嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定（二）

1、嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定（二） 6.1 接種菌懸液的制備 6.1.1 將凍干菌株(4.1)活化后，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基(4.3.1)中，36±1培養(yǎng)過夜。再 轉(zhuǎn)接23代來增加活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基(4.3.2)中培養(yǎng)。 6.1.2 將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心2min3min,傾出上清液，加入10ml溶液(4.7),混勻，再離心2 min3 min,如此清洗3次4次，吸適量該菌懸液于10ml氯化鈉(4.7) 中，待測。 6.1.3 用分光光度計以溶液(4.7)做空白，于550 nm波長下測菌懸液(6.1.2)的透光率，使 其透光率在6

2、0%80%。 6.2 樣品的處理 6.2.1 干粉樣品 稱取一定量樣品(精確至0.0001g)于250 ml三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.2ug0.5ug生物素。繼續(xù) 6.2.3步驟。 6.2.2 液體樣品 吸一定量的液體樣品于250ml三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.2ug0.5ug生物素。繼續(xù)6.2.3步驟。 6.2.3 樣品的提取 加入溶液(4.5)100ml,121水解30min,冷卻后用溶液(4.6)調(diào)整ph至4.5±0.2,定量轉(zhuǎn)到250ml容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液5ml,加入約20ml水，用氫氧化鈉溶液(4.6)調(diào)ph為6.8±0

3、.2,定量轉(zhuǎn)到100ml容量瓶中，用水定容。 6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按表1挨次加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液(4.8.4)和生物素測定用培養(yǎng)基(4.3.3)于培養(yǎng)管中，一式三份。 表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 6.4 待測液的制作 按表2挨次加水、樣品溶液(6.2.3)和生物素測定用培養(yǎng)基(4.3.3)于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。每份樣品需帶樣品空白試管一只，管內(nèi)分離加入5ml待測液和5ml培養(yǎng)基。 表2 待測液的制作 6.5 滅菌 將6.3和6.4中全部的試管蓋上試管帽，放入滅菌釜內(nèi)，121滅菌5min(商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽解釋舉行滅菌)。 6.6 接種 從滅菌釜內(nèi)取出試管，將試管快速冷卻至30以下。將接種菌懸液(6

4、.1.2)用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴(約50ul),其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中未接種空白s1和樣品空白除外。 6.7 培養(yǎng) 將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36±1培養(yǎng)19h20h。 6.8 測定 對每支試管舉行視覺檢查，接種空白試管s1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，假如浮現(xiàn)渾濁，則結(jié)果無效。 6.8.1 以接種空白試管s1做對比，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時后重新測定。兩次結(jié)果透光率差值若小于2%,則取出所有檢驗管測其吸光度a。 6.8.2 以接種空白試管s2為空白，調(diào)整吸光度為0,依次讀出其他每支試管的吸光度a,樣品空白的吸光度a并讀出。 6.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管(也可以

5、加一滴消泡劑)后，立刻將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)舉行測定，波長為550nm,待讀數(shù)穩(wěn)定30s后，讀出吸光度a,每支試管穩(wěn)定時光要相同。以生物素標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，吸光度a為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.8.4 待測液培養(yǎng)試管中，樣品空白試管吸光度應(yīng)小于0.05。若樣品空白試管吸光度大于0.02,加入待測液1ml的試管的吸光度值要減去其樣品空白試管吸光度值的1/5,加入待測液2ml的試管的吸光度值要減去其樣品空白試管吸光度值的2/5,以此類推，作為計算結(jié)果的依據(jù)。按照待測液的吸光度a, 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測液中生物素的濃度，再按照稀釋因子和稱樣量計算出試樣中生物素的含量。吸 光度值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管s3s1

6、0范圍的試樣管要舍去。 6.8.5 對每個編號的待測液試管，用每支試管的吸光度值計算每毫升該編號待測液生物素的含量，并 計算該編號待測液的生物素含量平均值，每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的±15%,超過者要 舍去。假如符合該要求的管數(shù)少于全部四個編號待測液總管數(shù)的2/3,需要重新檢驗。假如符合該要求 的管數(shù)大于等于本來管數(shù)的2/3,重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液生物素含量的平均值， 以此平均值計算所有編號試樣管的總平均值cx,用于計算試樣中的生物素含量。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中生物素的含量按公式(1)計算： 式中： x試樣中生物素的含量，單位為微克每百克(ug/100g)； cx6.8.5中計算所得的總平均值，單位為納克(ng)； m試樣的質(zhì)量，單位為克(g); f稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次自立測定結(jié)