria farinosa)產(chǎn)色素的影響33-35。 （三）研究的目的和內(nèi)容 （1）研究目的天然食用色素廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品、肥皂、保健品等行業(yè)以滿足人們的不同需求。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和人類對自身健康的重視，人們對健康而營養(yǎng)豐富的天然食品的追求日益強烈。雖然天然色素主要來自動植物和微生物，且大多安全無毒，但與化學(xué)合成色素相比較食用天然色素性質(zhì)復(fù)雜，對光、熱、pH值及氧化較為敏感。而且因受到動植物種類、地理及季節(jié)的影響，導(dǎo)致食用天然色素供應(yīng)量不穩(wěn)定8，所以開展產(chǎn)天然色素菌株的相關(guān)研究有利于對其更有效地開發(fā)利用。紫擬青霉（Paecilomyc

16、es purpureus Z.Q. Liang & Y.F. Han）屬半知菌類、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青霉屬，是一種蟲生擬青霉，在培養(yǎng)過程中能大量產(chǎn)生天然紫色色素，色調(diào)少見。通過對該色素相關(guān)方面的研究，旨在為該色素日后的工藝提取及開發(fā)利用提供必要的參考。 （2）研究內(nèi)容 1）色素水溶液在溫度、金屬離子、氧化劑、還原劑等存在條件下的穩(wěn)定性； 2）色素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等的抑菌效果； 3）色素對HO·及DPPH的抗氧化作用； 4）色素對部分癌細(xì)胞的抑制作用。1. 紫擬青霉色素的穩(wěn)定性研究 1.1材料與方法 1.1.1 材料 1.1.1.1菌株：紫擬青霉，來自貴州大學(xué)真菌

17、資源研究所。 1.1.1.2 儀器：紫外分光光度計，島津UV2450型。 1.1.1.3藥品試劑：鹽酸、葡萄糖等為國產(chǎn)分析純。 1.1.2 試驗方法 1.1.2.1 粗提濃縮物的制備 將紫擬青霉接種于PDA液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)4-6天，再靜置避光培養(yǎng)20天，之后轉(zhuǎn)自然光培養(yǎng)10天，將液面菌絲取出，用無水乙醇浸提3 h，收集提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得色素粗提濃縮物。 1.1.2.2溫度對色素的影響 定量稱取0.20 g色素濃縮物，完全溶于200 mL蒸餾水中，在530 nm波長下測得其初始吸光度。將色素液定量分裝于五組試管中，分別置于20 、40 、60 、80 、97 下，每2小時測定其吸光

18、度（測時用蒸餾水補回原量搖勻）。 1.1.2.3金屬離子對色素的影響定量稱取0.20 g色素濃縮物，完全溶于200 mL蒸餾水中，在530 nm波長下測得其初始吸光度。將色素液定量分裝于十組試管中，取9只管分別同時添加20 mg的NaCL、MgSO4、無水CaCL2、ZnCL2、KCL、FeSO4、CuSO4、FeCL3、MnCL2（濃度均為20 mg/20 mL色素液），另一管作空白對照，每天室溫下測定其吸光度。 1.1.2.4氧化劑對色素的影響 定量稱取0.20 g色素濃縮物，完全溶于200 mL蒸餾水中，在530 nm波長下測得其初始吸光度。將色素液定量分裝于五組試管中（每管10mL色素

19、液），分別同時添加1 mL濃度為0 %、5 %、10 %、15 %、20 %的H202，每小時測定其吸光度。 1.1.2.5還原劑對色素的影響 定量稱取0.20 g色素濃縮物，完全溶于200 mL蒸餾水中，在530 nm波長下測得其初始吸光度。將色素液定量分裝于五組試管中（每管10 mL色素液），分別同時添加1 mL濃度為0 %、5 %、10 %、15 %、20 %的Na2SO3，每天測定其吸光度。 1.1.2.6糖對色素的影響定量稱取0.20 g色素濃縮物，完全溶于200 mL蒸餾水中，在530 nm波長處測得其初始吸光度。將色素液定量分裝于五組試管中，每組20 mL。其中4管依次添加0.2

20、0 g的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖，另一管做空白。每小時測定其吸光度。 1.1.2.7 pH對色素的影響定量稱取0.20 g色素濃縮物，完全溶于200 mL蒸餾水中，在530 nm波長處測定其初始吸光度。將色素液等量分裝于13組試管中，一組作空白，另外12組用pH計依次將pH調(diào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，同時測定其吸光度。 1.2結(jié)果與分析 1.2.1溫度對色素的影響 通過測定OD值考察不同的溫度對色素溶液穩(wěn)定性的影響，如圖1.1（0代表初始吸光度）： 圖1.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 Fig 1.1：the effect of the temperature on

21、 the stability of the pigment 由圖1.1可知，濃度為0.10 g/100 mL的色素溶液在20 、40 、60 、80 、97 條件下穩(wěn)定性較好，其中色素溶液在40 以后隨著溫度的升高其OD值相對于初始值在上升，8 h后測得上升百分比分別為2.5 %、8.7 %、16.3 %、26.3 %，說明溫度的升高對該色素具有一定的增色效果，推測其增色效果可能是由于隨著溫度的升高色素在水溶液中溶解更充分。 1.2.2金屬離子對色素的影響 通過測定OD值考察不同的金屬離子對色素溶液穩(wěn)定性的影響，如圖1.2（0代表初始吸光度）： 圖1.2 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 Fig 1

22、.2: the effect of the metal ions on the stability of the pigment由試驗結(jié)果得知，在金屬離子Na+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、K3+、Fe3+、Zn2+、Fe2+、Mn2+影響下，3d后該色素溶液（0.10 g/100 mL）OD值相對于空白組下降百分比分別為23.3%、43.5 %、79.8 %、11.5 %、7.4 %、2.6 %、81.2 %、72.5 %、19.3 %，其中Zn2+下降最多為81.2 %，F(xiàn)e3+下降最少為2.6 %。表明金屬離子對該色素溶液的穩(wěn)定性具有一定影響，其中Zn2+、Cu2+、Fe2+的影響較為

23、明顯。 1.2.3氧化劑對色素的影響 通過測定OD值考察不同濃度的H202對色素溶液穩(wěn)定性的影響，如圖1.3（0代表初始吸光度）： 圖1.3 氧化劑對色素穩(wěn)定性的影響 Fig1.3: the effect of the antioxidant on the stability of the pigment 由試驗結(jié)果得知，濃度為0.10 g/100 mL的色素溶液在濃度分別為5 %、10 %、15 %、20 %的H202條件下，3 h后其OD值相對于初始值下降百分比分別為10.8 %、38.1 %、14.2 %和17.9 %，表明濃度為5%、15%、20%的H202對色素溶液穩(wěn)定性影響較小，而

24、10 %的H202影響相對較大。 1.2.4還原劑對色素的影響 通過測定OD值考察不同濃度的Na2SO3對色素溶液穩(wěn)定性的影響，如圖1.4（0代表初始吸光度）： 圖1.4 還原劑對色素穩(wěn)定性的影響 Fig1.4: the effect of reducing agent on the stability of the pigment 由圖1.4可知，濃度為0.10 g/100 mL的色素溶液在濃度為5 %、10 %、15 %、20 %的Na2SO3條件下，3 h后其OD值相對于初始值下降百分比分別為5.4 %、13.5 %、16.6 %和17.9 %，表明四種不同濃度的Na2SO3對色素溶液的

25、穩(wěn)定性影響較小。 1.2.5 糖對色素的影響 通過測定OD值，考察色素溶液在不同糖存在的條件下的穩(wěn)定性，如圖1.5（0代表初始吸光度）： 圖1.5 糖對色素穩(wěn)定性的影響 Fig1.5: the effect of sugar on the stability of the pigment 由圖1.5可知：濃度為0.10 g/100 mL的色素溶液在麥芽糖、乳糖、葡萄糖和蔗糖條件下較為穩(wěn)定，3 h后其OD值與初始值相比較，上升百分比分別為3.3 %、4.7 %、4.0 %、4.5 %。另外，通過方差分析各試驗組的OD值無明顯差異，表明四種糖對該色素溶液無明顯影響。 1.2.6 pH對色素的影響

26、通過pH的調(diào)定，考察不同pH條件下色素溶液的穩(wěn)定性（0為空白對照，其他依次為pH1-12），如圖1.6： 圖1.6 pH對色素穩(wěn)定性的影響 Fig1.6: the effect of pH on the stability of the pigment由圖1.6可知，相對于空白對照組，濃度為0.10 g/100 mL的色素溶液OD值在pH1-pH12條件下變化較?。ㄓ绕涫窃趐H6、pH7、pH8條件下），其變化百分比分別為10 %、2.7%、6.4 %、11.9 %、7.3 %、0.1 %、0.2 %、0.4 %、-3.8 %、-4.1 %、-1.4 %、7.5 %（正值代表下降，負(fù)值代表上升

27、）。表明色素在上述pH條件下較為穩(wěn)定。另外，在不同pH條件下色素溶液的顏色有變化，其結(jié)果如圖1.7 圖1.7 不同pH條件下色素溶液的顏色變化 Fig1.7: the change of the color on the pigment solution in different pH 由圖1.7可知，在pH1-12范圍內(nèi)，該色素溶液的顏色與空白組（紫色）相比較，其顏色由紫色依次變化為黃色、紫色、藍(lán)色。由pH對色素溶液呈色的影響推測該色素可能屬于花青素醌類。1.3 小結(jié)對紫擬青霉色素水溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，試驗結(jié)果表明：該色素溶液在常溫、糖等條件下較為穩(wěn)定；在Cu2+、Zn2+、Fe2+、10

28、 %的H202條件下穩(wěn)定性較差；pH、Na2SO3對色素溶液穩(wěn)定性影響較??；pH影響色素溶液顏色變化，由此推測該色素可能屬于花青素醌類。2. 紫擬青霉色素的生物活性研究 2.1 抑菌性 2.1.1材料與方法 2.1.1.1 材料 （1）菌種：紫擬青霉（Paecilomyces purpureus）、大腸桿菌（E scherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），來自貴州大學(xué)真菌資源研究所；青霉（Penicillium）、及黑曲霉（Aspergillus niger）取自貴州師范學(xué)院貴州省生物資源開發(fā)利用特色重點實驗室。 （2）儀器：YXQ-LS-X

29、J SII型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SKP-02.500型電熱恒溫培養(yǎng)箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；SW-CJ-ICU型潔凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。 （3）藥品試劑：H202、FeSO4、鄰苯三酚等為國產(chǎn)分析純。 2.1.1.2 方法 （1）培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：土豆200 g削皮切塊，加1000 mL水煮沸30 min后4層紗布過濾，加入蔗糖20 g再過濾一次，加入瓊脂20 g，補水至1000 mL，121 滅菌30 min。 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCL 5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH

30、7.0-7.2。121 滅菌30min。 細(xì)菌培養(yǎng)液：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCL5 g，水1000 mL，pH 7.0-7.2。121 滅菌30 min。 （2）色素粗提濃縮物的制備 將紫擬青霉接種于PDA液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)4-6天，再靜置避光培養(yǎng)20天，之后轉(zhuǎn)自然光培養(yǎng)10天，將液面菌絲取出，用無水乙醇浸提3 h，收集提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得色素粗提濃縮物。 （3）細(xì)菌菌懸液制備待供試菌種活化后，從斜面培養(yǎng)基上刮下適量菌體，接種于細(xì)菌培養(yǎng)液中，37 培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)后的菌液用血球計數(shù)板計數(shù)，以細(xì)菌培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌濃度至3.2x108個/ mL，制成細(xì)菌菌懸液。 （4）色素粗

31、提液的制備 準(zhǔn)確稱取0.5 g粗提濃縮物兩份，其中一份完全溶于50 mL無菌蒸餾水中，無菌條件下靜置，待用；另外一份置于溫度為121 ，壓強為0.14 MPa的立式壓力蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min后取出冷至常溫待用。 （5）抑菌材料制作 取3張定性濾紙為一疊，用打孔器均勻打孔，得到直徑為6 mm的濾紙柱，壓平后分裝入潔凈培養(yǎng)皿中，121 滅菌30 min，放入烘箱烘干，待用。 試驗步驟 （1）色素粗提液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌試驗 1）取已滅菌干燥的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿導(dǎo)入約20 mL的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，無菌條件下靜置待其凝透，取培養(yǎng)基均勻并表面無冷凝水的使用。用滅菌干燥的棉簽蘸取

32、細(xì)菌菌懸液在培養(yǎng)基上均勻涂布，靜置30 min至菌液完全吸收。 2）用潔凈無菌的鑷子夾取濾紙柱（6層濾紙）在紫擬青霉粗提濃縮物水溶液中浸泡約10 s，取出滴去表面過多的色素液并將濾紙柱平移到培養(yǎng)基上。每個平板每種材料設(shè)對照1個（無菌蒸餾水），供試液2個，共3個。各種材料間隔距離相等，3個重復(fù)。 3）將上述平板靜置于常溫?zé)o菌環(huán)境中，待液體充分浸到培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑大小，測量采用十字交叉法，取其平均值。 （2）色素粗提液對青霉菌及黑曲霉的抑菌活性 取已滅菌干燥的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿導(dǎo)入約20 mL的PDA固體培養(yǎng)基，無菌條件下靜置待其凝透，取培養(yǎng)基均勻并表面無冷凝水的

33、使用。將青霉和黑曲霉接種于平皿上均勻涂布，靜置一會后用潔凈無菌的鑷子夾取濾紙柱（6層濾紙）在紫擬青霉粗提濃縮物水溶液中浸泡約10 s，取出滴去表面過多的色素液并將濾紙柱平移到培養(yǎng)基上。每個平板每種材料設(shè)對照1個（無菌蒸餾水），供試液2個，共3個。各種材料間隔距離相等，3個重復(fù)。 （3）色素粗提液、慶大霉素及青霉素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較 取4個濾紙柱（每個濾紙柱兩片濾紙），平移到涂好金黃色葡萄球菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的4個不同位置。用移液槍各吸取20 L的慶大霉素（濃度為2 mL/8萬單位）、青霉素（濃度為2 mL/80萬單位）、色素液（濃度為0.5 g/50 mL無菌蒸餾水）及無菌蒸

34、餾水分別加到4個濾紙柱上。每個平板每種材料設(shè)對照1個（無菌蒸餾水），供試液3個，共4個。各種材料間隔距離相等，3個重復(fù)。 2.1.2結(jié)果與分析 （1）色素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌試驗 通過對抑菌圈直徑的測量考察色素液的抑菌效果，如表2.1，圖2.1： 表2.1 抑菌圈直徑的測量 Table 2.1: The measure of inhibition zone 菌種大腸桿菌/mm金黃色葡萄球菌/mm抑菌圈直徑6.6723.2 圖2.1 色素液對培養(yǎng)24h后的金黃色葡萄球菌（左）和大腸桿菌（右）的抑菌效果 Fig.2.1: The antibacterial activity of th

35、e pigment solution to Staphyloccocus aureus and Escherichia coli由試驗結(jié)果得知，在培養(yǎng)24 h后，濃度為0.5 g/50 mL的色素溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為23.2 mm，對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑為6.67 mm，表明該色素水溶液對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌效果，對大腸桿菌則無抑制作用（空白對照組直徑為6 mm）。 （2）色素對青霉菌及黑曲霉的抑菌試驗 圖2.2 色素液對培養(yǎng)48h后的青霉菌（左）和黑曲霉（右）的抑菌效果 Fig.2.2: The antibacterial activity of the pigm

36、ent solution to Penicillium and Aspergillus niger 由圖2.2可知，在培養(yǎng)48 h后青霉菌、黑曲霉均已長滿PDA培養(yǎng)基，未出現(xiàn)抑制效果，表明色素液對青霉菌、黑曲霉沒有抑制作用。 （3）色素液、慶大霉素及青霉素的抑菌效果比較 注：左圖為紫擬青霉紫色色素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果（雙層濾紙/20 L）；右圖的右上角為慶大霉素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果；右圖的左上角為青霉素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果；下面為添加無菌蒸餾水的空白對照。 圖2.3 色素液與慶大霉素及青霉素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較Fig.2.3:The compare of antib

37、acterial activity of the pigment solution, gentamicin and penicillin to Staphyloccocus aureus 培養(yǎng)12 h后對各抑菌圈進(jìn)行十字交叉法測量其直徑，如圖2.3。試驗結(jié)果得知：相同劑量（20 L）條件下測得色素液（0.5 g/50 mL）的抑菌圈平均直徑為2.09 cm，青霉素（2 mL/80萬單位）的抑菌圈平均直徑為2.48 cm，慶大霉素（2 mL/8萬單位）的抑菌圈平均直徑3.50 cm。表明：以抑菌圈直徑為指標(biāo)，在同等劑量下，色素液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，其抑菌效果是慶大霉素的59.7 %，

38、是青霉素的84.3 %。 2.1.3 小結(jié)紫擬青霉色素水溶液的抑菌試驗結(jié)果表明，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，該色素水溶液對金黃色葡萄球菌有很好的抑制效果，對青霉菌及黑曲霉無明顯抑制作用；通過抑菌效果比較得知，在同等劑量（20 L）下，濃度為0.5 g/50 mL色素水溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果是2 mL/8萬單位的慶大霉素的59.7 %，是2 mL/8萬單位青霉素的84.3 %。 2.2 抗氧化性 2.2.1 材料與方法 2.2.1.1材料 （1）菌株：紫擬青霉，來自貴州大學(xué)真菌資源研究所。 （2）儀器：紫外分光光度計，島津UV2450型。 （3）藥品試劑：鄰二氮菲、雙氧水等為國產(chǎn)分析純。 2.2

39、.1.2方法 （1）色素粗提液對HO·的清除作用27, 28, 29 7.5 mmol/L鄰二氮菲1.5 mL，加pH7.4磷酸鹽緩沖液5 mL，充分混勻后， 加7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵1.5 mL，每加一管立即混勻。加0.10 % H2O2 2.0 mL，加水至12.0 mL，25 水浴加熱1 h后，測510 nm處的吸光度為A損傷。加色素樣品液（濃度為0.2 g/100 mL）后再加0.10 % H2O2 2.0 mL，測吸光度為A加樣。加Vc溶液后，再加2.0 mL 0.1% H2O2 測得吸光度值為AVc。不加H2O2和樣品液測得的吸光度為A空白。利用以下公式求樣品對

40、HO·的清除率。 HO·清除率=（A加樣-A損傷）/（A空白-A損傷）×100% （2）色素粗提液對DPPH的清除作用 在0.25 mmol/mL DPPH溶液中加入2 mL待測樣品后搖勻，于室溫下放置30min，用無水乙醇作參比液在517nm處測其吸光度為Ai；同時測定在2 mL，0.25 mmol/mL DPPH溶液中加入2 mL無水乙醇混合液的吸光度Ac；測定2 mL, 25 mmol/mL DPPH溶液中加入2mLVc液的吸光度值A(chǔ)iVc；再測定2 mL樣品液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj。利用以下的公式求得樣品對DPPH的抑制率，抑制率越高說明抗氧

41、化活性越強。 DPPH的抑制率=1-（Ai-Aj）/Ac）×100% 2.2.2結(jié)果與分析 2.2.2.1 HO·的清除作用 用島津紫外分光光度計UV2450在510 nm下分別對A加樣、A損傷、A空白的吸光度進(jìn)行測定，取其平均值并計算抑制率（VC作對照），如表2.2： 表2.2 色素液對HO·的清除作用實驗組 OD值A(chǔ)加樣0.270A損傷0.252A空白0.475A vc0.483 Table 2.2: The scavenging effect of HO· 由表2.2可知，通過公式：HO·清除率=（A加樣-A損傷）/（A空白-A損傷）&#

42、215;100%計算可得該色素溶液對羥基自由基的清除率為8.0 %，對照組VC的清除率為100 %，色素液為VC清除率的8%。 2.2.2.2 DPPH的抑制率用紫外分光光度計島津UV2450在517 nm下分別對Ai、Aj、Ac的吸光度進(jìn)行測定，取其平均值并計算抑制率（VC作對照），結(jié)果如表2.3： 表2.3 對DPPH的抑制作用 Table 2.3: The inhibition effect of DPPH實驗組 OD值A(chǔ)i1.321Aj0.091Ac1.492 A vc 0.558 由表2.3可知，通過公式：DPPH的抑制率=1-（Ai-Aj）/Ac）×100 %計算可知該色

43、素水溶液對DPPH的抑制率為17.614 %，對照組VC的清除率為65.875 %，色素液為VC清除率的26.7%。 2.2.3小結(jié)紫擬青霉色素粗提液清除羥基自由基和DPPH試驗，結(jié)果表明：該色素液對羥基自由基的清除率為8 %，對DPPH的清除率為17.614 %。與VC作比較可知該色素液對羥基自由基的清除效果是VC的8%，對DPPH的清除效果是VC的26.7%，表明該色素液具有一定的抗氧化效果。 2.3對部分癌細(xì)胞的抑制作用 2.3.1 材料與方法 2.3.1.1 材料 （1）菌株：紫擬青霉，來自貴州大學(xué)真菌資源研究所。 （2）儀器：紫外分光光度計，島津UV2450型。 （3）藥品試劑：Na

44、2HPO4等為國產(chǎn)分析純。 2.3.1.2 方法 （1）PBS溶液配制定量稱取NaCL0.8 g，KCL0.02 g，Na2HPO4 0.144 g，KH2PO4 0.024 g溶解于100 mL蒸餾水中，調(diào)pH至7.4。 （2）MTT溶液配制定量稱取0.5 gMTT，溶于100 mL PBS溶液中配成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，用0.22 m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4 避光保存待用。 （3）操作步驟1）稱取50 mg樣品（紫擬青霉色素濃縮物），用DMSO溶液溶解至1 mL，此時溶液濃度為50 mg/mL，-20 保存待用。2）細(xì)胞鋪板（96孔板），貼壁細(xì)胞每孔約3×10

45、4個，懸浮細(xì)胞每孔約5×104個，貼壁細(xì)胞等貼上后加藥，懸浮細(xì)胞立即加藥，設(shè)置對照：全培養(yǎng)基、全細(xì)胞懸液（200 L）、細(xì)胞懸液（190 L）+DMSO（10 L）、細(xì)胞懸液（190 mL）+藥物（10 L）。3）加藥(樣品)，加藥前DMSO，藥物樣品卻用無血清培養(yǎng)基稀釋200倍，即1 L+199 L，稀釋完之后，再取10 L加入到細(xì)胞懸液中，其終濃度為12.5 g/mL，注意每個藥物設(shè)置3個重復(fù)。4）培養(yǎng)72 h<37 ，5 %恒CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱之后，避光向每孔中加入20 L MTT溶液（5 mg/mL，即0.5 %MTT，用PBS溶MTT試劑），4小時之后，倒板，將液體倒出

46、，千萬不要碰到紫色的甲臜(三苯基甲臜)，再加入150 L DMSO溶液到每孔，使其溶解甲臜。 5）檢測:振板10 min，使甲臜充分溶解，再用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度。 2.3.2 結(jié)果與分析 通過MTT法，測定色素對癌細(xì)胞系MDA（人乳腺癌細(xì)胞系）、BPH（良性前列腺癌細(xì)胞系）、PC3（前列腺癌細(xì)胞系）和K562（人慢性髓原白血病癌細(xì)胞系）的抑制作用，結(jié)果如表2.4：表2.4 色素對MDA、BPH、PC3和K562四種癌細(xì)胞系的抑制率 Table 2.4: the inhibition rate of the pigment on MDA, BPH, PC3 and K562癌細(xì)胞系

47、MDABPHPC3K562抑制率19%27%19%30% 由表2.4可知紫擬青霉色素對癌細(xì)胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用。 2.3.3小結(jié) 紫擬青霉色素水溶液對部分癌細(xì)胞的抑制作用，試驗結(jié)果表明：該色素對癌細(xì)胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用，其抑制率分別為19 %、27 %、19 %、30 %。 2.4 結(jié)論紫擬青霉色素的抑菌性試驗結(jié)果表明：色素溶液對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌效果；對青霉菌、黑曲霉無明顯抑菌作用；通過抑菌效果比較得知，在同等劑量（20 L）下，濃度為0.5 g/50 mL色素溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果是2 mL/8萬單位的慶大

48、霉素的59.7 %，是2 mL/8萬單位青霉素的84.3 %?？寡趸囼灲Y(jié)果表明：色素溶液其對羥基自由基的清除率為8 %，對DPPH的清除率為17.614 %，與VC作比較可知該色素液對羥基自由基的清除效果是VC的8%，對DPPH的清除效果是VC的26.7%，表明該色素液具有一定的抗氧化效果。對部分癌細(xì)胞的抑制作用，試驗結(jié)果表明：色素水溶液對癌細(xì)胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用，其抑制率分別為19 %、27 %、19 %、30 %。3. 結(jié)語以紫擬青霉紫色色素粗提濃縮物為原料，研究該色素水溶液的穩(wěn)定性、抑菌性、抗氧化性及部分癌細(xì)胞的抑制作用。其中穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：色素溶

49、液在20 、40 、60 、80 、97 等溫度條件下較為穩(wěn)定，溫度的升高對該色素具有增色效果；色素溶液在葡萄糖、乳糖、蔗糖及麥芽糖存在條件下較為穩(wěn)定；金屬離子Na+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、K3+、Fe3+、Zn2+、Fe2+、Mn2+對該色素溶液穩(wěn)定性具有一定的影響，其中Cu2+、Zn2+、Fe2+的影響最明顯，所以在提取及應(yīng)用等過程中應(yīng)盡量避免金屬離子對該色素的影響；色素溶液在濃度分別為5 %、10 %、15 %、20 %的Na2SO3條件下相對穩(wěn)定，10 %的H202 對該色素的水溶液穩(wěn)定性具有一定的影響；pH影響色素水溶液的顏色變化，由此推測該色素屬于花青素鯤類。抑菌試驗結(jié)果表

50、明：色素溶液對金黃色葡萄球菌有很好的抑制效果，對青霉菌及黑曲霉無抑制作用；通過抑菌效果比較得知，在同等劑量（20 L）下，濃度為0.5 g/50 mL色素溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果是2 mL/8萬單位的慶大霉素的59.7 %，是2 mL/8萬單位青霉素的84.3 %。抗氧化性試驗結(jié)果表明：色素溶液對羥基自由基及DPPH具有一定的清除作用，清除率分別為8 %和17.614 %，與VC作比較可知該色素液對羥基自由基的清除效果是VC的8%，對DPPH的清除效果是VC的26.7%，表明該色素具有一定的抗氧化效果。對部分癌細(xì)胞的抑制作用，試驗結(jié)果表明：色素粗提液對癌細(xì)胞系MDA、BPH、PC3和K5

51、62均有一定的抑制作用，這在抗癌物篩藥選方面具有很好的研究價值。參考文獻(xiàn)1鐘秋, 謝建春, 孫寶國. 天然食用色素的來源、制備及應(yīng)用J. 食品研究與開發(fā). 2008, 29(2): 174-177.2楊萌, 吳振強. 食用天然黃色素的研究近況J. 中國調(diào)味品. 2008(2): 67-71.3夏潔如, 向晨茜, 王洪偉. 食用天然色素功能應(yīng)用及發(fā)展趨勢J. 中國釀造. 2008(22): 1-4.4楊麗華, 陳曉光. 天然色素的資源開發(fā)和應(yīng)用研究進(jìn)展J. 中國食物與營養(yǎng). 2010(6): 13-16.5高榮海, 張輝等. 天然食用色素的研究進(jìn)展J. 農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊. 2009(6): 64-

52、68.6呂幫玉, 楊新河, 毛清黎. 我國天然食用色素的開發(fā)現(xiàn)狀與前景J. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2007, 19(10): 108-110.7譚國進(jìn), 蔣林斌等. 植物食用色素的研究現(xiàn)狀與展望J. 化工技術(shù)與開發(fā). 2005, 34(6): 25-29.8劉金福. 食品天然色素研究與應(yīng)用J. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報. 2001, 8(2): 18-20.9王金亭. 天然黑豆紅色素的研究進(jìn)展J. 中國食品添加劑. 2009.10韓曉嵐, 胡云峰等. 天然辣椒紅色素的研究進(jìn)展J. 中國食物與營養(yǎng), 2010(4): 20-23.11王金亭. 天然玫瑰茄紅色素研究進(jìn)展J. 糧食與油脂. 2010(11): 40-43.12邵婧, 韓泳平. 核桃殼天然棕色素的穩(wěn)定性研究J. 西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2010, 36(4): 610-614.13高昌勇. 水溶性茄子皮色素穩(wěn)定性研究J. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報. 2010, 29(2): 139-142.14蔣林斌, 林翠梧, 趙樹凱等. 紅龍果食用色素的提取及理化性質(zhì)分析J. 分析測試學(xué)報. 2002, 21(6)