不同能量攝入對圍產期奶牛脂肪組織胰島素受體 mRNA 豐 度

1、不同能量攝入對圍產期奶牛脂肪組織胰島素受體mRNA豐度的影響祝興林1,2 ,王哲1*,孫玉成1,何劍斌2(1.吉林大學農學部畜牧獸醫(yī)學院動物營養(yǎng)代謝病與中毒病研究室,吉林長春 130062;2.沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧沈陽 110161摘要:將年齡、胎次相同,年產奶量大于5000Kg的圍產期健康奶牛30頭隨機分為3組,每組10頭。低能組飼喂中國奶牛飼養(yǎng)標準(2000減少20%日糧(能量攝入80%組、對照組飼喂中國奶牛飼養(yǎng)標準(2000日糧(能量攝入100%組和高能組飼喂中國奶牛飼養(yǎng)標準(2000增加20%日糧(能量攝入120%組,實驗從產前14天開始至產后28天結束,產后各組奶牛均飼喂標

2、準日糧。采用內對照RT-PCR方法檢測了不同能量攝入對圍產期奶牛脂肪組織胰島素受體(InsRmRNA豐度的影響。實驗結果表明:各組脂肪InsR mRNA相對表達量從產前14天至產后28天均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,產后14天達到最大值,且產后高于產前;低能組產前InsR mRNA相對表達量低于高能組和正常組,產后1天至產后28天高于高能組和正常組,產后14天顯著高于高能組(P<0.01?？梢?干乳期低能飼喂奶牛,產后脂肪InsR mRNA表達增加,提示產前適當減低能量攝入水平,有利于胰島素抑制泌乳初期脂肪動員作用的發(fā)揮。關鍵詞:能量攝入;圍產期奶牛;脂肪組織;胰島素受體 mRNA;半定量R

3、T-PCR方法Effect of Energy Level on the Abundanceof Insulin Receptor mRNA in Adipose Tissues of Periparturient Dairy CowsZhu Xing-lin1,2 , Wang Zhe1*,Sun Yu-cheng1 ,He Jian-bin2(1.Lab of Animal Nutritional and Metabolic Diseases & Toxicopathy, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jili

4、n University, Changchun,130062, China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agriculture University, Shenyang,110161,ChinaAbstract:The objective of this study was to determine the relationship between energy intake and abundance of InsR mRNA in adipose tissues of periparturien

5、t dairy cows by the way of RT-PCR. At 14 days before parturition, thirty multiparous Hostein cows were randomly allocated into three groups fed with 100% energy diet (China Dairy Cow Raise Standard 2000 Diet, 120% energy diet and 80% energy diet, respectively. After parturition, all the cows were of

6、fered criteria day provisions until 28 days postpartum. Relative expression of InsR mRNA in adipose tissues was increased in varying degrees before parturition, peaked at 14 days after parturition and then decreased gradually in the dairy cows fed with 80%, 100% and 120% energy diets. Abundance of I

7、nsR mRNA in adipose tissues was lower in the cows fed with 80% energy diet than in the cows fed with 100% and 120% energy diets before parturition, and was higher than in the cows fed with 100% and 120% energy diets during the first 28 days after parturition,and was significantly higher in the cows

8、fed with 80% energy diet than in the cows fed with 120% energy diet at 14 days after parturition(P<0.01. It is concluded that the low energy diet during the dry period could be helpful to inhibiting fat mobilization in the dairy cows postpartum by insulin.Key words:energy intake; dairy cows; InsR

9、 mRNA ; adipose tissues;semi-quantitive RT-PCR胰島素是動物體內的一種蛋白質類激素,而胰島素受體(InsR是靶細胞膜上有糖蛋白,屬于酪氨酸激酶受體家族,即具有受體自動磷酸化激活的酪氨酸激酶活性。胰島素可作用于脂肪組織,與InsR結合,促進脂肪的合成和貯存,抑制脂肪的分解,并促進糖的利用,從而抑制酮體產生,糾正酮血癥。因此,InsR對于調節(jié)脂肪動員和血糖穩(wěn)定具有重要作用?；痦椖?國家自然科學基金重點項目(30230260作者簡介:祝興林(1979,男,漢族,在讀碩士研究生,主要從事動物營養(yǎng)代謝病研究。近年來對InsR的分子生物學特性及其功能和胰島素對

10、InsR作用機制的研究有了長足進步,但有關攝入不同能量的圍產期奶牛脂肪組織胰島素受體mRNA豐度的研究在國內外均尚未見報道。本試驗通過半定量RT-PCR方法,探討不同能量攝入水平對圍產期健康奶牛脂肪組織InsR mRNA豐度的影響,為從基因水平上揭示圍產期奶牛脂肪動員的調節(jié)機制提供實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1實驗動物及日常管理隨機選取健康圍產期高產荷斯坦奶牛30頭,年齡皆在28歲之間,305天的平均產奶量為7436kg,平均體重為637kg。將奶牛隨機分為3組,每組10頭:I組為對照組,飼喂按中國奶牛飼養(yǎng)標準(2000設計的日糧(能量攝入為營養(yǎng)需要量的100%,II組飼喂標準日糧增加20%日

11、糧(能量攝入為營養(yǎng)需要量的120%組,III組飼喂標準日糧減少20%日糧(能量攝入為營養(yǎng)需要量的80%組,日糧配方和營養(yǎng)水平見表1。表1 日糧配方及營養(yǎng)組成配比(%原料產前產后I II III精料補充(%:玉米60.76 60.62 49.47 52.72豆粕17.13 16.30 15.11 27.06棉籽粕0.00 0.00 0.00 4.92豆油 1.00 2.00 0.00 2.00羽毛粉0.00 1.98 0.00 1.96小麥麩13.96 11.04 27.77 5.84葵花粕 4.15 4.06 4.15 0.00磷酸氫鈣 1.00 1.00 1.50 1.00 復合添加劑預混料

12、 1.00 1.00 1.00 1.00 石粉0.00 1.00 0.00 1.00食鹽 1.00 0.80 1.00 1.00小蘇打0.00 0.20 0.00 1.50 粗飼料(%:玉米青貯飼料15.16 15.43 16.24 45.28 甜菜渣12.11 24.67 0.00 20.90奶牛能量單位 1.79 1.99 1.65 1.35 粗蛋白質(CP,%9.39 10.60 8.65 12.60粗纖維(CF,%23.69 21.44 26.61 19.80 鈣(Ca,%0.40 0.45 0.38 0.60磷(P,%0.38 0.41 0.36 0.44 30頭奶牛集中于一個雙式牛

13、舍中單槽飼養(yǎng),統(tǒng)一管理。預飼一周后進入試驗期,試驗從產前28天開始至產后56天結束。分娩前干物質攝入量控制到14kg/d。分娩后各組均按中國奶牛飼養(yǎng)標準(2000配制相同日糧,自由采食干草。整個試驗期每日分別于早6:00、中午12:00和晚7:00上槽一次,先飼喂干草和玉米青貯,后喂混合精料。1.2脂肪活體樣品的采集分別于產前14d及產后1d、14d、28d采用細針吸引技術采取尾部脂肪組織500-1000mg.用生理鹽水漂洗后裝入DEPC處理的塑料瓶存于液氮中保存待測。1.3主要試劑及儀器設備焦磷酸二乙酯(DEPC購自Sigma公司;反轉錄酶AMV、RNase Inhibitor、Oligo

14、dT、ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker2000購自Takara公司;Trizol RNA 提取試劑盒購自Invitrogen公司;瓊脂糖為Promega產品。氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑均為國產分析純。1.4儀器設備RNA/DNA calculator ,Pharmacia Biotech公司; PCR儀UNII 型,Biometra公司;可調式恒溫水浴箱、7930型高速冷凍臺式離心機,HITACH公司。1.5引物設計與PCR擴增根據(jù)Genebank中奶牛InsR基因和ß微球蛋白(ß-actin的mRNA序列,分別設計了擴增引物,胰島素受體的上游引

15、物:5'-AGGAGCTGGAGGAGTCCTCGTTCA-3',下游引物: 5'-CATTCCCCACGTCACCAAGGGCTC-3',擴增片段長度為147bp;ß-actin的上游引物: 5'-TCATCACCATCGGCAATGAG-3',下游引物:5'- CATCGTACTCCTGCTTGCTGA -3',擴增片段長度為351bp。1.6脂肪組織樣品總RNA的提取按Trizol試劑盒說明操作提取肝組織總RNA。總RNA作40倍稀釋后,采用Pharmacia Biotech公司的RNA/DNA calculato

16、r,在260 nm下測定RNA的濃度,選擇吸光度比值OD260 /OD280 nm1.9的總RNA,進行實驗。nm1.7脂肪組織樣品總RNA的 cDNA合成組織總RNA的cDNA合成按試劑盒說明操作。根據(jù)測定的RNA濃度調整總RNA的體積,使各組織樣品逆轉錄體系的RNA量相同。組織總RNA的逆轉錄反應體系為:總RNA 2g,Oligo(dT5l,5×RT Buffer 4l,dNTP Mixture 2l,RNase Inhibitor 0.5l,AMV 2l,加無菌水至20l;反應條件:70變性5min,0退火5min,42逆轉錄90min,90AMV 失活5min,0冷卻5min

17、。1.7 InsR mRNA的半定量RT-PCR檢測方法的建立取5 ul PCR產物在2.0%EB染色的瓊脂糖凝膠上電泳。對每種組織目的基因,設陰性對照。參照文獻1上介紹的方法鑒定擴增的目的片段的正確性1.7 3 RT-PCR方法檢測樣品InsR mRNA表達水平在本實驗中,IR目的基因進行了2036循環(huán)的PCR擴增,ß-actin內參基因進行1834循環(huán)的PCR擴增。為了保證PCR擴增在指數(shù)增長范圍內,InsR選擇30個循環(huán)擴增,ß-actin 選擇26個循環(huán)擴增。圖像處理及灰度分析用TANLON 凝膠圖象分析系統(tǒng)進行,根據(jù)InsR 和內參ß-actin PCR

18、 產物的灰度比值顯示新生犢牛各組織樣品InsR 基因表達水平的相對變化。數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計,差異顯著用ONE-WAY ANOV A 方差分析,進行Duncans LSD 檢驗。InsR mRNA 豐度與血清中胰島素(Ins 、胰高血糖素(GN、非酯化脂肪酸(NEFA的相關性用pearson 進行分析。2 結果與分析2.1 新生犢牛不同組織樣品總RNA 電泳結果 見圖1。 由圖1可見,提取的總RNA 有三條清晰的條帶。RNA A260/A280值均大于1.9,達到反轉錄要求。圖1 脂肪組織總RNA 電泳結果 28s18s5s2.2 InsR 和-actin PCR 擴增結果 見圖

19、2、圖3。 147bp351bp M 1 由圖2可見,擴增的目的片段大小為147bp ,與預期結果相符,測序結果顯示擴增片斷與InsR 基因同源性為95%,證明所擴增的片段為InsR 基因。圖3顯示:經(jīng)RT-PCR 擴增出351bp 片段的-actin基因,用-actin 對InsR 基因進行半定量監(jiān)測的結果。2.3 InsR 重組質粒的PCR 和雙酶切鑒定 見圖5、圖6。 147bp 圖5 InsR重組質粒PCR 鑒定 M: DL-2000 marker ;1: InsR 重組質粒PCR 鑒定 M 1 204 bpM 1圖6 InsR 重組質粒的雙酶切鑒定 M: DL-2000 marker

20、 ;1: InsR 重組質粒的雙酶切鑒定由圖5可見,InsR 重組質粒經(jīng)PCR 擴增出147bp 的片段。圖6顯示,InsR 重組質粒經(jīng)EcoR +Hind 雙酶切獲得204bp 的片段,與預期結果相符。2.4 InsR 和ß-actin 循環(huán)數(shù)的選擇 見圖7。 為保證PCR 擴增在指數(shù)增長范圍內進行,本試驗InsR 采用30個循環(huán),ß-actin 采用26個循環(huán)進行擴增。2.5 不同能量攝入奶牛脂肪組織InsR 基因 RTPCR 結果InsR 基因的內對照RTPCR 結果見圖2,統(tǒng)計分析結果見圖9、表2和表3。 M 1 2 3351bp147bp由圖8可見,不同能量組In

21、sR 基因均有PCR 擴增,達到RTPCR 要求。由圖9可見,InsR mRNA 相對表達量從產前14天至產后28天各組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,各組InsR mRNA 水平均在產后14天達到最大值,且產后均高于產前;產前低能組InsR mRNA 相對表達量低于高能組和正常組。表2 同一時期不同能量攝入圍產期奶牛脂肪組織InsR mRNA 豐度的比較(X ±SD ,n=8組 別 采樣時間I 組 II 組 III 組 產前14天0.4233±0.10926 0.4591±0.07389 0.3036±0.03878 產后1天0.6748±0.10

22、904 0.6231±0.05005 0.7585±0.10398 產后14天 0.7894±0.12654ABab 0.6916±0.08934Aa 0.9661±0.06110Bb產后 28 天 0.6219±0.07142 0.5650±0.03711 0.7521±0.16145 注：同一行標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05） ；標有不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01） 由表 2 可見，在產后 14 天低能組 InsR mRNA 豐度高于高能組（P<0.01） 。 表3 不同

23、時期同一能量攝入圍產期奶牛脂肪組織 InsR mRNA 豐度的比較( X±SD，n=8 采樣時間 產前 14 天 產后 1 天 產后 14 天 產后 28 天 組 I組 0.4233±0.10926Aa 0.6748±0.10904Bbc 0.7894±0.12654Bc 0.6219±0.07142ABb 別 II 組 0.4591±0.07389Aa 0.6231±0.05005ABb 0.6916±0.08934Bb 0.5650±0.03711ABab III 組 0.3036±0.03

24、878Aa 0.7585±0.10398Bb 0.9661±0.06110Bc 0.7521±0.16145Bb 注：同一列標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05） ；標有不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01） 由表 3 可見，產后 14 天三個能量組 InsR mRNA 豐度高于產前 14 天（P<0.01） 。 3 討論 眾所周知， InsR為細胞膜上的一種糖蛋白， 具有高度的特異性和親和力， 它在介導IGF-2 和胰島素信號方面發(fā)揮著重要的作用，從而調節(jié)動物新陳代謝活動2，具體途徑是：胰島素 和IGF-2 與InsR的a亞單位結合后，位于酪氨酸殘基的b亞單位自動磷酸化，信號通過酪氨酸 的磷酸化傳遞給胰島素受體底物-1（IRS-1） ，進而激活磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3-K）和胞外 信號調節(jié)激酶（ERK） ，影響多種細胞內信號通路。胞膜上受體數(shù)量一方面處于不斷合成與 降解的動態(tài)平衡中，另一方面又受各種生理或病理因素的影響而發(fā)生變化。 圍產期奶牛能量代謝特點是， 能量攝入減少而需求增加所致的能量負平衡。 奶牛能量負 平衡時，血糖降低，導致脂肪大量動員，脂肪動員是圍產期奶牛能量負平衡的必然結果。脂 肪分解一方面彌補糖異生作用降低所引起的能量虧欠；另一方面釋放大量NEFA進入血液及 肝臟，可引發(fā)脂肪肝和酮病。因此，這一時期