聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和瓊脂糖凝膠電泳 實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)三 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）以及瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握PCR反應(yīng)的原理及各反應(yīng)成分的作用；2.熟悉PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)規(guī)則；3.掌握引物的設(shè)計(jì)原則及其與PCR其他成分的配制方法；4.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理及其應(yīng)用范圍；5.熟悉瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)緩沖液的配制方法。實(shí)驗(yàn)原理一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理在已知待擴(kuò)增模板全部或部分序列的情況下，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，在含有Mg2+的緩沖溶液中，采用耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在特異性引物（分為上游和下游引物）的引導(dǎo)下，通過dNTP為原料，以cDNA或DNA等為模板，在人為控制DNA合成系統(tǒng)（PCR儀）溫度調(diào)節(jié)下，通過變性（95）、退火（5

2、0-60 ）及延伸（ 72 ）等3個(gè)步驟的循環(huán)進(jìn)行（30-35循環(huán)），在體外進(jìn)行雙鏈DNA變性為單鏈，單鏈DNA與特異性引物退火形成局部雙鏈，進(jìn)而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相應(yīng)模板延伸為特異性引物所限定范圍的大量雙鏈DNA的體外合成反應(yīng)。本質(zhì)為體外DNA合成的酶反應(yīng)。2 瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)原理 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。在一定電場強(qiáng)度下偏堿性的緩沖液中（TAE pH8.0或TBE pH7.5-7.8），DNA分子帶負(fù)電，其遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，在電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)作用下，具有不同的相對分子量及構(gòu)型的DNA片段泳動速度不同

3、。DNA 分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。 凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可以分離分子量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如質(zhì)粒的三種構(gòu)型的泳動速率不同：超螺旋閉合環(huán)狀質(zhì)粒最快，線型質(zhì)粒其次，開環(huán)質(zhì)粒最慢。實(shí)驗(yàn)步驟（一）PCR 加樣術(shù)式 在一微量離心管中依次加入下列試劑：水煮裂解后的細(xì)菌液 4µL10´PCR buffer（含MgCl2） 2 µLdNTPs (10mM) 1µL5引物(10µM) 1µL 20µL3引物(10µM) 1µLTaq DNA pol. (2U/µ

4、;L) 1 µL去離子水（補(bǔ)足反應(yīng)體系） 10µL輕彈管底混合（用離心機(jī)甩一下）（二）緩沖液組成10×PCR buffer:500 mM KCl100 mM Tris-Cl (pH 8.3)15 mM MgCl2有的會加入硫酸銨(ammonium sulfate)，化學(xué)式（NH4)2SO4 ，通過破壞蛋白質(zhì)在穩(wěn)定因素（親水行），而使蛋白析出。（三）dNTP1. dNTP，（脫氧核糖核苷三磷酸）的縮寫。N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C、U等中的一種。是包括dA/G/T/C/TP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，在生物DNA合成中，以及各種PCR中起原料作用。2. 4種dNTP

5、必須等濃度配合以減少錯配誤差，dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，通常的貯存液濃度為10mM，分裝后存放在-20。dNTP使用濃度在0.02-0.2mM之間。3.在PCR反應(yīng)中，使用低dNTP濃度，可減少非靶位置啟動和延伸時(shí)的核苷酸錯誤摻入。4.一般可根據(jù)靶序列的長度和組成來決定最低dNTP濃度。（四）引物設(shè)計(jì)原則基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。1. 引物長度： 15-30bp，常用20bp左右；2.擴(kuò)增跨度：以500bp為宜；3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜；4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)；5.引物3端的堿基要求嚴(yán)格配對（不能

6、做任何修飾）；6.引物5端可修飾；7.引物的特異性；引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性8.引物量；每條引物的濃度0.1 0.5M，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好；（五）引物配制1. 合成引物一般1OD分裝成1管；2.引物貯存液濃度為10M，需加純水或TE（pH8.0）3. 引物工作終濃度在0.1-0.5M，就可以滿足30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。（六）PCR參數(shù)設(shè)置1. 94預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán)2 . 94 30 秒 60 30 秒 30 -35循環(huán) 72 40 秒3. 72 5 分鐘4. 16 保溫實(shí)驗(yàn)過程約1小時(shí)30分鐘（七）瓊脂糖凝膠的制備1. 根據(jù)電泳需要，配制合適濃度的電泳及制

7、膠緩沖液。一般為1× TAE或0.5×TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2. 同時(shí)配制用于加樣過程的加樣緩沖液，以便于樣本進(jìn)入膠內(nèi)。瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的配制方法緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris乙酸（TAE）1×：0.04mol/L Tris乙酸 0.001mol/L EDTA50×：242g Tris堿57.7mL 冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)Tris硼酸（TBE）0.5×：0.045moL/L Tris硼酸 0.001moL/L EDTA5×：54g Tris堿 27

8、.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍凝膠中的瓊脂糖含量 %（W/V）DNA/RNA分子的分離范圍（ kb ）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-23. 根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉，充分搖勻。注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。4. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。5. 使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g/mL并充分混勻。（八）瓊脂糖凝膠緩沖液使用方法1.TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。2.電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。（九）瓊脂糖凝膠載樣緩沖液1.加樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品混合后一起加入膠空內(nèi)。加樣緩沖液有三個(gè)作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品帶有顏色便于上樣操作；其中的染料（溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF）在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。2.溴酚藍(lán)在瓊