非創(chuàng)傷性預(yù)處理對大鼠缺血心肌保護(hù)效應(yīng)機(jī)制的探討

1、    非創(chuàng)傷性預(yù)處理對大鼠缺血心肌 保護(hù)效應(yīng)機(jī)制的探討        摘要目的：探討非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理對大鼠心肌保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。方法：用雄性SD大鼠36只，分對照、缺血再灌注、經(jīng)典缺血預(yù)處理及非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理4組。分別觀察以下指標(biāo)：血漿一氧化氮(NO)水平；心肌熱休克蛋白70(HSP70)mRNA表達(dá)；心肌5'-核苷酸酶(5'-NT)及過氧化氫酶(CAT)活性。結(jié)果：經(jīng)典及非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理后，血漿NO水平顯著高于缺血再灌注組和對照組

2、(P0.01)，心肌HSP 70 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，心肌5'-NT、CAT活性升高(P0.05， vs I/R)，而經(jīng)典及非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理兩組間上述指標(biāo)無顯著差異(P0.05)。結(jié)論：非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理保護(hù)心肌的機(jī)制可能與經(jīng)典缺血預(yù)處理相似，均是通過提高心肌內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)NO、HSP70 mRNA、CAT及5'-NT顯示預(yù)處理效應(yīng)。主題詞大鼠； 局部缺血； 再灌注中分類號Q463文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-4718(2000)09-0835-04 Study on protective mechanism of non-wounded ischemicpreco

3、nditioning on rat ischemia/reperfusion myocardiumLU Yan-zhen(Department of Pathophysiology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000， China)DONG Chuan-ren,LIUYong-ming,ZHANG You-yun,MA Chun-yan(Department of Pathophysiology,Hubei Medical University, Wuhan 430071, China) Abstract AIM:To investigate

4、probable protective mechanism of non-wounded legs ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion(I/R) myocardium. METHODS: 36 male SD rats, weighting (250±30) g,were divided into 4 groups.They are normal control(NC);I/R; classical ischemic preconditioning(C-IPC)and non-wounded legs ischemic p

5、reconditioning(N-WIPC). NO in plasm,expression of myocardial HSP 70 mRNA, the activities of 5'-NT and CAT of myocardium were observed in all groups. RESULTS:The level of NO in plasm significantly enhanced in groups C-IPC and N-WIPC compared with that in groups I/R and NC(P0.01),expression of myo

6、cardial HSP 70 mRNA was greatly increased in both C-IPC and N-WIPC groups, the activities of 5'-NT, CAT of myocardium were also raised in groups C-IPC and N-WIPC (P0.05 vs I/R),but there was no difference between C-IPC and N-WIPC(P0.05). CONCLUSION:The possible protective mechanism involved in N

7、-WIPC is similar to that in C-IPC, which is due to increase of endogenous myocardial protective substances.MeSHRats; Ischemia; Reperfusion 本室已證實(shí)，無論是非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理或是經(jīng)典心臟缺血預(yù)處理，均可獲得明顯縮小心肌梗塞范圍，改善心臟功能，減輕心肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及心肌酶漏出等預(yù)處理效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過監(jiān)測大鼠血漿一氧化氮(nitric oxide)含量，心肌5'-核苷酸酶(5'-nucleotidase)及過氧化氫酶(catalase)活

8、性和熱休克蛋白70(HSP70)mRNA表達(dá)的變化，旨在為探討這兩種預(yù)處理方式的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。材料和方法一、 動物模型復(fù)制與分組雄性SD大鼠，體重(250±30)g，用20烏拉坦(1 g*kg-1 ip)麻醉。氣管插管人工機(jī)械通氣。胸骨左緣第四肋間開胸，剪開心包，30絲線環(huán)左冠脈前降支距左心耳下緣2 mm處穿過。穩(wěn)定后，取心電正常者隨機(jī)分4組：(1)正常對照(NC)組,n=9,留線不結(jié)扎冠脈曠置50及120 min;(2)缺血再灌(I/R)組,n=9,結(jié)扎左冠脈前降支阻斷血流30min, 再灌注20及90min;(3)經(jīng)典缺血預(yù)處理(C-IPC)組,n=9,按經(jīng)典Murry法復(fù)制

9、，即結(jié)扎冠脈前降支5min,再灌注5min,反復(fù)4次。以后處理同I/R組;(4)非創(chuàng)傷性下肢缺血預(yù)處理(N-WIPC)組,n=9,麻醉后，以止血帶捆綁雙下肢至股動脈搏動不能觸及，阻斷血流5min后松開5min，反復(fù)4次。以后處理同I/R組。二、主要試劑NO試劑盒為南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程所產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA由上海第二軍醫(yī)大學(xué)宋亮年教授惠贈；Random標(biāo)記盒購自Promega公司；DAB及5'-NT分別為sigma和中科院上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品。三、觀測指標(biāo)(一) 血漿NO含量測定各組于再灌注20 min(NC組持續(xù)觀察50 min)，左頸總動脈取抗凝血液2 mL，以2 000×g

10、 離心10 min，分離血漿，以NO測試盒測定，按說明操作。(二) 心肌組織HSP 70 mRNA表達(dá)各組于再灌注90 min(NC組持續(xù)120 min)，速取左心室組織約100mg按酸性鹽酸胍-酚-氯仿一步法1 提取心肌總RNA。取30gRNA經(jīng)1瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。80烘干。質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHI、EcoRI雙酶切后，低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收2.3kb片段。用Random標(biāo)記盒進(jìn)行放射性標(biāo)記。按分子克隆第2版方法進(jìn)行Northern blot分析。(三) 心肌5'-NT、CAT活性測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后速取左心室結(jié)扎線下小塊組織，2多聚甲醛固定10 min左右，切片。按酶

11、組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2結(jié)果一、 心肌5'-NT活性變化 結(jié)果如表1示，I/R組酶活性最低(P0.05 vs NC組)，C-IPC、N-WIPC組酶活性明顯高于I/R組(P0.05)。GroupGrades of reactionTotal<"00 (311 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309184547561" 64 32>ABCDNC84 11 5 01000.5000±0.0577 I/R 24 3338 5 100 0.8200±0.0577 C-IPC 5533 92

12、100 0.6300±0.0577* N-WIPC7123 6 0 100 0.5600±0.0577*     P0.05 vs NC group；*P0.05 vs I/R group. 二、心肌CAT活性變化結(jié)果見表2，C-IPC、N-WIPC組酶活性明顯高于I/R組,I/R組酶活性低于NC組(P0.05)。 GroupGrades of reactionTotal<"00 (311 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309184547561" 6

13、4 32>ABCDNC 101163 0120 0.5000±0.0577 I/R353028 7100 0.7700±0.0577C-IPC 7512 9 4 100 0.5500±0.0577* N-WIPC 77 13 73 100 0.5400±0.0577*      P0.05 vs NC；?P0.05 vs I/R. 三、血漿NO變化 如表3示，I/R組血漿NO含量顯著低于NC組(P0.01)，提示I/R組血管內(nèi)皮嚴(yán)重受損；而C-IPC、N-WIPC組含量顯著高于I/R組(P0.01)，甚至高于

14、NC組(P0.01)，說明這兩種方法處理都使NO釋放增加，兩組比較無顯著差異(P0.05)。 表3血漿NO2-/NO3-含量的變化Tab 3 Changes of the content of NO2-/NO3-GroupNO-2/NO-3(mol/L) NC 23.38±3.33 I/R 11.59±3.16 C-IPC 42.80±15.00* N-WIPC 43.40±10.25*     P0.05,P0.01 vs NC； *P0.01 vs I/R. 四、心肌HSP 70 mRNA表達(dá)的變化Northo

15、rn雜交結(jié)果見1，C-IPC組、N-WIPC組HSP 70 mRNA表達(dá)明顯高于I/R組；I/R組輕度表達(dá)，而NC組無HSP 70 mRNA表達(dá)。    Fig 1Northern blot analysis of HSP 70 mRNA.NC group, no expression; I/R group, low-grade expression;C-IPC and N-WIPC groups; distinct expression.1心肌HSP 70 mRNA表達(dá)的Northern blot分析討論自發(fā)現(xiàn)IPC對心肌有保護(hù)作用以來，關(guān)于其機(jī)制已成

16、為研究熱點(diǎn)。目前已提出不少假說如應(yīng)激蛋白合成，NO、腺苷釋放，K+-ATP通道開放和PKC、5'-NT激活等，本實(shí)驗(yàn)著重觀測了NO、HSP 70 mRNA表達(dá)及心肌酶學(xué)改變與IPC的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)C-IPC組與N-WIPC組動物心肌5'-NT、CAT活性明顯增加(P0.05， vs I/R組),HSP70mRNA顯著表達(dá)，同時血漿NO水平也顯著增高(P0.01， vs I/R、NC組)。文獻(xiàn)報(bào)道,內(nèi)源性NO釋放,5'-NT、CAT活性增高是IPC機(jī)制的重要方面，HSP70是IPC重要的心肌內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)。在犬的IPC實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)3，IPC效應(yīng)是通過L-精氨酸:一氧化氮通路

17、所致。用NO合成抑制劑L-NAME可以取消IPC效應(yīng)。若分別用L-arg和SIN-1預(yù)處理可以明顯改善心肌的I/R損傷4。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP 70 mRNA表達(dá)在IPC時明顯增加，用actinomycin-D及cycloheximide分別阻斷了HSP70基因轉(zhuǎn)錄及翻譯，阻止HSP70合成，完全阻斷了對大鼠心肌的保護(hù)作用5。直接將HSP70基因轉(zhuǎn)錄入大鼠心肌細(xì)胞能顯著地增加其抗I/R損傷的能力6。Kitakaze等7報(bào)道PC能使犬5'-NT活性增加，當(dāng)加入5'-NT抑制物AOPCP后，該保護(hù)效應(yīng)消失。用polymyxin B和prazosin阻斷細(xì)胞外5'-NT的激活，

18、則IPC的保護(hù)作用也消失，說明5'-NT是IPC的機(jī)制之一。Currie等89。同時，雙下肢缺血再灌注過程中可以產(chǎn)生少量的氧自由基。少量氧自由基在預(yù)處理效應(yīng)中起著一定的作用10。通過兒茶酚胺類和/或氧自由基介導(dǎo)，調(diào)動心肌內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放而顯示IPC效應(yīng)。盧彥珍（長治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 山西 長治 046000）董傳仁（湖北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 湖北 武漢 430071）劉永明（湖北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 湖北 武漢 430071）張友云（湖北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 湖北 武漢 430071）馬春艷（湖北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 湖北 武漢 430071）參考文

19、獻(xiàn)1Chomzynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinuium thiocynate-phend-chloroform extractionJ. Anal Biochem,1987,162:156-159.2小川和郎，中根一穗，主編. 酶組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)M. 鐘慈聲主譯.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1989. 132-135. 3Vegh A,Szekers L, Parratt J. Preconditioning of the ischemic myocardium,involvement of

20、 the L-arginine nitric oxide pathwayJ.Br J Pharmacol,1992,107:648-652.4Richard V, Blanc T, Kaeffer N,et al. Myocardial and coronary endothelial protective effects of acetylcholine after myocardial ischemia and reperfusion in rats: role of nitric oxideJ. Br J Pharmacol,1995,115:1532-1538.5肖獻(xiàn)忠，王燕如，黃生寧，等.從熱休克基因表達(dá)探討心肌細(xì)胞對損傷的內(nèi)源性保護(hù)作用及機(jī)制J.中國病理生理雜志,1995,11:741-742.6Mestril R,Chi S,Sayen R,et al.Expression of inducible stress protein 70 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia-induced injuryJ. J Clin Invest,1994,93