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1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上假設(shè):筒箭毒能與乙酰膽堿競爭神經(jīng)肌接頭處的nm受體,使肌肉松弛【實(shí)驗原理與目的】神經(jīng)肌肉接頭處的興奮傳遞過程有三個重要的環(huán)節(jié):一是鈣離子促進(jìn)神經(jīng)軸突中的囊泡膜與接頭前膜發(fā)生融合而破裂;二是囊泡中的乙酰膽堿釋放到神經(jīng)肌肉接頭間隙;三是乙酰膽堿與接頭后膜上的受體結(jié)合,引發(fā)終板電位。乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),是連接每個運(yùn)動神經(jīng)元和骨骼肌之間的信使。如果ACh的傳遞受阻,肌肉就不能收縮。箭毒是美印第安人在獵箭頭部涂抹的一種毒藥,它能夠占用并阻塞ACh 受體的位置,能競爭性阻斷ACh 的去極化作用致使神經(jīng)遞質(zhì)不能影響肌肉。能與ACh 競
2、爭神經(jīng)肌接頭處的nm膽堿能受體,但不激動受體,因而使骨骼肌松弛??鼓憠A酯酶藥可拮抗其肌肉松弛作用,新斯的明是膽堿酯酶抑制劑,可通過抑制膽堿酯酶增減乙酰膽堿在肌接頭間隙的濃度。故筒箭毒過量可用適量新斯的明解救。筒箭毒與乙酰膽堿競爭性結(jié)合乙酰膽堿受體,注射新斯的明后使突觸間隙內(nèi)的乙酰膽堿濃度升高而使競爭性增強(qiáng),故乙酰膽堿與受體接觸增多,從而使肌無力癥狀減弱。本實(shí)驗的目的是探索筒箭毒對神經(jīng)-肌接頭處興奮傳遞的影響極其相關(guān)機(jī)制;觀察筒箭毒的肌松作用,分析其作用點(diǎn);了解新斯的明對抗筒箭毒的作用。【實(shí)驗對象】大白鼠,體重250g以上?!緦?shí)驗器材和藥品】Powerlab 一套(主機(jī),刺激器,張力換能器),手
3、術(shù)器械一套,小動物人工呼吸機(jī),氣管插管,棉線,大頭針,鐵架臺,注射器0.001g%筒箭毒堿,0.005g%新斯的明,25%烏拉坦,1.5%普魯卡因,生理鹽水【實(shí)驗方法】1. 大鼠稱重,麻醉;25%烏拉坦腹腔注射0.5ml/100g麻醉。然后仰臥固定于鼠手術(shù)床上,分離氣管及頸外靜脈,分別插入氣管插管和靜脈插管,準(zhǔn)備好人工呼吸機(jī)。數(shù)分鐘后翻正反射消失,即可進(jìn)行實(shí)驗;2. 分離坐骨神經(jīng);在髖關(guān)節(jié)后,坐骨結(jié)節(jié)內(nèi)凹陷處切開皮膚,鈍性分離肌肉,暴露一段坐骨神經(jīng),用浸有1.5%普魯卡因的棉線圍繞坐骨神經(jīng)打一個結(jié),在坐骨神經(jīng)干上做傳導(dǎo)阻滯麻醉,排除下行干擾;3. 分離腓神經(jīng);在外側(cè)剪開皮膚,鈍性分離肌肉組織,
4、分離腓神經(jīng),神經(jīng)穿線備用;4. 分離脛前?。粚⒋笫髢汕爸潭ㄔ谑中g(shù)臺(仰臥),從后置踝關(guān)節(jié)正前方向剪開小腿皮膚,剪斷踝關(guān)節(jié)前部韌帶,分離脛前肌肌腱,沿脛骨分離脛前肌(注意不要損傷血管),在踝部的脛前肌肌腱處扎線,與結(jié)扎線遠(yuǎn)端切斷肌腱;5. 安裝并設(shè)定powerlab記錄肌張力的chart設(shè)定文件;調(diào)定刺激器有關(guān)參數(shù);6. 連接儀器;手術(shù)操作完成后,將脛前肌與powerlab的張力換能器向連接,腓神經(jīng)處安放刺激電極。最適負(fù)荷設(shè)定為10g左右。穩(wěn)定一段時間后,于給藥前記錄一段正常的肌肉收縮曲線;7. 緩慢靜脈注射0.001%筒箭毒堿0.1ml/100g,從儀器上觀察肌肉收縮曲線的變化情況;8. 待
5、肌肉收縮曲線再次穩(wěn)定或完全消失后,停止刺激,同時緩慢靜脈注射0.005%新斯的明0.15ml/100g,觀察肌肉收縮曲線的變化情況?!绢A(yù)期結(jié)果】注射筒箭毒后肌肉收縮曲線幅度變小甚至消失,即肌肉處于肌無力狀態(tài),注射新斯的明后肌肉收縮曲線又基本恢復(fù)正常,即肌肉恢復(fù)正常收縮狀態(tài);【結(jié)果分析】從神經(jīng)傳來的興奮,通過神經(jīng)-肌肉接頭傳遞給肌纖維膜,是以化學(xué)遞質(zhì)乙酰膽堿為中介進(jìn)行的,其全過程可分為:(1)接頭前過程.(2)神經(jīng)遞質(zhì)在間隙的擴(kuò)散.(3)接頭后過程。如果是筒箭毒作用于突觸前膜,即不能釋放乙酰膽堿,那么無論是否有新斯的明,后膜中均無乙酰膽堿,所以在注射新斯的明后仍然是肌無力狀態(tài),即不會出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果
6、;如果是筒箭毒作用于突觸間隙,即與突觸前膜釋放的乙酰膽堿結(jié)合,抑制其發(fā)揮作用,那么無論是否有新斯的明,后膜中均無可發(fā)揮作用的乙酰膽堿,所以在注射新斯的明后仍然是肌無力狀態(tài),即不會出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果;而如果是筒箭毒作用于突觸后膜,即與乙酰膽堿競爭性結(jié)合乙酰膽堿受體,注射新斯的明后使突觸間隙內(nèi)的乙酰膽堿濃度升高而使其競爭性增強(qiáng),使乙酰膽堿與受體接觸增多,從而使肌無力癥狀減弱,使肌肉收縮曲線幅度增強(qiáng),即會出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果;綜上所述,假設(shè)成立?!咀⒁馐马棥?. 在靜脈注射筒箭毒和新斯的明時推射速度不宜過快,以免引起動物呼吸麻痹而導(dǎo)致其死亡,影響實(shí)驗結(jié)果;當(dāng)其呼吸停止時立即進(jìn)行人工呼吸;2. 分離神經(jīng)時只能用玻璃
7、分針,不可用金屬器械或手觸摸;3. 分離神經(jīng)時切勿傷及神經(jīng)干及其分支,避免過度牽拉和其他不良刺激?!緦?shí)驗流程圖】分離坐骨神經(jīng)分離腓神經(jīng)分離脛前肌連接儀器靜脈注射筒箭毒堿大鼠稱重,麻醉,連接人工呼吸機(jī)靜脈注射新斯的明數(shù)分鐘后,翻正反射消失在坐骨神經(jīng)干上做傳導(dǎo)阻滯麻醉神經(jīng)穿線備用肌肉收縮曲線再次穩(wěn)定或消失后停止刺激預(yù)測實(shí)驗結(jié)果得出實(shí)驗結(jié)論驗證假設(shè)開 始安裝儀器,調(diào)定參數(shù)【后注】翻正反射 righting reflex 亦稱復(fù)位反射。一般指動物體處于異常體位時所產(chǎn)生的恢復(fù)正常體位的反射。這在高等脊椎動物的貓中表現(xiàn)得最為明顯,而且也進(jìn)行了很多研究工作。動物首先是頭部恢復(fù)正常位置,這是由于迷路感受而引起
8、的,反射中樞在中腦。這時軀干如果依然處于不正位置時,就發(fā)生頸肌扭曲,于是其肌梭的刺激就發(fā)出使軀干部恢復(fù)正位的第二反射(中樞分布在中腦或胸部脊髓中)。此外,一般也與體肌肌梭感受引起反射(中樞在中腦),或與視覺性反射有關(guān),也受皮膚的接觸刺激影響。在去大腦僵直時,這些反射全都消失。在各種無脊椎動物中,已知許多的翻正運(yùn)動是單純的反射行為,例如在海星的翻身中,由于失去了對管足的接觸刺激,便發(fā)出全管足的試探運(yùn)動,這樣便偶然地使最初與底面接觸的腕成為先導(dǎo)腕,從而逐漸地完成反轉(zhuǎn)。這時與重力感覺無關(guān),但食道神經(jīng)環(huán)對各獨(dú)立腕的反應(yīng)具有協(xié)調(diào)的作用。與此相反,水母類、蝸蟲類、卷貝類等的平衡胞,昆蟲類等的足肌牽張感受器
9、被認(rèn)為是與發(fā)出翻正反應(yīng)有關(guān)。翻正反射可用于檢驗麻醉程度,若翻正反射消失則證明麻醉成功。【參考文獻(xiàn)】1朱大年主編.生理學(xué)(第七版).人民衛(wèi)生出版社2008.1:39-412項輝等主編.生理學(xué)實(shí)驗指南.科學(xué)出版社 2008.3:177-1783唐四元主編.生理學(xué).人民衛(wèi)生出版社.2006.7:28-304樊小力等.生理學(xué).人民衛(wèi)生出版社2002.7:26-285陳克敏主編.實(shí)驗生理科學(xué)教程.科學(xué)出版社 2007.6:145-1476高興亞等主編.實(shí)驗生理科學(xué)教程機(jī)能實(shí)驗學(xué)(第三版).科學(xué)出版社 2010.9:178-1807孫以方等主編.醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物學(xué)教程.河南醫(yī)科大學(xué)出版社 2000.12:22
10、1-224【相關(guān)材料】1 神經(jīng)肌肉接頭處的結(jié)構(gòu)在神經(jīng)末梢中含有大量直徑約50nm的囊泡,稱為接頭小泡,一個囊泡內(nèi)約含有1萬個乙酰膽堿分子。骨骼肌的神經(jīng)-肌肉接頭是由接頭前膜、接頭間隙、接頭后膜(運(yùn)動終板)三部分組成。接頭前膜是運(yùn)動神經(jīng)末梢嵌入肌細(xì)胞膜的部位,因此,接頭前膜是神經(jīng)軸突的細(xì)胞膜;接頭后膜,又稱終板膜,是與接頭前膜相對應(yīng)的肌細(xì)胞膜。它較一般的細(xì)胞膜厚,并有規(guī)律地向細(xì)胞內(nèi)凹陷,形成很多皺褶,增加與接頭前膜的接觸,有利于興奮的傳遞。在接頭后膜上有與ACh特異結(jié)合的N2型乙酰膽堿受體,它們集中分布與皺褶開口處,是化學(xué)門控通道的一部分,屬于陽離子通道耦聯(lián)受體。在終板膜表面還分布有膽堿酯酶,它
11、可將ACh分解為膽堿和乙酸;接頭前膜與后膜之間并不直接接觸,而是被充滿了細(xì)胞外液的接頭間隙隔開,間隔約50nm,其中尚含成分不明的基質(zhì)。2 神經(jīng)肌肉接頭處的興奮傳遞過程從神經(jīng)傳來的興奮,通過神經(jīng)-肌肉接頭傳遞給肌纖維膜,是以化學(xué)遞質(zhì)乙酰膽堿為中介進(jìn)行的,其全過程可分為:(1)接頭前過程.(2)神經(jīng)遞質(zhì)在間隙的擴(kuò)散.(3)接頭后過程。2.1接頭前過程2.1.1乙酰膽堿的合成與貯存 這是神經(jīng)-肌肉接頭的興奮傳遞的前提。乙酰膽堿在神經(jīng)末梢中由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙?;傅淖饔孟潞铣傻摹R阴]o酶A主要來自神經(jīng)末梢內(nèi)的線粒體,膽堿則是靠膜上的特殊載體轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)末梢內(nèi)的,其中50%是釋放入接
12、頭間隙中的乙酰膽堿水解產(chǎn)物,被再攝取回來重復(fù)利用的。合成與攝取回來的乙酰膽堿,均以囊泡形式包裝貯存,以備釋放。2.1.2乙酰膽堿的釋放 Ca2+內(nèi)流是誘發(fā)乙酰膽堿釋放的必要環(huán)節(jié)。當(dāng)動作電位到達(dá)神經(jīng)末梢時,接頭前膜的去極化使電壓門控Ca2+通道開放,大量Ca2+由胞外進(jìn)入到突觸前末梢內(nèi),這些Ca2+不僅是一種電荷攜帶者,可抵消神經(jīng)末梢內(nèi)的負(fù)電位,而且本身就是一種信使物質(zhì),可以觸發(fā)囊泡中的乙酰膽堿以胞吐的形式釋放到接頭間隙中。一次動作電位引起的Ca2+內(nèi)流,可導(dǎo)致200-300個囊泡幾乎同步地完全釋放出乙酰膽堿分子。由于每個囊泡中所含的乙酰膽堿分子數(shù)相等,約5000-100
13、00個,故這種以囊泡為單位的傾囊釋放,被稱為量子釋放。如果降低細(xì)胞外Ca2+ 濃度或用Mg2+阻斷Ca2+ 內(nèi)流,動作電位到達(dá)時并不能引起乙酰膽堿釋放,說明Ca2+ 在前膜的興奮和乙酰膽堿遞質(zhì)釋放過程中起偶聯(lián)和觸發(fā)作用。這里Ca2+的進(jìn)入量也決定囊泡釋放的數(shù)量。2.2乙酰膽堿在接頭間隙的擴(kuò)散乙酰膽堿在接頭間隙后,經(jīng)擴(kuò)散與終板膜上的膽堿能受體特異性結(jié)合,觸發(fā)接頭后過程。2.3接頭后過程2.3.1乙酰膽堿受體及終板電位 在終板膜上的N型乙酰膽堿受體,是集受體與通道為一體的一個蛋白大分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)乙酰膽堿分子與受體結(jié)合后,使受體-通道分子構(gòu)象改變,通道開放,允許Na+、K+甚至
14、少量的Ca2+通過。由于這幾種離子在細(xì)胞內(nèi)外分布特點(diǎn),故主要是使Na+內(nèi)流,少量K+外流,結(jié)果是終板膜原有靜息電位負(fù)值減少,向零電位靠近即出現(xiàn)終板膜的去極化,終板膜這種去極化電位為終板電位。一次動作電位所引起到200300個囊泡釋放的乙酰膽堿,足以在終板膜上產(chǎn)生約60mV、持續(xù)12ms的終板電位。而每一個囊泡釋放的乙酰膽堿所引起的終板膜0.11mV的去極化電位,稱微終板電位。2.3.2乙酰膽堿從接頭間隙的清除 乙酰膽堿發(fā)揮作用后可通過3方式清除,即擴(kuò)散、酶降解和再攝取。由于多個囊泡幾乎是同步釋放乙酰膽堿至接頭間隙,乙酰膽堿的濃度突然升高,乙酰膽堿與受體結(jié)合可引起大量化學(xué)門控通道打開
15、,出現(xiàn)很快Na+、K+跨膜移動,故終板電位升高很快。但接頭間隙中的乙酰膽堿很快被突觸后膜上的膽堿酯酶水解,乙酰膽堿濃度降低,遞質(zhì)門控通道關(guān)閉,終板電位下降,保證下次到來的神經(jīng)沖動效應(yīng),被水解的產(chǎn)物被動地再攝取到軸突末梢,可作為再合成乙酰膽堿的原料。2.3.3終板電位的特征及肌膜動作電位的引起 終板電位屬于局部電位,具有局部電位的特征,即沒有“全或無”現(xiàn)象,其電位的大小與乙酰膽堿釋放量成正相關(guān);呈電緊張性擴(kuò)布,約在距終板膜2nm處基本消失;無不應(yīng)期,有總和現(xiàn)象等。一般記錄到終板電位就是眾多微終電位的總和。由于在終板膜以外的肌膜上有電壓門控Na+、K+通道的分布,當(dāng)終板電位擴(kuò)布到鄰近的
16、肌膜上,引起鄰近肌膜去極化達(dá)閾電位水平時,便爆發(fā)肌膜上的動作電位,表現(xiàn)為肌細(xì)胞的興奮。正常情況下,一次動作電位傳至運(yùn)動神經(jīng)末梢所釋放的乙酰膽堿所引起的終板電位刺激鄰近肌細(xì)胞膜,其刺激強(qiáng)度大約超過引起肌細(xì)胞動作電位所需閾值地3-4倍,故有很高的安全系數(shù),即運(yùn)動神經(jīng)每一次神經(jīng)沖動到達(dá)末梢,都能可靠地使肌細(xì)胞興奮而誘發(fā)一次收縮。3神經(jīng)肌肉接頭處的興奮傳遞特征:3.1 化學(xué)性傳遞。神經(jīng)-骨骼肌接頭處的興奮傳遞是通過神經(jīng)末梢釋放ACh這種化學(xué)傳遞進(jìn)行的。3.2 單向性傳遞。興奮只能由運(yùn)動神經(jīng)末梢傳向肌肉,不能作相反方向的傳遞。這是由神經(jīng)-骨骼肌接頭處的結(jié)構(gòu)
17、特點(diǎn)決定的。3.3 時間延擱。興奮通過一個神經(jīng)-骨骼肌接頭,一般至少需要0.5-1.0ms,而接頭間隙只不過50nm。3.4 易受藥物或其他環(huán)境因素的影響。細(xì)胞外液的堿度、溫度的改變和藥物或其他體液性物質(zhì)的作用等都可以影響神經(jīng)-骨骼肌接頭處的興奮傳遞。 4神經(jīng)肌肉接頭處的興奮傳遞影響因素4.1 Ca2+ Ca2+是興奮-分泌偶聯(lián)物質(zhì),在一定離子濃度范圍內(nèi),ACh的釋放隨著Ca2+濃度的增高而增多。Mg2+可拮抗Ca2+的作用,使ACh的釋放量減少。4.2箭毒 箭毒能與終板上的ACh受體結(jié)合,形成無活性的a-箭毒復(fù)
18、合物,而這種復(fù)合物是不能完全與ACh相結(jié)合的。因為箭毒和ACh爭奪受體,所以箭毒引起的阻滯為競爭性阻滯或非除極性阻滯。它的阻滯作用可用抗膽堿酯酶物質(zhì)來緩解。重癥肌無力患者的某些橫紋肌非常容易疲勞,并產(chǎn)生暫時癱瘓。重癥肌無力傳遞阻的原因,可能是由于終板膜上ACh受體比正常少??鼓憠A酯酶藥物能迅速改善患者的肌力。4.3抗膽堿酯酶藥物 抗膽堿酯酶藥物,如毒扁豆堿、新斯的明等,可與AChE相結(jié)合,使AChE失去作用而不能分解ACh。有機(jī)磷農(nóng)藥及一些神經(jīng)毒劑能抑制AChE的活性,也可產(chǎn)生傳遞阻滯作用。碘解磷定能使抑制的AChE恢復(fù)活性,所以是解毒有即磷中毒的有效藥物之一。5普魯卡因【用法用量
19、】1.局部浸潤麻醉常用0.25%1%普魯卡因。2.神經(jīng)阻滯麻醉常用1.5%2%溶液,成人一次最大量為1g。3.脊麻常用3%5%溶液,常規(guī)用量一般不超過150mg。4.全麻輔助:一般用1%溶液靜脈滴注。6.由于箭毒雖然劇毒,卻會被消化道中的消化液分解成無毒的物質(zhì),所以不會使人中毒。但是人的口腔、咽、食道或胃等消化道若有傷口的話,人就有中毒的危險了。7神經(jīng)阻滯麻醉(conduction anaesthesia) 將局麻藥注射到外周神經(jīng)干附近,通過阻斷神經(jīng)沖動的傳導(dǎo),使該神經(jīng)所支配的區(qū)域麻醉。常用的局麻藥為procaine、lidocaine、bupivacaine。骨骼肌松弛藥實(shí)驗的實(shí)驗對象選擇在
20、進(jìn)行神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥試驗研究時,動物品種的選擇是十分重要的,因神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥的效應(yīng)有明顯的動物種屬差異,只有選用在反應(yīng)性質(zhì)和程度與人相似的動物進(jìn)行實(shí)驗,所得結(jié)果才對臨床用藥有較高的參考價值。不同種動物對同一種神經(jīng)肌接點(diǎn)阻滯藥的反應(yīng)不同,如貓、狗、兔、大白鼠對十烴季銨和筒箭毒的敏感性各不相同,其間差異見圖10-8、表10-30所示。不同種屬動物對神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥反應(yīng)的差異不僅表現(xiàn)在作用強(qiáng)度上,而且反應(yīng)在作用性質(zhì)上,如貓對琥珀酰膽堿、十烴季銨的反應(yīng)與人近似,呈單純?nèi)O化型阻斷作用,而在兔、豚鼠、大白鼠常表現(xiàn)為雙相阻斷作用。雞對十烴季鋟特別敏感,大白鼠對筒箭毒敏感,人對十烴季銨與筒箭毒的反應(yīng)介于貓
21、對狗之間而與貓近似。雖然蛙、兔、小雞、小白鼠等動物在神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥的試驗研究上各有應(yīng)用價值,如蛙可在不用人工呼吸的條件下作用于觀察神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥的作用,小雞可用于區(qū)別去極化型阻斷藥與非去極化型阻斷藥,兔垂頭法可用于觀察神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥的效應(yīng)和鑒定其效價,小白鼠用于神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥的初篩,但以貓對神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥的的反應(yīng)與人最近似,故貓是必不可少的試驗動物,但也不是一切試驗均需要在貓身上進(jìn)行。圖10-3不同種實(shí)驗動物對十烴季銨和筒箭毒的敏感性表10-30一些神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷藥對人、貓、大白鼠的相對效價*動物人貓大白鼠氯化筒箭毒1/(10mg)1/(0.4mg/kg)1/(0.07mg/kg)三
22、乙基碘化格拉明0.2/(50mg)0.26/(1.5mg/kg)0.02/(3.5 mg/kg)甲基硫酸勞德克辛0.5/(20mg)0.7/(0.6mg/kg)0.04/(2 mg/kg)氯化苯唑醌銨1/(10mg)1.6/(0.25mg/kg)0.07/1 mg/kg)碘化十烴季銨4.5/(2.24mg)10/(0.04mg/kg)0.04/2 mg/kg)氯化琥珀酰膽鹼1/(10mg)8/(0.05mg/kg)0.07/1 mg/kg)溴化氨酰膽鹼4.5/(2.24mg)20/(0.02mg/kg)0.05/1.5 mg/kg) *每格中上面數(shù)字是以筒箭毒用為1m算出的相對強(qiáng)度。插號中數(shù)字為產(chǎn)生90-95%神經(jīng)肌接點(diǎn)阻斷作用所需劑量。探究性實(shí)驗與驗證性實(shí)驗的比較l、概念(1)探究性實(shí)驗:指實(shí)驗者在不知曉實(shí)驗結(jié)果的前提下,通過自己實(shí)驗、探索、分析、研究得出結(jié)論,從而形成科學(xué)概念的一種認(rèn)知活動。(2)驗證性實(shí)驗:指實(shí)驗者針對已知的實(shí)驗結(jié)果而進(jìn)行的以驗證實(shí)驗結(jié)果、鞏固和加強(qiáng)有關(guān)知識內(nèi)容、培養(yǎng)實(shí)驗操作能力為目的的重復(fù)性實(shí)驗。2、比較表探究性實(shí)驗驗證性實(shí)驗實(shí)驗?zāi)康奶剿餮芯繉ο蟮奈粗獙傩?、特征以及與其他因素的關(guān)系驗證研究對象的已知屬性、特征以及與其他因素的關(guān)系實(shí)驗假設(shè)假設(shè)一般采用“如果A,則B” 的形式表述,是根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論、事實(shí)對所要研
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