第七章_納豆-新版

1、第七章 納豆7.1 納豆概述納豆 (Natto) 是日本的一種傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，由納豆菌 (Bacillus natto) 在一定溫度、濕度下發(fā)酵蒸煮大豆而成，作為日本人的主要佐餐食品已有兩千多年的歷史，在民間一直藥食兼用。成熟的納豆色澤金黃，表面覆有一層粘性物質，挑起時有長長的拉絲狀物質，如圖7-1 所示。納豆風味獨特，營養(yǎng)豐富，具有多種保健功能，被譽為“超級健康食品”，深受日本人民的喜愛。目前，納豆已成為盛行于日本、加拿大、美國和歐洲一些國家的一種保健食品，在我國也有企業(yè)開始生產和銷售。納豆在發(fā)酵過程中，納豆菌產生一種絲氨酸蛋白酶 (納豆激酶Nattokinase)，該酶最早于1987年為

2、由日本宮崎醫(yī)科大學日本的須見洋行等發(fā)現，。研究表明，納豆激酶具有纖溶活性，可以治療和預防血栓疾病。，目前，關于納豆菌的研究和應用主要集中在納豆激酶的作用上。但是，作為保健食品的納豆還具有多種保健功能，如溶血栓、抗腫瘤、降血壓、抗菌等作用，可預防骨質疏松、提高蛋白質的消化率、抗氧化等。圖7-1 納豆的形態(tài)7.2 納豆菌傳統(tǒng)制作納豆的方法是采用稻草作為發(fā)酵菌劑的來源，將煮熟的黃豆冷卻后用稻草包裹后于溫、濕度比較高的地方自然發(fā)酵12 d，待到黃豆表面出現一種白色的黏液狀物質即可。目前在日本，納豆食品生產基本實現了工業(yè)化、連續(xù)化和商品化。Sawamura是第一個將納豆中篩選出的桿菌命名納豆桿菌的研究學

3、者，Muto后來研究發(fā)現納豆桿菌屬于枯草芽孢桿菌屬，為需氧型革蘭氏陽性菌。自從1934年北海道大學農學部半詢教授首次成功地將分離的純種納豆菌苗（Bacillus natto No.1）使用于納豆的工業(yè)化生產后，至今已知與納豆生產相關的主要純菌種有包括：BacillussubtilsIFO3007、BacillusnattoSawamura06、Bacillus natto Sawamura IFO 3339等。 枯草芽孢屬的重要特點是能夠分泌各種胞外酶，包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酸轉肽酶（GTP）、脂肪酶、果聚糖蔗糖酶和植酸酶，納豆菌分泌的酶比其它枯草芽孢桿菌分泌同樣活性的酶高幾十倍。納豆菌帶有

4、芽孢，因而能耐鹽和耐堿、耐高溫（100）及耐擠壓，在酸性胃環(huán)境中均能保持高度的穩(wěn)定性，在腸胃道中不增殖，只在腸道上段迅速發(fā)育轉變成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細胞。納豆菌對營養(yǎng)要求不高，可以在人體腸道中定殖，對人體腸道中微生態(tài)的平衡具有很重要的很重要的作用。圖7-2 為納豆菌的生物學的形態(tài)。圖7-2 納豆菌的生物學形態(tài) 納豆菌的主要保健作用納豆是大豆煮熟后經接菌發(fā)酵而制成的功能食品，它除了保持原料大豆的營養(yǎng)外， 有些成分的含量比煮熟的大豆還要高，如蛋白質、纖維、鈣、鐵、鉀、維生素B2、維生素B12等,特別是纖維、鈣、鐵、鉀的含量甚至超過了雞蛋。這是由于納豆在發(fā)酵過程中產生多種維生素和酶類，如淀粉酶

5、、蛋白酶、脂肪酶、纖維酶、納豆激活酶、溶菌酶、和-谷氨酸轉肽酶等，由于酶的作用使蛋白質及其它營養(yǎng)物質發(fā)生分解，因此，納豆的消化率（85）比煮熟大豆（68）的還要高，營養(yǎng)更豐富，也更容易被吸收。同時，納豆在發(fā)酵過程中還產生或增加許多對人體有益的活性物質，如納豆激酶、異黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）、皂甙素、生育酚、吡啶二羧酸、VK2等，納豆的營養(yǎng)與活性物質使納豆在食用中體現了多種醫(yī)療保健功能。 (1) 溶解血栓 ：日本須見洋行教授研究發(fā)現，納豆及納豆的生理鹽水浸提物能夠直接溶解纖維蛋白，是一種具有溶栓活性的酶制劑。該酶能強烈溶解血栓，定名為納豆激酶(natto kinase)。它由275個氨基酸

6、殘基組成，不含二硫鍵，分子量依測定方法不同在2730035000 道爾頓不等，根據氨基酸序列計算準確的分子量為27728相對分子質量在27000左右，無毒、無副作用，是一種中性絲氨酸蛋白酶。隨后，須見洋行又將納豆激酶用于健康人群的體內研究，證明它除有顯著溶栓作用外，還有促進靜脈內皮細胞產生纖溶酶原激活劑能力，從而間接表現其溶栓活性。經有實驗表明，每日食用納豆可以起到預防血栓類疾病的作用，特別最好是在晚飯時食用效果較佳。其原因是血栓類疾病如心肌梗死等往往是在上午發(fā)作，納豆激酶在進入人體28 h內血栓溶解的速率比較高，所以晚飯時食用有助于預防次日上午心肌梗死的發(fā)作。據報道，有心肌梗死危險的患者，一

7、次需投入尿激酶30萬單位，而50 g納豆中含有80萬單位尿激酶溶解血栓的作用。此外,須見教授等發(fā)現納豆中含有溶纖維蛋白酶，并命名為納豆激酶。研究證明，它除具有直接的溶栓作用外，還能將纖維蛋白溶酶原、尿激酶原激活，從而表現出間接的溶栓效果。由于此酶作用時間長，因此有利于臨床應用。(2) 抗腫瘤 ： 納豆還具有防治癌癥的功效。許多研究證實，大豆作為納豆的原料含有多種抗癌物質，除了酚類和、黃酮類之外，還富含膳食纖維以及硒，可預防乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎癌、尿道癌、大腸癌等。納豆除了含有多種抗癌成分外，納豆菌本身也可有效地破壞或殺死癌細胞，并可刺激免疫系統(tǒng)誘發(fā)產生干擾素產生，起到抑制癌癥的功效。1

8、967年，金澤大學藥學院的龜田報告了納豆抗癌動物實驗的結果，他將Ehrlich肉瘤移植到鼠的左右足皮下，23 h后，在右足部注入納豆菌，11天后觀察，右足沒有癌細胞生成，而左足有癌細胞生長。證實納豆菌能抑制癌細胞生長。龜田教授將有這種抗癌效果的納豆命名為KMD1126，但具體的抗癌活性物質是什么當時并不清楚。1995年高橋等通過體外細胞培養(yǎng)實驗，揭示了納豆中含有的抗癌活性物質是一種含3032個碳的直鏈飽和烴，其中三十一碳烴在納豆中含量最多，活性也最高。目前研究證實，納豆中含有的5，7，4 三羥異黃酮(genistein)，是納豆中起抗癌作用的主要物質，其含量是豆腐和豆奶中的5倍。此外，納豆中還

9、含有胰蛋白酶抑制劑，其抗癌功效已在動物實驗中得到證實。納豆中含有染料木素（Genistein）和染料木苷（Genistin），類似枯草溶血素的脂肽，還含有豐富的植物雌激素和一種叫Inbrafin的類黃酮色素形成成分，這些物質有強烈的裂解功能，可抑制腫瘤細胞的增殖。(3) 降血壓 ：日本前帝國大學林右市等對納豆預防高血壓的效果進行了實驗。研究表明，成品納豆中含有降血壓作用的血管緊張素轉化酶抑制劑，這種物質存在于納豆中，但以納豆表面的黏稠物質中含量更多。此抑制劑分水溶性和醇溶性2兩種，其中水溶性抑制劑為高分子質量的蛋白質，IC50為12 mg/mL；醇溶性抑制劑為低分子質量物質，具有2兩 種形態(tài)，

10、抑制作用強于水溶性抑制劑，IC50分別為0.53 mg/mL和0.95 mg/mL，pH和溫度穩(wěn)定性都很好。這兩種形態(tài)的醇溶性抑制劑的抑制模型是不同的，一種是競爭性抑制，一種為非競爭性抑制。這種血管緊張肽轉化酶抑制劑在不同的pH和溫度范圍內均保持很好的穩(wěn)定性。因而，納豆具有預防和治療高血壓的作用。納豆周圍的黏性物質中有血管緊張肽轉化酶抑制劑。在動物實驗中， 使有遺傳性高血壓的老鼠每天攝入納豆，與攝入等量大豆的老鼠作為對照，結果食用納豆的鼠血壓波動低于對照組。(4) 抗氧化性、延緩衰老 ：從納豆和未經發(fā)酵的大豆(SSB)的對比實驗可見，納豆顯示了比未經發(fā)酵的大豆制品SSB高得多的抗氧化性，它可抑

11、制脂肪氧化達91，而后者只能抑制13，這可能與納豆中含有的抗氧化物質，如異黃酮和-生育酚(維生素E)有關。經常食用納豆可有效降低血脂、膽固醇及清除腦組織細胞中過氧化脂質色素，調節(jié)皮膚細胞表水和脂肪平衡，促進血液循環(huán)，改善皮膚彈性，使皮膚光潔柔軟，達到延緩衰老的功效。納豆中含有大量的抗氧化物質，如卵磷脂、異黃酮(isoflavones)、-生育酚（維生素E）、超氧化物歧化酶，還含有大量的皂甙素。另外，納豆對由過氧化物所引起的細胞傷害也有療效。并且無論是對不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸，還是對受傷細胞，納豆的抗氧化作用都等同于甚至好過-生育酚的效果。最新報道，納豆中水溶性低分子質量粘性物質可防止動脈

12、硬化，降低脂類過氧化反應，加強脂類代謝。納豆的粗提物中含有豐富的卵磷脂、異黃酮(isoflavones)、超氧化物歧化酶(SOD)、不飽和脂肪酸、維生素E等抗氧化成分。因此，經常食用可有效降低血脂、膽固醇及清除腦組織細胞中過氧化脂質色素，調節(jié)皮膚細胞表水和脂肪平衡，促進血液循環(huán)，改善皮膚彈性，使皮膚光潔柔軟，達到延緩衰老的功效。納豆中含有大量的抗氧化物質，如卵磷脂、異黃酮、-生育酚（維生素E）、超氧化物歧化酶，還含有大量的皂甙素。與大豆相比，納豆中的皂甙素更容易為人體吸收。納豆顯示了比未經發(fā)酵大豆高得多的抗氧化性，它可抑制脂肪氧化達91，而后者只能抑制13。最新報道，納豆中水溶性低分子量黏性物

13、質可以防止動脈硬化，降低脂類過氧化反應，加強脂類代謝。(5) 防治骨質疏松 ：納豆中維生素K分為維生素K1 和維生素K2 兩種，其中維生素K1 包含在納豆內，不溶于水；維生素K2 存在于納豆外面的黏性物質中，溶于水，100 g納豆中約含1000 µg維生素K2 。維生素K2 可促進生成骨蛋白質（Osteocalcin），這種蛋白質可與鈣共同生成骨質，增加骨的密度，從而防治骨質疏松癥。在日本調查發(fā)現，消費納豆較多的地區(qū)，骨折發(fā)生率顯著降低。食用納豆的東京女性血液中維生素K2的含量比不食用納豆的倫敦女性高15倍。須見洋行洋行等實驗證實，進食100 g納豆，4 h后血液中維生素K2的濃度最

14、高可達原來的54倍。1995年，東京大學醫(yī)學部曾對6000例60歲以上的骨質疏松患者進行了調查研究，結果表明，服用維生素K2不僅可以減緩腰痛，而且骨骼的重量也增加了。易患骨折人的血液中的維生素K2的濃度僅是健康人的50左右，常吃納豆可以預防和治療骨質疏松癥。每天食用10 g納豆就可為機體提供足夠的維生素K2。 大豆經納豆菌發(fā)酵后，產生比通常食品高幾百倍的維生素K2。調查發(fā)現，消費納豆較多的地區(qū)，骨折發(fā)生率顯著降低。食用納豆的東京女性血液中維生素K2的含量比不食用納豆的倫敦女性高15倍，因而納豆具有預防骨質疏松、腰痛等疾病的功能。(6) 抗菌消炎 ：早在第二次世界大戰(zhàn)期間，納豆菌對于霍亂、傷寒菌

15、和赤痢菌的抗菌效果就有過報道。研究表明，納豆菌可產生許多種抗菌物質，如桿菌肽、多黏菌素、2,6-吡啶二羧酸，對細菌、酵母和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙門菌、傷寒菌、痢疾菌及O-157、H7大腸桿菌等致病菌的作用，還可滅活葡萄球菌腸毒素。在抗生素使用前，日本民間長期用納豆治療痢疾、傷寒等消化道疾病，常食納豆可起到壯體防病作用。通過接種納豆菌的動物實驗發(fā)現，納豆可以提高機體的抵抗力，還可以誘發(fā)機體干擾素的生成，增強機體的免疫力。納豆也正由于具有這些抗菌物質，才會在充分發(fā)酵后不易腐爛。 納豆可產生許多抗菌素，具有廣譜抗菌作用，對細菌、酵母菌和霉菌都有拮抗作用。(7) 提高蛋白質消化率 : 納

16、豆菌不產生毒素，是人體無病原性的安全菌球。它能分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和脲酶等多種酶類。這些生物酶作為消化酶能夠有效地發(fā)揮作用，有助于消化吸收，使納豆不僅保持了大豆幾乎不含膽固醇及脂肪酶含量高，營養(yǎng)均衡的優(yōu)點，且大大提高大豆的消化率，使大豆蛋白質消化率由原來的50提高到85以上。這是由于有5060的大豆蛋白質轉化為肽和氨基酸，其中10是氨基酸，特別是谷氨酸較多。(8) 調整腸功能 : 大豆中約有10碳水化合物，其中2/3是半纖維、纖維素和木質素等食物纖維，可防止便秘，預防大腸癌和直腸癌，還有降脂減肥等功效。食用納豆后，納豆菌在腸中發(fā)芽增殖，作為營養(yǎng)物質能在腸內生活幾周，分泌各種酶和

17、維生素，促進小腸黏膜細胞的增殖。同時，納豆中的纖維素類物質可以與寡糖偶合，從而促進雙岐歧桿菌等益生菌的增殖，抑制致病菌的繁殖，對腸道菌群的微生態(tài)平衡起重要作用，保證腸功能的正常。此外，納豆菌食用后，在腸中生長，作為營養(yǎng)體，能在腸內生活幾周，分泌多種酶和維生素，可促進小腸黏膜細胞增生，納豆菌進入腸內，還可抑制引起腸內異常發(fā)酵和痢疾等腐敗菌，促進乳酸菌等益生菌的增殖，調節(jié)腸內微生態(tài)平衡，預防痢疾、腸炎和便秘等，保證腸功能的正?；顒印?9) 降低膽固醇 : 納豆脂質中亞油酸占全脂質的50，有報道亞油酸能降低血漿中的膽固醇含量，有預防動脈硬化、心臟病和高血壓的功效，故納豆具有降低膽固醇的作用。(10)

18、 其它功能 : 納豆中因含有多種維生素、卵磷脂、麻酸等，因此具有抗衰老、提高記憶力、防止酒醉、美容等保健功能。納豆中含有大量的黏性物質，其主要成分是高聚谷氨酸，因其具有強烈的保濕性能和增稠等效果，被廣泛應用于食品行業(yè)和農業(yè)中。納豆菌產生的吡啶二羥酸結合金屬的能力很強，能夠清除體內的放射性元素，常吃納豆可減少患白血病的幾率。納豆在發(fā)酵過程中產生的菌絲黏液物質，其成分為類果聚糖的混合物；果糖和-多聚谷氨酸，它被覆在黏膜的表層上，可保護腸胃，防止醉酒。有些研究還認為，大豆制品中的某些蛋白質可促進甲狀腺激素分泌，從而促進糖和脂肪的分解代謝，提高和保持精力。 納豆產品的開發(fā)近些年來，日本掀起了一股納豆熱

19、潮，納豆作為一種功能性食品在日本方興未艾。據日本納豆學會統(tǒng)計，日本有2048家工廠生產納豆以供應市場需要。在韓國，納豆也受到歡迎；在我國香港也有納豆上市，并得到許多人的喜愛；在美國，一種與納豆相類似的印尼豆食品日益成為美國人歡迎的健康食品。在我國，越來越多的人開始注重生活質量，飲食營養(yǎng)與身體健康成為當前人們的追求。據中國疾病控制中心的調查指出，今后的一段時間我國將處于老齡化高峰期，血栓疾病將呈現上升趨勢。對此，作為營養(yǎng)豐富的保健食品，納豆必將成為人們的熱衷食物，其市場需求將會十分龐大。近年來，隨著一些科研單位和企業(yè)研制成功納豆食品，并投放到市場上后，已得到一些人的認可。如燕京啤酒集團引進日本先

20、進的技術推出一系列納豆保健食品，成為目前國內生產納豆的知名企業(yè)。投資設立的北京燕京中發(fā)生物技術有限公司，進行年產1000噸納豆和30噸納豆素膠囊的研究和生產。天津市百德生物工程有限公司投入近千萬元，與中國農業(yè)大學等科研院所合作，經過多年的科研開發(fā)，采用獨特發(fā)酵工藝及有機大豆自行培育出優(yōu)良納豆菌種, 該公司生產出的納豆咀嚼片已投入市場，得到一些消費者的喜愛。 納豆有一種特殊的味道,對于無法接受日本傳統(tǒng)納豆風味,又希望獲得納豆功能性的消費者，企業(yè)開發(fā)出了另一種形態(tài)的納豆保健食品，將納豆的功能性成分提取出，并調制成不同風味，生產功能性納豆保健品。目前，一些科研單位和企業(yè)在納豆保健功能開發(fā)上更多的是研

21、究納豆激酶，通過液體發(fā)酵方法生產納豆激酶；或者提取發(fā)酵納豆的粘液成分做成納豆口服溶栓藥物和保健食品。如上海康年生物科技有限公司、河南洛陽華以生物工程有限公司、北京納百恩食品有限公司等都是與日本的研究機構和企業(yè)合作開發(fā)出了納豆激酶系列產品，實現了工業(yè)化生產。食用納豆已有千年的歷史，但納豆的許很多功能并沒有完全開發(fā)出來，特別是作為天然防腐劑的工業(yè)化產品還沒有，還須更多的科研單位和企業(yè)加入深入研究納豆的功能，將納豆及其延伸物的市場做大、做強。 納豆菌產生抗菌物質的種類納豆菌可產生許多抗菌素，如桿菌肽，多粘菌素和2，6吡啶二羧酸，這些物質對痢疾桿菌、原發(fā)性大腸桿菌O-157、O-111、O-144、傷

22、寒菌、沙門氏菌等，都有強烈的抑制作用，因此,納豆菌具有強烈的抗菌活性。有研究者通過混合培養(yǎng)試驗，確認了納豆菌和納豆成分對于病原性大腸桿菌O-157具有很強的抑制生長繁殖的效果，同時認為2，6-吡啶羧酸是具有耐熱性的物質。在過去的幾十年內，已經發(fā)現700多種肽類抗生素。這些肽類物質被分為兩類，一類是非核糖體合成的肽類抗生素，另一類是由核糖體合成的天然肽類抗生素。桿菌肽和多粘菌素屬于非核糖體合成的肽類抗生素。非核糖體合成的肽類抗生素是由細菌、真菌和鏈霉菌等分泌的具有抗菌活性的肽類物質。桿菌肽和多粘菌素就是納豆菌分泌的具有抗菌活性的代謝產物為桿菌肽和多粘菌素，具有抗菌活性。 納豆菌產生抗菌物質的生理

23、活性和抗菌機理.1 抗菌物質的生理活性納豆菌生產的多粘菌素、桿菌肽和2，6-吡啶羧酸，它們有各自的抗菌活性和抗菌機理。多粘菌素包括多粘菌素B（polymyxin B）及多粘菌素E（polymyxin E；粘菌素，colistin），它們是多肽類抗生素，二者具有相似的藥理作用。對多數革蘭氏陰性桿菌有殺滅作用。多粘菌素E 的抗菌譜與多粘菌素B 相仿，但抗菌活性較比多粘菌素B 略差。多粘菌素的主要敏感菌有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、布魯氏菌、弧菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌等，尤其對綠膿桿菌具有強大的殺菌作用。桿菌肽主要作用于革蘭氏陽性菌。桿菌肽對耐藥的金黃色葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌有效，對螺旋體和放線菌

24、也有效，但對革蘭氏陰性菌無效。2,6-吡啶二羧酸在1936年由日本學者最早發(fā)現納豆菌的芽孢中存在著2，6- 吡啶羧酸（納豆粘液中）。它是由于納豆菌發(fā)酵大豆才生成的，有一定的抗菌作用，且對熱穩(wěn)定性好具有較強的抗性。.2 抗菌機理多肽類抗生素具有表面活性，含有帶陽電荷的游離氨基，能與革蘭氏陰性菌細胞膜的磷脂中帶陰電荷的磷酸根結合，使細菌細胞膜面積擴大，通透性增加，細胞內的磷酸鹽、核苷酸等成份外漏，導致細菌死亡。多粘菌素是通過破壞細菌胞膜，改變細菌細胞膜的通透性而起到殺菌作用的。桿菌肽是通過抑制革蘭氏陽性菌胞漿內的肽聚糖前體轉變?yōu)榻沽姿彷拼?，從而起到抑菌作用的?，6- 吡啶羧酸對各類細菌廣泛具有抗

25、菌作用的特性已經得到了證明，但其抗菌作用機理還未完全弄清，目前國內外均沒有報道。納豆菌產生了多種抗菌物質，多粘菌素抑制革蘭氏陰性菌的生長，桿菌肽抑制革蘭氏陽性菌的生長，同時加之其它物質，如2,6-吡啶二羧酸的抗菌作用，正是由于存在著這些抗菌物質，所以納豆菌的抗菌譜較廣，對多種菌均有抑制作用。7.3 納豆菌的培養(yǎng)和抗菌性試驗7.3.1 納豆菌的培養(yǎng)和抗菌粗提液的制備7.3.1.1 納豆菌的培養(yǎng)菌種為日本高橋祐藏研究所保藏的高橋納豆菌(Bacillus natto.Takahashi)；培養(yǎng)基為：蛋白胨1.5 g/100mL%，葡萄糖1.5 g/100mL%，KH2PO40.42 g/100mL%

26、，K2HPO40.405 g/100mL%，MgSO4 0.05 g/100mL，pH7.07.4。從斜面上挑取幾環(huán)菌種接入裝有70 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37、100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1624 h得種子菌懸液。將種子菌懸液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，以同上的條件培養(yǎng)。定期取樣測定pH、OD600及抑菌活性，結果如圖7-3所示。圖7-3 納豆菌的發(fā)酵曲線從圖中可知，納豆菌生成迅速，發(fā)酵24 h后進入穩(wěn)定期；整個發(fā)酵過程中pH值緩慢下降，最后穩(wěn)定在pH6.0。從抗菌活性看，培養(yǎng)6 h時，未發(fā)現抗菌活性，至12 h時有較強抗菌作用，在進入穩(wěn)定期后抗菌活性最大，48 h后抗菌活性緩

27、慢下降。7.3.1.2 納豆菌抗菌粗提液的制備(1) 發(fā)酵液中提取抗菌物質 發(fā)酵液4 下3500 r/min 離心15 min去菌體,得到去細胞液, 6 mol/L的HCl調pH至2.0, 4 靜置過夜；次日, 4、10000 r/min離心15 min收集沉淀,用20 mL甲醇將其溶解, 1 mol/L NaOH調pH到7.0，即得粗提液,用濾紙片法檢測其抑菌效果活性。(2) 發(fā)酵納豆中提取抗菌物質 稱取新鮮納豆60 g, 加適量蒸餾水充分研磨, 紗布過濾。殘渣中加水再浸提兩次, 濾液合并后濃縮至60 mL。,并以此該液為母液制成取濃度為200,150, 75, 50, 25, 5的提取液,

28、 于121高壓滅菌18分鐘, 放入4冰箱保存?zhèn)溆?。用濾紙片法檢測其選用定性濾紙, 由打孔器打成直徑為7mm 的小圓片, 分別用上述各濃度提取液浸泡并于121高壓滅菌,放入4冰箱備用，探討各種濃度提取液的抗菌效果。兩次高溫滅菌？(3) 指示菌懸液的制備 從斜面上分別挑取少量菌接種于液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)1824 h。酵母菌懸液和霉菌孢子懸液均以生理鹽水配制。7.3.2 抗菌實驗7.3.2.1 納豆菌的抗菌試驗取106107 CFU/mL 的指示菌0.1 mL涂平板。分別將樣品點樣于濾紙片上（直徑5.5 mm的雙層濾紙，點樣10 µL前后不一致?。?，待晾干后放于已涂布指示圈的平板上，細菌

29、37培養(yǎng)24 h、酵母菌30培養(yǎng)48 h、霉菌28培養(yǎng)48 h后測抑菌圈直徑。表7-1 納豆菌的抗菌作用微生物納豆菌發(fā)酵提取液抑菌圈直徑 (mm)納豆提取液抑菌圈直徑 (mm)志賀氏菌26.023.5大腸桿菌11.013.5沙門氏菌9.07.5普通變形桿菌7.08.0金黃色葡萄球菌20.018.5金黃色微球菌13.011.5巨大芽胞桿菌8.57.0李氏特菌9.58.0枯草芽胞桿菌-蠟狀芽胞桿菌-異常漢遜酵母20.021.0啤酒酵母15.512.5產朊假絲酵母16.517.5拮青霉9.510.5尖鐮孢9.08.5擴展青霉9.59.0鐮刀霉8.58.0黑根霉8.04.0黃曲霉7.02.0表7-1為

30、抑菌試驗結果，可以看出，納豆菌具有廣譜的抗菌作用，發(fā)酵生產納豆菌提取液和納豆提取液均對對格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌均有一定的拮抗作用，特別是對志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和異常漢遜酵母具有較強的抑菌抗菌作用。納豆菌提取液的抑菌較納豆提取液的抑菌作用強，這說明其含有較多質量的抑菌成分。圖7-4為納豆菌抑制大腸桿菌的抑菌效果圖，從圖中能明顯看到光亮的抑菌圈。圖7-4 納豆菌的抑菌(大腸桿菌)效果圖圖7.3.2.2 納豆菌抗菌物質的酸堿穩(wěn)定性將納豆菌抗菌粗提液分別調pH值至pH3pH11ll，然后分裝樣品分別進行如下處理:4，24 h；37，60 min；65，30 min；80，20 m

31、in；l00，15 min。處理后各樣品冷卻樣品，將pH值調至pH7，進行抗菌物活性測定，結果如圖7-5所示。可以看出，納豆菌抗菌物質具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，當溫度不超過80時，在pH值在3pH11ll的范圍內均比較穩(wěn)定；100處理時，在pH值為59的范圍內穩(wěn)定。7.3.2.3 酶對納豆菌抗菌物質的影響將表7-2中的各種酶制劑分別與納豆菌提取液混合在一起(酶的終濃度為0.5 mg/mL活力單位是多少？)，37處理l h后，100煮沸、5 min 使酶失活，冷卻后分別測定抗菌活性，結果如下見表7-2所示。由表7-2所示可知，除中性蛋白酶外，在蛋白酶處理lh后，抗菌活性下降明顯(中性蛋白酶

32、處理除外)，特別是對蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶敏感，淀粉酶對抗菌活性無影響。因此，可以認為，納豆菌產生的抗菌物質的結構中含有肽鍵，或這種物質是肽類或蛋白質類物質。圖7-5 納豆菌抗菌物質的穩(wěn)定性表7-2酶對納豆菌抗菌活性的影響試驗酶的種類抑菌圈直徑（）胃蛋白酶12.0胰蛋白酶10.5胰凝乳蛋白酶9.0蛋白酶K8.5木瓜蛋白酶12.5中性蛋白酶17.0淀粉酶18.5對照19.07.3.3 納豆菌生產2，6-吡啶二羧酸(dipicolinic acid:DAP) 納豆菌能產生具有生理活性物質DAP 吡啶二羧酸，它能有效殺滅、抑制腸道內的有害菌和病毒，使腸內菌群達到一個有利健康的動態(tài)平衡，增強

33、人體消化機能，迅速解決便秘、腸炎、腹瀉問題。不同的納豆菌種生成DAP產的2，6-吡啶二羧酸的量也不同。圖7-6為以大豆粉為培養(yǎng)基兩種利用不同的納豆菌種生成DAP產的2，6-吡啶二羧酸的情況產量。 兩種納豆菌Bacillus subtilis var. natto為高橋菌和宮城菌。將大豆粉配制成0.5%和2%濃度的液態(tài)培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)液以3%的接種量接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ，搖床轉速分別100 r/minpm震蕩培養(yǎng)或 和靜止培養(yǎng)，96 h。 2，6-吡啶二羧酸(dipicolinic acid:DAP)分析采用熒光測定法進行DAP對2，6-吡啶二羧酸的含量進行分析，。其原理是首先利用DAP

34、2，6-吡啶二羧酸與Tb(terbium)離子形成螯合物，這種螯合物形成的熒光作為指標來測定DAP的含量。圖7-7 納豆菌生產DAP的芽孢率 圖7-6表示兩種菌發(fā)酵接種于大豆煮汁粉液體培地生成產DAP的結果。高橋菌在0.5%大豆粉培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)中生成產了2.1g/ml的DAP，在靜置培養(yǎng)時生產生成了1.47g/ml的DAP。同樣的高橋菌接種于2%大豆粉培養(yǎng)液，無論靜置還是震蕩培養(yǎng)，只生成產了少量的DAP。宮城菌接種于0.5%大豆煮汁粉培地，震蕩培養(yǎng)也生成產了1.85g/ml的DAP。與高橋菌相似培養(yǎng)同樣，宮城菌接種于2%大豆粉培養(yǎng)液，靜置、振蕩兩種方式培養(yǎng)，也只生成產了少量的DAP。這一結果說

35、明液體培養(yǎng)基生產DAP,DAP的產率與菌種和培養(yǎng)基的濃度以及培養(yǎng)方式有關，使用高橋菌生產有較高的產率。DAP的產率也與培養(yǎng)基的濃度以及培養(yǎng)方式有關，在貧營養(yǎng)及震蕩狀態(tài)，芽孢繁殖加速，因此，生產出多量的DAP。這一點可以由圖7-7來解釋。該圖表示培養(yǎng)后的芽孢對全細胞的比例（芽孢率）。圖中可以看，出兩種菌接種于0.5%大豆粉培養(yǎng)液，都有很高的芽孢率。但是接種于2%大豆粉培養(yǎng)液時，芽孢率較低，相反較高的營養(yǎng)物濃度也會抑制菌體的增殖?？梢哉f，在DAP生產中，較貧營養(yǎng)的培養(yǎng)液，有較高的芽孢率，能生產出較多量的DAP。7.4 納豆菌抗菌作用的研國內外開發(fā)及研究現狀 國外的研究現狀納豆的抗菌作用早已為就被人

36、們了解，第二次世界大戰(zhàn)期間，人們用納豆來預防和治療霍亂、傷寒和痢疾。Ozawa K. 等人研究證實了納豆菌對白假絲酵母具有抑制作用。最近，Osawa R. 等研究發(fā)現，納豆菌產生的枯草桿菌蛋白酶可降解金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)。而且，該酶對其它的金黃色葡萄球菌腸毒素亦有作用。納豆控制了1996 年日本發(fā)生的O- 157 大腸桿菌中毒事件中，人們發(fā)現就是因為納豆菌分泌的一些代謝產物能對一些重要腸道致病菌起殺滅或抑制作用。有研究表明納豆菌對細菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙門氏菌、傷寒菌、痢疾菌及O- 157、H7 大腸桿菌等致病菌作用。在抗生素使用前，納豆在民間已被長期用于

37、治療痢疾、傷寒等的消化道疾病，因此常食納豆可起到壯體防病功效。納豆菌可以殺死多種致病菌，起到抗生素的作用。須見洋行教授對納豆的抗菌功能作了研究：將納豆加進O- 157 大腸桿菌4 d 后，大腸桿菌全部被抑制而死亡。Ozawa K研究認為，納豆菌的芽孢對病原性大腸桿菌(如O- 111，O- 144) 及沙門氏菌具有抗菌作用，還能殺死腸道出血性大腸桿菌O- 157。Fujida S.等采用納豆菌防治仔豬腹瀉取得了良好效果。 國內研究現狀國內對納豆菌的抗菌作用的研究的報道較少。江西中德聯(lián)合研究院的，鐘青萍等人研究了納豆菌對常見的污染食品微生物的拮抗作用，結果表明納豆菌具有廣譜抗菌作用，對各種細菌包括

38、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌都有拮抗作用。江西農業(yè)大學的黃占旺等人研究了不同溫度、pH值、培養(yǎng)時間、接種量、鹽濃度因素對納豆菌生長的影響,試驗結果表明,納豆菌生長適宜條件為：溫度3045，pH值7.0，培養(yǎng)時間24 h;接種量2%5%。納豆菌耐鹽性較強，在含鹽量8%的條件下仍能較好生長。天津科技大學的陳野等人將納豆菌接種于大豆的豆渣，在豆渣的發(fā)酵過程中添加一定的碳源，使其完全發(fā)酵，可以獲得具有抑菌性的產物。通過抑菌實驗可知，豆渣發(fā)酵產物具有一定的抑菌效果。鐘青萍等還研究了納豆菌抗菌蛋白的抗菌作用方式以及穩(wěn)定性，并將其運用于食品防腐中。結果表明：納豆菌抗菌蛋白對敏感菌起到了殺菌作用。

39、掃描電鏡觀察表明，抗菌蛋白可以改變細胞形態(tài)，使細胞表面粗糙，有凹陷、顆粒和發(fā)皰，形狀不規(guī)則。電鏡觀察進一步顯示，抗菌蛋白引起細胞損傷，并進而使整個細胞受到破壞，起到殺菌作用。納豆菌抗菌蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。17的NaC1可促進抗菌蛋白的抗菌作用，而二價金屬離子(Ca+2、Zn+2、Mg+2) 和三價金屬離子(Fe+3) 有一定的抑制作用。EDTA可促進抗菌蛋白的抗菌作用， 山梨酸鉀和SE一15亦有增效作用，而卵磷脂和CMC可降低抗菌蛋白的抗菌活性。鐘青萍等研究了納豆菌抗菌蛋自在鮮牛奶和新鮮瘦豬肉中的防腐效果。研究表明，納豆菌抗菌蛋自在消毒牛奶的保藏中具有顯著的防腐效果，樣品4 保

40、存2個月后，細菌總數仍低于100 CFU/mL；而對照樣品14天時微生物總數超標；37 貯存時亦有較好的防腐效果。在新鮮豬肉的保存中，0.06抗菌蛋白粗品的防腐效果與0.02 尼薩普林的相近。抗菌蛋白與乳酸鈉、山梨酸鉀和甘氨酸有一定的協(xié)同作用?？梢姡?納豆菌抗菌蛋白適于在食品中應用，且其可與NaC1、EDTA 和食品防腐劑如山梨酸鉀等復配，提高抗菌效果。目前只報道過對納豆菌產抗菌物質的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，對產生的抗菌活性物質還沒有人將其分離純化出來，需要進一步探討、研究。現在對納豆菌抗菌作用的研究主要集中在培養(yǎng)基的選擇、液體發(fā)酵條件及對致病微生物的抑制作用效果等，但沒有具體細化到是什么產物具有抑

41、菌功能。由于納豆菌能夠分泌的多種抗菌物質，它們的作用模式是協(xié)同還是其它或單獨成分，其機理的研究還有待進一步深入。7.4.3 納豆菌抗菌物質在研究開發(fā)過程中存在的問題目前，國內關于只有很少幾人研究了納豆菌具有廣譜抗菌作用，對于納豆菌產生的抗菌物質的作用機理、抗菌譜和應用的范圍等的研究并不多還不是很明了，也未導致無法分離出純品進行毒理學評價。這是進一步急需探討的問題。另外，應該首先提高納豆菌產生的抗菌物質的抗菌活性，即優(yōu)化它的發(fā)酵條件，從而進一步分離提純納豆菌產生的抗菌物質，但對于它的分離提純有一定的難度。納豆菌發(fā)酵液中存在著一種納豆菌的一股特殊的味道，不易被大家所接受，如何所以應該想辦法去除這種

42、異味而又不影響它的抗菌活性，也是需要。因此為了解決存在的問題。，促進天然食品防腐劑的發(fā)展，需要研究者的通力合作，只有這樣，才能使安全、高效的天然食品防腐劑得到正確、合理的使用。納豆菌是有益的菌，就更應該充分發(fā)揮它的優(yōu)點，來為人類更好的服務。7.4.4 納豆菌生產抗抑菌物質的前景由于納豆菌具有芽孢，因而能耐酸耐堿、耐高溫及耐擠壓，在加工過程中及在酸性胃環(huán)境中均能保持高度的穩(wěn)定性，因此納豆菌是微生態(tài)制劑的理想生產菌株。耐高溫可能是因為桿菌肽和多粘菌素屬于抗菌肽，抗菌肽一般都有很高的熱穩(wěn)定性，抗菌肽還具有廣譜殺菌作用，而且2，6- 吡啶羧酸也是具有耐熱性的物質。利用納豆菌生產微生態(tài)制劑，國內已有單位

43、著手研究，但尚未見相關報道，而國外也僅在日本有相關的研究報道。有研究表明納豆菌抗菌蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，這種抗菌物質也具有較高的耐鹽能力，EDTA 可促進抗菌蛋白的抗菌作用，另外，研究者還研究了納豆菌的抗菌作用，證明納豆菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性，納豆菌抗菌蛋白抗菌譜廣，抗菌作用較強，且其特性適合于食品中的應用。納豆菌產生的抗菌物質是經過微生物發(fā)酵而產生的，屬于純生物制劑，對人、畜均無毒害作用。隨著各國對納豆菌研究的不斷深入，它產生的代謝產物2，6-吡啶二羧酸、桿菌肽、多粘菌素具有較強的抗菌作用，對常見的致病菌具有很強的抑菌效果。因此可以通過生物純化技術把這些抗菌物質分離出來，用來制

44、取天然生物防腐劑，把它用在食品添加劑方面，其作用可相當于防腐劑，且其無毒無副作用，以此來滿足消費者對天然食品防腐劑的要求。由于目前，在食品中應用較多的微生物生物防腐劑有Nisin尼辛、溶菌霉和納他霉素和-聚賴氨酸等。雖然,這其中有些產品國內還沒有工業(yè)化生產,這給食品工業(yè)生產中的批量應用帶來一定的不便,如果從國外進口,價格昂貴。以天然農產品為原料，用發(fā)酵等生物技術制備,具有高效、無毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等的優(yōu)點，但是，并不能滿足,成為食品工業(yè)的整體發(fā)展的需要防腐劑研究、應用、發(fā)展的一個重要方面。納豆菌抗菌物質的發(fā)酵周期短,投資小，成本低,對環(huán)境無污染,可同時生產其它一些有用的副產物，因此，納豆菌

45、發(fā)酵作為新型高效的天然食品防腐劑的開發(fā)具有廣闊的開發(fā)潛力和市場前景。不少微生物在其代謝過程中都能產生抑菌物質,但作為食品防腐劑必須符合：生物殺菌素本身對人體完全無害；在消化道內降解為食物的正常成分；對食品進行熱處理降解為無害成分；不影響消化道菌群；不影響藥用抗菌素的使用等要求。納豆在日本已經被食用了2000多年,其特性適合于作為天然防腐劑在食品中應用。納豆菌抗菌物質抗菌譜較廣,具有較強的抗菌作用和良好的穩(wěn)定性,將其應用于牛奶和豬肉的防腐試驗證明,納豆菌作為食品防腐劑具有良好的防腐效果,0.06%抗菌蛋白的防腐效果與0.02%Nisin的效果相近,與乳酸鈉等化學防腐劑配合使用效果更好。目前在食品中應用較多的生物防腐劑尼辛、溶菌霉和納他霉素等,這其中有些產品國內還沒有工業(yè)化生產,這給食品工業(yè)生產中的批量應用帶來一定的不便,如果從國外進口,價格昂貴。以天然農產品為原料,用發(fā)酵等生物技術而制備,具有高效、無毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等優(yōu)點,成為食品防腐劑研究、應用、發(fā)展的一個重要方面。納豆菌抗菌物質的發(fā)酵周期短,投資小,成本低,對環(huán)境無污染,可同時生產其他一些有用的副產物,因此,納豆菌發(fā)酵作為新型高效的天然食品防腐劑的開發(fā)具有廣闊的開發(fā)潛力和市場前景。微生物防腐劑抑菌物質的鑒定,抗菌譜的確立,食品毒理學分析