電離輻射相關低密度寡核苷酸基因芯片的制備

1、    作者：郭萬峰，王升啟，黃堅，郭國禎 【關鍵詞】  肺癌    Fabrication of lowdensity ionizing radiationrelated oligonucleotide microarray【Abstract】 AIM: To fabricate an oligonucleotide microarray applied to ionizing radiation. METHODS:  According to the genes reported previ

2、ously in radiation responses and their family genes or related genes, oligonucleotide microarray was designed. mRNA sequences of these genes were obtained from the GenBank. Specific probes were designed with Mprobe software and synthesized by AB18909 DNA synthesis system and spotted onto aldehydecoa

3、ted glass slides using Cartesian Pix sys 3000 spotter in our laboratory. Using this microarray, we identified genes showing altered expression in different radiosensitive lung cancer cell lines. To provide independent confirmation of microarray data, semiquantitative RTPCR was performed on four gene

4、s. RESULTS:  Lowdensity radiationrelated oligonucleotide microarray was fabricated successfully, which had 143 genes including 127 involved in stress response, cell cycle progression, DNA damage and repair, apoptosis and proliferation, together with 11 housekeeping genes and 3 luciferase g

5、enes as positive controls and 2 rice genes as negative controls. Eighteen differentially expressed genes were screened by this microarray. Four genes were detected by RTPCR, and the results were in accordance with those from the microarray data, even though the value for each mRNA level might be dif

6、ferent between the two measurements. CONCLUSION:  The radiationrelated oligonucleotide microarray can be used to investigate the differentially expressed genes in different radiosensitive cancer cells and provide a platform for radiation research.【Keywords】 microarray; ionizing radiation;

7、lung neoplasms; cell line, tumor【摘要】 目的: 構建一種適用于輻射研究領域的低密度寡核苷酸基因芯片. 方法: 根據(jù)以往的研究報告，篩選參與輻射生物效應的基因和相關基因，從GenBank獲取mRNA序列，使用Mprobe軟件設計特異的探針，構建低密度輻射相關的基因芯片.在不同輻射敏感性肺癌細胞系中對該芯片的靈敏度和特異性進行評價，并對一些差異表達基因進行RTPCR驗證，以確認芯片檢測結果的可信性. 結果: 構建出了輻射相關的寡核苷酸基因芯片,該芯片共含有143個基因,即127個輻射相關基因和16個對照基因.在不同輻射敏感性的A549和NCIH446細胞中，篩選出

8、18個差異表達基因.經(jīng)RTPCR對4個基因的驗證,結果與芯片資料較一致. 結論: 輻射相關低密度寡核苷酸基因芯片可以檢測不同輻射敏感性腫瘤細胞的差異表達基因, 為輻射領域的研究提供了一種技術平臺.【關鍵詞】 基因芯片；電離輻射； 肺癌;腫瘤細胞系0引言基因芯片技術作為一門新興的技術，具有高通量、微型化和自動化的特點,被廣泛應用于各種組織的表達譜分析1-2.近年來也逐漸被應用于檢測輻射誘導的相關基因3-5.然而，高密度芯片針對性不強，產(chǎn)生過于繁雜的實驗資料，不利于分析并且耗時費力，需要較多的資金，不是一般的實驗室所能進行的.我們系統(tǒng)的比較了不同技術平臺的基因芯片的優(yōu)缺點后6構建了一種適用于輻射研

9、究領域的低密度寡核苷酸基因芯片.1材料和方法1.1材料肺腺癌細胞A549和肺小細胞癌細胞NCIH446(本室保存). 60Co源由軍事醫(yī)學科學院提供. SuperScriptTM II逆轉錄酶(Invitrogen公司);Cy3dUTP/Cy5dUTP(Amersham公司);RNasin (Promega公司);dNTPs (Invitrogen公司); ImPromIITM逆轉錄系統(tǒng)(Promega公司);引物為實驗室自行合成（表1）.表1PCR引物（略）1.2方法1.2.1輻射相關基因的選擇及芯片設計根據(jù)輻射生物學效應和國內(nèi)外的相關文獻，選擇了部分與輻射效應相關的人類細胞凋亡基因、細胞周

10、期基因、DNA損傷修復基因、應激信號途徑基因作為候選基因.芯片質控采用定量陽性對照和定量內(nèi)標看家基因、陰性對照，對逆轉錄、雜交過程進行檢測和結果分析.芯片包括143個基因，其中含定量陽性對照熒光素酶基因3個基因，定量內(nèi)標看家基因11種（aldolase B,ribosomal protein S28,malate dehydrogenase 2, SDHC, 23 kd highly basic protein, ribosomal protein S9, tubulin, actin, ribosomal protein L32, GAPDH和ALB），陰性對照為兩種水稻EST序列（AU18

11、2426和AU182425）.1.2.2寡核苷酸芯片的制備從GenBank中查詢所有候選基因的mRNA序列，用大規(guī)模寡核苷酸探針設計軟件Mprobe進行探針設計7，探針長度為40nt，GC含量4555，自身無二級結構. BLAST分析，篩選出基因特異的寡核苷酸探針. 在AB18909 DNA合成儀上進行寡核苷酸的合成.采用標準亞磷酰氨化學方法,5或3氨基修飾用NMMTr6氨己基2氰乙基N,N 二異丙基亞磷酰氨(自制),在合成后的最后一步引入.合成完畢后濃氨水55脫保護/切割15 h,OPC柱純化.分光光度計DU640檢測寡核苷酸探針的濃度，用3×SSC稀釋成0.5 g/L.用Pix

12、sys 7500芯片制備儀將寡核苷酸點到醛基片上，放置過夜，晾干備用.1.2.3細胞培養(yǎng)及照射取本室保存的肺腺癌細胞系A549和肺小細胞癌NCIH446，培養(yǎng)于含有100 mL/L小牛血清和1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37，50 mL/L CO2的孵箱中進行培養(yǎng).60Co射線照射, 吸收劑量率為1.511.68 Gy/min.1.2.4肺癌細胞總RNA的提取和熒光標記cDNA的合成用Trizol（Invitrogen life technologies）試劑盒按說明書推薦的操作步驟提取細胞總RNA.用紫外分析和甲醛變性電泳，分析其

13、純度和完整性.然后進行逆轉錄熒光標記，兩種細胞的總RNA分別用不同的熒光（Cy3和Cy5）標記，具體方法為：總RNA 50 g，Oligo dT16 1.25 L，定量陽性對照熒光素酶體外轉錄mRNA 0.15 L，RNasin 0.2 L，混勻，70 溫育10 min，冰上冷卻.然后加入第一鏈5×Buffer 2.5 L，DTT 1.25 L，MixdNTP 0.5 L，Cy3/Cy5dUTP 0.5 L，RNasin 0.3 L，Superscript II 0.5 L，42水浴2 h.最后用NaOH 65處理3060 min，進行堿變性.乙醇沉淀標記的cDNA.1.2.5基因芯

14、片的雜交和洗滌按照13的比例將標記的cDNA與雜交液（500 mLL甲酰胺，5×Denhardt液，6×SSC，5 g/L SDS）混勻，將樣品加在基因芯片上，42雜交3 h.雜交完畢后，分別用1×SSC+2 g/L SDS，0.2×SSC和0.1×SSC洗滌5 min.1.2.6差異表達基因的檢測和分析用ScanArray 4000掃描芯片，用GenePix Pro4.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和歸一化處理. 使用看家基因和陽性對照對Cy3和Cy5掃描結果進行校正，以Cy5和Cy3的熒光強度值-背景值>400和Cy5/Cy3的比值>1.5

15、或1.5, 5S RNA條帶不明顯,證明獲得了高純度、高完整性的總RNA.2.2輻射相關基因芯片的雜交使用該芯片對A549和NCIH446細胞的樣本進行雜交，輻射相關基因芯片的雜交結果見圖1，芯片為286個點，143個基因，每個基因兩個點，13×11兩個陣列,左右重復. GenePix Pro4.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和歸一化分析，制作散點圖(圖2). 發(fā)現(xiàn)18個基因有明顯的改變，8個基因上調，10個基因下調（表2）.表2在A549和NCIH446細胞中差異表達基因的平均比率（略）2.3.1基因芯片的敏感性、特異性和重復性從雜交的芯片結果分析， 定量陽性對照6個點(圖1紅色方框)和看家基

16、因22個點（圖1藍色方框）均出現(xiàn)較強的信號，兩種陰性對照4個點（圖1綠色方框）均無信號.說明芯片的檢測結果敏感性和特異性是比較好的.芯片的陣列為左右對稱，從芯片左右兩個矩陣隨機選取部分探針對應點，比較其檢測信號強度差異.結果變異系數(shù)均小于15，說明芯片的重復性較好.2.3.2RTPCR驗證基因芯片結果的可信性提取A549和NCIH446細胞的總RNA，對4個基因（3個差異基因Bcl2， Cyclin B1，PKC和1個無明顯差異的基因p53）進行RTPCR分析，結果見圖3.其余基因的變化結果和芯片結果具有較好的一致性，盡管兩種方法檢測的RNA水平數(shù)值可能是不同的.3討論為了辨別與腫瘤輻射抗性相關的一些基因，需要建立一種篩選這些基因的方法.基因芯片為高通量檢測基因表達提供了一個強有力的工具，目前已被應用到電離輻射領域.但是，目前放射領域里還沒有一款適用于放射研究的基因芯片.針對輻射誘導的生物學效應，我們構建了輻射相關的寡核苷酸基因芯片，這種小型芯片去掉了眾多的干擾因素，有利于生物信息學分析，降低了成本，有利于廣泛的應用.電離輻射除了誘導核內(nèi)DNA損傷，也可誘導一些分子表達，激活信號傳導途徑.我們在回顧文獻、分析輻射誘導的生物學效應的基礎上，根據(jù)輻射調節(jié)基因和可能調節(jié)的基因，通過科