SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE 一, 什么是 SDS 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一種陰離子去污劑 . 它在水溶液中以單體(monomer)和分子團(tuán)(micellae) 的混合形 式存在.SDS 的作用破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵 , 使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)?有的構(gòu)象,保證蛋白質(zhì)分子與 SDS 充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合 物.一 ,SDS-PAGE 勺基本原理( 一) 蛋白質(zhì)分子的解聚樣品介質(zhì)和聚丙

2、烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后 , 蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移 率主要取決于亞基分子量的大小 , 而電荷因素可以被忽略 .1,SDS 陰離子去污劑 變性劑 助溶性試劑 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵 分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)2, 強(qiáng)還原劑巰基乙醇(B-mercaptoethanal) 二硫蘇糖醇 (dithiothreitol,DTT) 使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂 .SDS 和還原劑的作用：(1) 分子被解聚或組成它們的多肽鍵(2) 氨基酸側(cè)鏈與 SDS 充分結(jié)合形成帶負(fù) 電荷的蛋白質(zhì)-SDS 膠束. 蛋白質(zhì)-SDS 膠束所帶的負(fù)電荷大大超 過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量 , 消除

3、了不同分子之間原有的電荷差異 .蛋白質(zhì)-SDS 膠束的特點(diǎn)(1) 形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒(2) 短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS 膠束基本上是相同的.(3) 長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比 .膠束在 SDS-PAG 系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響,而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度 , 即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小 .當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在 15KD-200KD 之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān) 系3,影響 SDS 電泳的關(guān)鍵因素 溶液中 SDS 單體濃度大多數(shù)蛋白質(zhì)與 SDS 結(jié)合的重量比為 1:1.4(2)樣品緩沖液的離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度的溶液中,SDS 單體才具有較高的平衡濃度.

4、(3)二硫鍵是否完全被還原當(dāng)二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚,SDS 才能定量地結(jié)合到亞基上 而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系 .( 二) 緩沖系統(tǒng)的選擇一般情況下,在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的 pH 范圍,凡不與 SDS 發(fā)生相互作用的緩沖 液都可以使用 , 但緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的 . 電泳緩沖液的種類 :1, 磷酸緩沖液2, Tris- 醋酸鈉緩沖系統(tǒng)3, 咪唑緩沖液系統(tǒng) : 比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低 , 電泳速 度要比后者快一倍 .4, 尿素系統(tǒng) :適用分子量低于 15KD 的蛋白樣品.5, Tris- 甘氨酸系統(tǒng) : 使用最多的緩沖液6, Tris

5、- 硼酸鹽緩沖液 : 測(cè)定糖蛋白的分子量( 三) 凝膠濃度的選擇由于 SDS 電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度,只取決于分子解聚后 SDS 蛋 白質(zhì)膠束的大小 , 因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率 . 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度 .( 四) 分子量測(cè)定1, 相對(duì)遷移率(Rf)Rf 即用每個(gè)帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的 . 測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的中央 .蛋白帶遷移距離Rf= 溴酚藍(lán)遷移距離蛋白帶遷移距離 固定前的凝膠長(zhǎng)度Rf= X 干燥后的凝膠長(zhǎng)度 溴酚藍(lán)遷移距離2, 作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo) ,Rf 為橫坐標(biāo)繪圖3, 通過(guò)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的 R

6、f 值, 便可在標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量二, 去污劑的選擇無(wú)離子去污劑 :Lubro W;Brij35, TweenTriton陽(yáng)離子去污劑 :cetyltrimethyl ammoniumbromide (CTAB)cetylpyyridinium (CPC)陰離子去污劑 :SDS deoxycholate三, 方法1, 分類(1) 根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同 還原 SDS 電泳非還原 SDS 電泳 帶有烷基化作用的還原 SDS 電泳(2) 根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同 連續(xù)電泳不連續(xù)電泳(3) 根據(jù)電泳的形式 圓盤電泳垂直電泳平板電泳水平電泳2, 操作(1)制備分離膠(2)制備積層膠 (

7、堆積膠 ) 分離膠聚合之后(3)加樣品樣品的處理在蛋白溶液中加入過(guò)量的 SDS 后,可引起以下的反應(yīng)： 蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽氫鍵斷裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折疊 ( 二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞 ), 并形成橢球形1還原 SDS 處理當(dāng)加入還原試劑 DTT 或B-二巰基乙醇后,蛋白質(zhì)被完全去折疊,只根據(jù)分子量 分離 .2帶有烷基化作用的還原 SDS 處理烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù) SH 基團(tuán),而得到窄的電泳帶.3非還原的 SDS 處理許多樣品,如生理體液,血清或尿素,一般只需用 1%SD 在 100C煮沸 3 分鐘,并 不需要加還原劑 , 此時(shí)二硫鍵不能被斷裂 , 蛋白并沒(méi)有完全被去折疊 .(4)電泳(5)固定(6)染色考馬斯亮藍(lán) (coomassie brilliant blue) R-250三苯基甲烷,紅藍(lán)色,每個(gè)分子含有兩個(gè) S03HB團(tuán),偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié) 合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上 . G-250二甲花青亮藍(lán) , 藍(lán)綠色.銀染色銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸銀 (銀離子)還原成金屬銀 , 以使銀顆粒沉積在蛋 白帶上 .(7)照相 , 凝膠干燥(8)定量測(cè)定3, 電泳過(guò)程中的不正?，F(xiàn)象(1) 微笑 現(xiàn)象指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形 , 說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻 , 中間部分冷卻不好 . (2) 皺眉現(xiàn)象由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的 , 特別是當(dāng)凝膠和玻