蛋白質(zhì)的檢測方法與乳制品中蛋白含量測定

1、第 24卷 第 1期 大 學(xué) 化 學(xué) 2009年 2月 蛋白質(zhì)的檢測方法與乳制品中蛋白含量測定許家喜(北京 化工大學(xué)理學(xué)院化工資源有效利用國家重點實驗室 北京 100029摘要 介紹 5種常用的蛋 白質(zhì)檢測 方法 , 以及凱氏定 氮法在食 品 , 特 別是乳制品 蛋白含量 測 定中的應(yīng)用和存在的問 題 , 及其可能的解決方法。最近 , 由于不法商人向乳制品中添加高含氮量的有機(jī)化合物三聚氰胺來冒充蛋白質(zhì) , 嚴(yán)重 危害了廣大消費(fèi)者的身體健康 , 甚至生命安全。引起了公眾對乳制品等食品中蛋白質(zhì)含量測 定問題的關(guān)注。本文在此對蛋白質(zhì)的檢測方法和乳制品中蛋白質(zhì)含量的測定問題進(jìn)行簡單介 紹。1蛋白質(zhì)含量

2、的測定方法測定蛋白質(zhì)總含量是生物化學(xué)研究中最常用、 最基本的分析方法之一。目前常用的有 4種經(jīng)典方法 124:凱氏 (Kj e l d ah l 定氮法、 雙縮脲法 (Bi u ret 法 、 Foli n 2酚試劑法 (Lo w ry 法 和紫 外吸收法。另外 , 還有一種在近幾十年才 普遍使用起來的較新的測定法 考馬斯亮藍(lán)法 (Bradf ord 法 4。1. 1凱氏 (K jeldah l 定氮法將被測試的樣品與濃硫酸在硫酸銅和硫酸鉀存在下共熱消化 , 含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨、 二氧化碳和水 , 氨與硫酸反應(yīng)變成硫酸銨。消化后向消化液中加入強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨 , 用水蒸氣將氨蒸至硼酸

3、液中 , 用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)酸溶液滴定收集氨的硼酸溶液 , 即可計算出樣品的氮含 量 , 從而折算出樣品的蛋白質(zhì)含量 (通常由含氮量乘以系數(shù) 6. 25計算出 (該系數(shù)為蛋白質(zhì)平 均含氮量的倒數(shù) , 乳制品通過乘以系數(shù) 6. 38計算出 (該系數(shù)為乳制品中蛋白質(zhì)含氮量的倒 數(shù) 。這種方法是 K jeldahl 在 1883年發(fā)明的 , 當(dāng)時他只使用硫酸分解試樣 , 測定谷物中的蛋 白含量 , 需要較長的反應(yīng)時間。后來 Gunning 搞清楚了消化機(jī)理 , 在消化時加入 K 2S O 4使反應(yīng) 溫度由原來的 380e (硫酸沸點 上升到 400e , 并加入硫酸銅為催化劑 , 提高了消化速度 , 改 進(jìn)了

4、凱氏定氮法。該方法的缺點是耗時長 , 靈敏度低 , 樣品中的含氮化合物會影響蛋白含量的 測定。要想準(zhǔn)確測定出蛋白含量 , 可以先測定出總含氮量。再用三氯乙酸將樣品溶液中的蛋 白沉淀除去 , 然后測定溶液的非蛋白含氮量 , 最后從總含氮量中扣除非蛋白含氮量就可以比較 準(zhǔn)確地測定出樣品的真正蛋白含量。1. 2雙縮脲法 (B i u ret 法 雙縮脲 (N H 3CO NHCON H 3 是兩分子的脲經(jīng) 180e 左右加熱 , 放出 一分子氨后得到的產(chǎn) 物。在強(qiáng)堿性溶液中 , 雙縮脲與硫酸銅形成紫色絡(luò)合物 , 稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基 66或兩個直接連接的肽鍵 , 或間隔一個碳原子相連的肽

5、鍵結(jié)構(gòu)的化合物都可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比 , 而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān) , 可用來測 定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為 110mg 蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有 :硫酸銨、 Tris 緩沖 液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速 , 不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近 , 以及干擾物質(zhì) 少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速、 但并不需要十分精確的蛋白質(zhì) 測定。1. 3Folin 2酚試劑法 (Low ry 法 Foli n 2酚 試劑法 (Lo w r y 法 是由 Lo wry 在雙縮脲方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的。他在雙縮脲試劑的 基礎(chǔ)上又增加了一種

6、增強(qiáng)顯色的試劑 磷鉬酸和磷鎢酸的混合液 , 它們被蛋白質(zhì)中酪氨酸 殘基的酚羥基還原 , 產(chǎn)生深藍(lán)色 (鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物 , 以增加顯色量 , 從而提高了檢測蛋白 質(zhì)的靈敏度。該測定法的優(yōu)點是靈敏度高 , 比雙縮脲法靈敏得多 , 此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量 達(dá) 5L g 。通常測定范圍是 20250L g 。缺點是費(fèi)時較長 , 要精確控制操作時間。因 Lo wry 反應(yīng) 的顯色隨時間不斷加深 , 因此各項操作必須精確控制時間 , 標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式 , 且專一性較差 , 干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子 , 同樣容易干擾 Lo wry 反應(yīng) , 而 且對后者的影響更大。酚類、

7、檸檬酸、 硫酸銨、 T ris 緩沖液、 甘氨酸、 糖類、 甘油等均有干擾作 用。由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸 , 顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本 測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度 (相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 。1. 4考馬斯亮藍(lán)法 (Brad ford 法 雙縮脲法和 Foli n 2酚試劑法的明顯缺點和使用限制 , 促使科學(xué)家去尋找更好的蛋白質(zhì)含 量測定方法。 1976年 , 由 Bradf ord 建立的考馬斯亮藍(lán)法 (Bradf or d 法 是根據(jù)考馬斯亮藍(lán) G 2250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸 及芳香族氨基酸殘基相結(jié)合 , 使 染料最大吸

8、收峰的位置 (K m ax 由 465n m 變?yōu)?595nm, 溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色的原理 設(shè)計的 4。在 595nm 下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。這一方法是目前靈敏度最高 的蛋白質(zhì)測定法 , 因而正在得到廣泛的應(yīng)用?？捡R斯亮藍(lán)法的突出優(yōu)點是 :(1 靈敏度高 , 比 Lo wry 法約高 4倍 , 最低蛋白質(zhì)檢測量可 達(dá) 1L g 。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大 , 蛋白質(zhì) 2染料復(fù)合物有更高的消 光系數(shù)。 (2 測定快速、 簡便 , 只需加一種試劑。完成一個樣品的測定一般只需要 5分鐘左 右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程大約只要 2分鐘即可完成 , 其顏色可

9、以在 1小時內(nèi)保持穩(wěn) 定 , 且在 5分鐘至 20分鐘之間 , 顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像 Lo wry 法那樣費(fèi)時和嚴(yán) 格地控制時間。 (3 干擾物質(zhì)少。如干擾 Lo wry 法的 K +、 Na +、 Mg 2+、 T ris 緩沖液、 糖和蔗糖、 甘油、 巰基乙醇、 EDT A 等均不干擾此測定法。此法的缺點是 :(1 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 , 因此用于不 同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。 (2 主要的干擾物質(zhì)有 :去污劑、 Triton X 2100、 十二烷基硫酸 鈉 (S DS 和 0. 1mol/L的 N a O H 。 (3 標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性

10、 , 因而不能用 Beer 定律進(jìn)行計 算 , 而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定。1. 5紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在 280nm 處具有紫外吸收 , 其吸光 度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外 , 蛋白質(zhì)溶液在 238nm 的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一 67定波長下蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測定蛋白質(zhì)含量。紫外吸收法簡便、 靈敏、 快速 , 不消耗樣品 , 測定后能回收。低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖液不 干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差 , 專一性差 , 干擾物質(zhì)多 , 若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能

11、吸收紫外光的物質(zhì) , 會出現(xiàn)較大的干擾。雖可以校正 , 但還是存在一定的誤 差。在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時 , 對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大 的蛋白質(zhì) , 有一定的誤差。故該法適用于測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。此外 , 由于蛋白質(zhì)吸收峰常因 p H 的改變而有變化 , 因此測定樣品時的 p H 要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 p H 一致。表 15種常用蛋白質(zhì)含 量測定方法比較方法 靈敏度 時間 原理 干擾物質(zhì) 說明凱氏定氮法 (K j edah l 法 靈敏 度 低 , 適用 于 0. 21. 0m g 氮 , 誤差為 ? 2%費(fèi)時810小時將蛋 白氮 轉(zhuǎn)化 為氨 , 用

12、酸吸 收后 滴定 測定 , 再轉(zhuǎn)換成蛋白含量非蛋白氮 (可用 三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含 量的 準(zhǔn)確 測 定 ; 干 擾少 ; 費(fèi)時長雙縮脲法 (Bi u ret 法 靈敏度低120m g中速2030分鐘肽鍵 與堿 性 Cu 2+生 成紫色 絡(luò)合 物 , 通 過紫 外測定硫 酸 銨 ; K +、 Na +、Mg 2+; Tris 緩 沖 液 ;某些氨基酸用于 快速 測 定 , 但 不太 靈敏 ; 不 同 蛋 白質(zhì)顯色相似Folin 2酚 試 劑 法 (Lo wry 法 靈敏度高約 5L g慢速4060分鐘雙縮脲反 應(yīng) ; 磷鉬酸 2磷鎢酸試 劑被 Tyr 和 Phe還原硫酸銨

13、; T ri s 緩 沖液 ;甘氨酸 ; 各種硫醇費(fèi)時 較長 ; 操 作 要 嚴(yán)格 計時 ; 顏 色 深 淺與蛋白有關(guān)紫外吸收法 較為靈敏 50100L g 快速510分鐘蛋白中的酪氨酸和色氨酸 殘 基 在 280nm 的 光吸收各種嘌 呤和 嘧啶 ; 各種核苷酸用于 層 析柱 檢 測 ; 核酸吸收可以校正考馬斯亮藍(lán)法 (Brad f ord 法 靈敏度最高15L g快速515分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì) 結(jié) 合 時 , 其 Km ax由465nm 變?yōu)?595nm強(qiáng)堿性緩 沖 液 ; S DS ;TritonX 2100干擾 物質(zhì) 少 ; 顏 色 穩(wěn)定 ; 顏 色深 淺 與 蛋白質(zhì)有關(guān)可見 ,

14、 考馬斯亮藍(lán)法和 Foli n 2酚 試劑法靈敏度最高 , 比紫外吸收法靈敏 1020倍 , 比雙縮 脲法靈敏 100倍以上?？捡R斯亮藍(lán)法由于其突出的優(yōu)點 , 正得到越來越廣泛的應(yīng)用。但表 1中的后 4種方法并不是通用的 , 不能在任何條件下適用于測定任何形式的蛋白質(zhì) , 因為即使同 一種蛋白質(zhì)溶液用這 4種方法測定 , 也有可能得出 4種不同的結(jié)果。即每種測定法都不是完 美無缺的 , 都有其優(yōu)缺點。在選擇蛋白質(zhì)含量的測定方法時應(yīng)考慮 :(1 測定所要求的靈敏度 和精確度 ; (2 蛋白質(zhì)的性質(zhì) ; (3 溶液中存在的干擾物質(zhì) ; (4 測定的花費(fèi) , 包括材料費(fèi)、 儀 器和工時。凱氏定氮法雖

15、然測定過程稍微復(fù)雜些 , 但通用性強(qiáng) , 測定費(fèi)用低、 儀器簡單 , 且較準(zhǔn) 確 , 因此 , 常用來測定食品中蛋白質(zhì)的含量。2乳制品中蛋白含量測定蛋白質(zhì)的測定方法分為兩大類 :一類是利用蛋白質(zhì)的共性 , 即含氮量 , 肽鏈和紫外吸收測 定蛋白質(zhì)含量 , 另一類是利用蛋白質(zhì)中的特定氨基酸殘基以及酸、 堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測定蛋 白質(zhì)含量。由于食品種類很多 , 食品中蛋白質(zhì)含量又各不相同 , 特別是其他成分 , 如碳水化合 68物 , 脂肪和維生素的干擾成分很多。而凱氏定氮法因其通用性強(qiáng) , 測定費(fèi)用低 , 儀器簡單 , 且比 較準(zhǔn)確。因此常用凱氏定氮法來測定食品中的氮含量 , 由氮含量計算出蛋白

16、質(zhì)的含量。 目前我國食品中蛋白質(zhì)含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)就是通過凱氏定氮法來測定的 5。在檢驗 食品中蛋白質(zhì)時 , 往往只限于測定總氮量 , 然后乘以氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù) (乳制品為 6. 38, 面粉為 5. 70, 玉米、 高粱為 6. 24, 花生為 5. 46, 米為 5. 95, 大豆及其制品為 5. 71, 肉與肉制品為 6. 25, 大麥、 小米、 燕麥、 裸麥為 5. 83, 芝麻、 向日葵為 5. 30, 得到蛋白質(zhì)含量 , 實際上這樣測定 的蛋白質(zhì)含量包括核酸、 生物堿、 含氮類脂、 卟啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物 , 故稱為粗 蛋白質(zhì)。凱氏定氮法實際上測的不是蛋白質(zhì)含量 ,

17、 而是通過測氮含量來推算蛋白質(zhì)的含量。不法 商人就是利用了這一點 , 通過向乳制品中加入高含氮量的有機(jī)化合物三聚氰胺來提高其產(chǎn)品 的 /蛋白 0含量的。在正常情況下 , 對于食品 , 特別是乳制品中蛋白質(zhì)含量測定 , 這個測定方法 是沒有問題的 , 因為食品 , 特別是乳制品中的主要成分中只有蛋白質(zhì)含有氮 , 其他主要成分脂 肪、 碳水化合物都不含氮。因此 , 應(yīng)該說目前食品中蛋白質(zhì)含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)采用凱氏定氮 法 , 通過測定食品中總含氮量來計算蛋白質(zhì)含量的方法在理論上并沒有錯。但是 , 如果有人往 樣品中加入高含氮的其他物質(zhì) , 如三聚氰胺 , 就可以騙過凱氏定氮法獲得虛假的蛋白質(zhì)高含

18、量。這樣 , 就可以通過向原奶中兌水 , 把水當(dāng)作牛奶來賣 ; 向奶粉中添加淀粉等 , 將淀粉等當(dāng)作 奶粉 , 甚至嬰幼兒配方奶粉來出售。面對這一問題 , 僅通過建立食品、 特別是乳制品中三聚氰 胺的檢測方法是不夠的 , 因為不法分子為了商業(yè)利益可能還會 /研發(fā) 0其他高含氮化合物作為 新的 /蛋白精 0來替代受到高度關(guān)注的三聚氰胺。我們應(yīng)該面對現(xiàn)實 , 修改目前的食品中蛋白 質(zhì)含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn) , 參考或采用早就成為檢測牛奶氮含量的國際標(biāo)準(zhǔn) (I S O 8968, 在凱氏 定氮法測定樣品的總含氮量之后 , 再取一份樣品 , 先用三氯乙酸處理樣品 , 讓蛋白質(zhì)形成沉淀 , 過濾后 , 分別測定沉淀和濾液中的氮含量 , 就可以知道蛋白質(zhì)的真正含量和冒充蛋白質(zhì)的物質(zhì) 的氮含量 , 這是生物化學(xué)實驗教科書中的方法。只有改進(jìn)國家標(biāo)準(zhǔn) , 堵住漏洞 , 才能真正保證 人們吃上放心的食品。參 考 文