基因表達(dá)差異分析方法進(jìn)展

1、基因表達(dá)差異分析方法進(jìn)展關(guān)鍵詞：基因表達(dá)差異 高等真核生物的基因組一般具有80000100000個基因，而每一個細(xì)胞大約只表達(dá)其中的15%1?；蛟诓煌?xì)胞間及不同生長階段的選擇性表達(dá)決定了生命活動的多樣性，如發(fā)育與分化、衰老與死亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)控等。比較細(xì)胞間基因表達(dá)的差異為我們揭示生命活動的規(guī)律提供了依據(jù)。 由于真核細(xì)胞mRNA3端一般含有poly（a）尾，因此現(xiàn)有的方法基本上都是利用共同引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為對象研究基因表達(dá)的差異。1992年Liang等2建立了一種差異顯示反轉(zhuǎn)錄pCR法（differentialdisplayreversetrans

2、criptionPCR，dDRT-PCR），為檢測成批基因表達(dá)的差異開辟了新天地。迄今為止已出現(xiàn)了大量應(yīng)用該技術(shù)的研究報道3，4。然而，盡管應(yīng)用dDRT-PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進(jìn)之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)5；(2)假陽性率可以高達(dá)90%6；(3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。近年來，針對dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測差異表達(dá)基因的方法出現(xiàn)，現(xiàn)僅就這方面的進(jìn)展做一簡要介紹。 1.基因表達(dá)指紋（geneexpressionfingerprinting，gEF）：gEF技術(shù)使用生物素標(biāo)記的

3、引物bio-T13合成cDNA第一鏈，用dGTP對其進(jìn)行末端加尾，再以富含c的引物引發(fā)合成cDNA第二鏈。用限制性內(nèi)切酶消化雙鏈cDNA，以交聯(lián)有抗生物素蛋白的微球捕獲cDNA3端，以t4DNA連接酶連接同前述內(nèi)切酶相對應(yīng)的適配子，并以bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進(jìn)行特異的pCR擴(kuò)增，得到大量的特異cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標(biāo)記后，固定于微球上的cDNA片段經(jīng)過一系列酶切，產(chǎn)生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標(biāo)記末端的片段經(jīng)凝膠電泳后構(gòu)成mRNA指紋圖譜。通過分析不同細(xì)胞間的指紋圖譜就能得到差異表達(dá)的序列7。gEF技術(shù)所需的工作量較dDRT-PCR明顯減

4、少，由于用酶切反應(yīng)替代了條件不嚴(yán)格的pCR反應(yīng)，其重復(fù)性也較好，假陽性率低，并且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。gEF技術(shù)最大的缺點在于電泳技術(shù)的局限。由于它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經(jīng)過幾輪酶切之后常會得到10002000條電泳帶，而現(xiàn)有的pAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%30%的mRNA能夠被辨認(rèn)出來，因此得到的只能是高表達(dá)基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關(guān)某種細(xì)胞的基因表達(dá)譜，可能比較困難；采用雙向電泳技術(shù)可能會有所幫助8。 2基因表達(dá)系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression，sAGE）：s

5、AGE法的建立基于兩條理論。首先，一段來自某個轉(zhuǎn)錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有910個bp，就能夠特異地確認(rèn)該轉(zhuǎn)錄子。第二，對短片段標(biāo)簽的鏈接有利于在同一克隆中對多個標(biāo)簽測序。sAGE也是用生物素標(biāo)記的bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈cDNA，然后以限制酶（錨定酶）進(jìn)行酶切，捕獲cDNA3端。在此處產(chǎn)物被分為兩部分，分別與包含有iIS型內(nèi)切酶（標(biāo)簽酶）位點的a、b連接子相接。iIS型內(nèi)切酶的特點是作用位點處于識別位點之外。這樣經(jīng)過酶切，就有可能得到只有910bp的標(biāo)簽序列。每兩個標(biāo)簽的鈍端結(jié)合后成為pCR的模板，以基于a、b連接子的引物進(jìn)行pCR反應(yīng)的結(jié)果是得到了大量每條包含兩個不

6、同來源標(biāo)簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標(biāo)簽鏈接在一起（大約為每條包含數(shù)十個不同來源的標(biāo)簽），克隆至質(zhì)粒載體中后集中測序9，10。sAGE的最終結(jié)果是通過計算機(jī)統(tǒng)計得到的，根據(jù)某個標(biāo)簽出現(xiàn)頻率的高低來判斷并計算其所屬基因表達(dá)的豐度。對于在數(shù)據(jù)庫中找不到對應(yīng)序列的標(biāo)簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對cDNA文庫進(jìn)行篩選，以尋找新基因。sAGE可以檢測不同細(xì)胞間已知基因表達(dá)的具體差異，精確到每個細(xì)胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達(dá)譜，系統(tǒng)地分析基因表達(dá)的差異。它的缺點在于工作量非常大，有大量的測序及計算機(jī)分析任務(wù)；而且，對于尋

7、找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫是很不嚴(yán)格的，根據(jù)我們的經(jīng)驗，往往是假陽性結(jié)果居多。 3.cDNA3端限制酶切片段顯示（displayof3endrestrictionfragmentsofcDNAs）:cDNA3端rFD利用帶有“踵”結(jié)構(gòu)的錨定oligo(dT)引物合成cDNA第一鏈，以okayama和berg的置換法合成cDNA第二鏈，然后將雙鏈cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由a1和a2兩條寡核苷酸構(gòu)成，其序列與所用限制酶識別位點相符合，先將a2的5端磷酸化，再加入a1退火，就會形成一個y型結(jié)構(gòu)；把y型適配子與酶切后的cDNA片段相連接，以適配子及錨定引

8、物中所含序列為特異引物進(jìn)行pCR反應(yīng)，則只有cDNA3末端的一段被擴(kuò)增出來，這時的產(chǎn)物可用凝膠電泳表示出來構(gòu)成差異表達(dá)圖譜。對于每次切割6bp的限制酶來說，每種大概只能切割8%的cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有cDNA都顯示出來11。cDNA3端rFD與gEF的思路比較相似，由于它利用多種限制酶進(jìn)行酶切，因此不會象gEF因凝膠電泳分辨率不夠而漏掉信息。它的重復(fù)性較好，假陽性率低，尤其是對于已知基因，可以根據(jù)選擇內(nèi)切酶的作用位點確定該基因在凝膠電泳中的位置并判斷其含量，從而避免了進(jìn)一步的分析。對于精力有限的研究人員，這可能是個值得一試的方法。cDNA3端rFD方法也存在一些和d

9、DRT-PCR相類似的缺點，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時間對所得到的差異條帶進(jìn)一步分析。 4.分子指數(shù)的rNA指紋（rNAfingerprintingbymolecularindexing，mI）:MI是一種能夠較好地顯示mRNA中編碼序列的方法。它利用s型內(nèi)切酶的作用位點在識別位點之外可以形成一個4bp的突出端的特點，設(shè)計43共64種（最外側(cè)一個核苷酸隨機(jī)）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規(guī)方法合成雙鏈cDNA，用類限制酶進(jìn)行酶切后連接5端磷酸化的相應(yīng)適配子，再以s類內(nèi)切酶酶切后形成一個隨機(jī)的4bp突出端，用連接有生物素的64種適配子予以結(jié)合，可將這些限

10、制片段分為64類，用包被抗生物素蛋白的磁珠捕獲連接產(chǎn)物，就可以利用前后兩個適配子所攜帶的特異序列為引物進(jìn)行pCR擴(kuò)增反應(yīng)，凝膠電泳顯示表達(dá)差異12。由于擴(kuò)增的序列位于cDNA內(nèi)部，因此最后得到編碼序列的可能性很大，這是該方法最大的優(yōu)點。鑒于并不是所有cDNA都含有某一識別位點，故采用不同的內(nèi)切酶組合。理論上可以顯示所有的差異表達(dá)基因，但這樣一來工作量就變得十分巨大。因此，該方法只適合對樣本的快速分析和部分差異表達(dá)基因的研究；如果要對某種細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行全面的研究，可能還要采用其它的方法。 5.抑制性消減雜交（suppressionsubtractivehybridization，sSH）:S

11、SH方法源于代表性差異分析法（representationaldifferenceanalysis,RDA）。它原是一種研究基因組之間差異的以雜交為基礎(chǔ)的方法。diatchenko等13將“抑制性pCR”理論14與rDA相結(jié)合，建立了一種分離差異表達(dá)基因的新方法。sSH將需要檢測的細(xì)胞稱為“檢測子”，將對照細(xì)胞mRNA稱為“驅(qū)趕子”，把mRNA合成cDNA后，通過僅僅兩輪雜交和pCR過程，就能有效地分離到在檢測子中表達(dá)，而在驅(qū)趕子中不表達(dá)或表達(dá)豐度不同的mRNA（圖5）。通過sSH有可能得到某種細(xì)胞中相對其他組織的差異表達(dá)基因的全面信息，它較好地克服了其它方法中低豐度基因難以得到的問題，據(jù)稱對

12、低拷貝基因的富集可以達(dá)到10005000倍，因此可能發(fā)現(xiàn)一些用原有方法沒有檢測到的新基因。這方面已經(jīng)有人進(jìn)行了嘗試15，16，獲得了一些成果。sSH的不足之處在于它需要mRNA的量較大，檢測子和驅(qū)趕子都要達(dá)到2微克以上，這在某些情況下是非常難以做到的，因此目前有關(guān)sSH的報道基本上都以腫瘤細(xì)胞為研究對象。 基因表達(dá)差異的研究方法在dDRT-PCR出現(xiàn)之后又有了很大的發(fā)展，每種方法都各有自己的優(yōu)缺點，研究人員應(yīng)該根據(jù)自己的側(cè)重點選擇適合于自己的方法。目前真正能夠做到簡單、準(zhǔn)確、全面地揭示基因表達(dá)差異的方法仍在不斷探索之中，因此許多研究機(jī)構(gòu)仍采用dDRT-PCR來達(dá)到自己的目的，畢竟經(jīng)過最近數(shù)年的

13、完善，該技術(shù)在許多方面都有了一定的改進(jìn)，完成一般的研究項目已是綽綽有余。sSH作為一種基因表達(dá)差異研究的新方法，假陽性率低，所得到的結(jié)果也更加全面，因此，希望以不太復(fù)雜的方法全面揭示差異表達(dá)基因的研究者，可以嘗試一下這種方法。百事通 參考文獻(xiàn) 1fieldsC,AdamsMD,WhiteO,etal.Howmanygenesinthehumangenome?NatGenet,1994,7:345-346. 2liangP，pardeeAB.DifferentialdisplayofeukaryoticmessengerRNAbymeansofthepolymerasechainreaction

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