創(chuàng)傷弧菌與嗜水氣單胞菌二聯(lián)外膜蛋白基因表達產(chǎn)物的免疫原性研究

1、創(chuàng)傷弧菌與嗜水氣單胞菌二聯(lián)外膜蛋白基因表達產(chǎn)物的免疫原性研究鰻鱺是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類,但大規(guī)模集約化的養(yǎng)殖方式使得鰻鱺病害發(fā)生日益頻繁,其中細菌性疾病是造成養(yǎng)殖鰻鱺重大損失的主要病原菌。細菌性疾病種類繁多,因而只針對單一菌種研制的鰻鱺亞單位疫苗常存在保護效率偏低、有效保護范圍有限等問題,難以在水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中推廣。在本課題組已有的研究基礎上,此次試驗選取病原性創(chuàng)傷弧菌和嗜水氣單胞菌作為代表菌株，通過基因提取試劑盒提取細菌基因組DNA參考GenBan順據(jù)庫中已提交的創(chuàng)傷弧菌和氣單胞菌外膜蛋白基因序列設計引物，PCR克隆獲得病原性創(chuàng)傷弧菌OmplK嗜水氣單胞菌II型孔蛋白的基因全長序列。經(jīng)序列分

2、析后選取外膜蛋白基因所表達的膜外多肽基因序列,通過融合PCR4接兩個外膜蛋白基因片段、構建表達載體(pGEX-2T-His-Vibrio-Aero)并進行高效表達;表達產(chǎn)物經(jīng)純化后免疫美洲鰻鱺,通過對溶菌酶含量、全血細胞刺激指數(shù)、血清抗體效價以及攻毒感染后免疫保護率的測定研究其免疫原性。研究方法與獲得的主要結果如下：1.據(jù)GeneBan順據(jù)庫已提交的創(chuàng)傷弧菌和嗜水氣單胞菌全長序列中外膜蛋白基因序列左右兩端設計引物,繼而利用已提取的基因組DNA真板進行創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因全長的擴增。測序100%正確后利用相關蛋白分析軟件對兩種外膜蛋白基因的親水性、免疫原性及其結構進行預測,在此基礎

3、上選取免疫原性與親水性均較好的基因序列。采用“兩步法”融合PCRK術對兩個外膜蛋白基因片段進行體外連接。依據(jù)表達載體(pGEX-2T-His)的限制性酶切位點序列,在已連接外膜蛋白基因兩端引入限制性酶切位點BamH和EcoRI,成功構建二聯(lián)外膜蛋白基因工程重組表達載體(pGEX-2T-His-Vibrio-Aero)。在大腸桿菌(BL21)濃度OD_600nm0.6-1.0時,采用1.0mMPTG誘導劑,16過夜誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)離心柱親和層析純化后獲得分子量82.2kD的高純度蛋白，蛋白經(jīng)透析復性后凍干成粉末狀，密封干燥保存。2.為研究重組外膜蛋

4、白的免疫原性,本研究將180尾美洲鰻鱺平均分為PBS對照組、二聯(lián)滅活菌苗免疫組和二聯(lián)表達外膜蛋白免疫組三個組,于免疫后14d、21d、28d和42d丁香油麻醉鰻鯽后斷尾采血并采集鰻鯽粘液、肝腎組織,通過測定這4個時間點鰻鱺全血細胞轉化、血清中特異性抗體水平和鰻鱺血清、體表粘液、肝臟和腎臟組織勻漿中的溶菌酶含量研究其免疫原性。于免疫后28d,嗜水氣單胞菌(2X10⁸cfu/尾)和創(chuàng)傷弧菌(5X10⁸cfu/尾)分別腹腔注射感染三組鰻鱺以檢測二聯(lián)外膜蛋白的免疫保護作用。結果表明,免疫后28d攻毒感染結果表明,創(chuàng)傷弧菌和嗜水氣單胞菌感染后二聯(lián)外膜蛋白組的鰻鱺存活率均從第1d開始顯著高于對照組,其對兩株菌的相對免疫保護率均為50%與PBS寸照組相比，外膜蛋白免疫組鰻鯽的全血細胞轉化水平在免疫后28d時顯著高于PBS且;抗體檢測結果表明，免疫后14d、21d、28d和42d,這4個時間點外膜蛋白免疫組的抗體效價均顯著高于對照組,于免疫后42d,外膜蛋白組抗體效價顯著高于滅活菌組;溶菌酶檢測結果表明,不同處理組不同時間段血清、粘液和肝腎組織懸液的溶菌酶含量存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。上述