MAPK途徑在大鼠肝干細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用

1、MAPK途徑在大鼠肝干細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用        【摘要】  目的 探討ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AKT等信號途徑在HGF介導(dǎo)的肝干細(xì)胞增殖信號中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的相互聯(lián)系和作用機(jī)制。方法 通過western blotting 檢測ERK、 p38MAPK、Akt 信號分子及磷酸化蛋白的表達(dá);通過3H-TdR摻入DNA的方法來檢測細(xì)胞的增殖細(xì)胞。結(jié)果 在WB細(xì)胞,HGF確實(shí)能夠激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/AKT途徑。ERK途徑在HGF刺激 5min后發(fā)生磷酸化,并且完

2、全磷酸化發(fā)生在HGF作用15min,1h后逐漸消失。 Akt 也在HGF作用5min后發(fā)生磷酸化,15min后達(dá)到完全磷酸化并且持續(xù)至少2h。 P38 MAPK 途徑也在 5min后開始激活,在 30min后逐漸減少,持續(xù)大約3h;我們還發(fā)現(xiàn), 用MAPK抑制劑 U0126, SB23580 處理后能夠明顯減低HGF誘導(dǎo)的增殖效應(yīng), 但是用Ly294002處理阻斷PI3K/AKT途徑后則并不影響HGF誘導(dǎo)的增殖效應(yīng)。表明,ERK1/2、p38MAPK 途徑的激活參與HGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng),而PI3K/AKT途徑則并不參與HGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖調(diào)控。結(jié)論 在WB細(xì)胞,HGF能夠激活ERK、 p3

3、8MAPK、 PI3K/Akt等信號途徑。ERK1/2 和 p38MAPK 途徑的激活參與HGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng),而PI3K/AKT途徑則并不參與HGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖調(diào)控。     【關(guān)鍵詞】  肝干細(xì)胞; 細(xì)胞因子; 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)    【Abstract】  Objective  To study the role of MAPK and PI3K pathways in hepatocyte growth factor-mediated proliferation effect on WB F-344

4、 cell.  Methods  To determine effect of HGF on ERK, P38 MAPK,  and AKT phosphorylation. Cells were treated or not treated with the specific inhibitors before HGF (40 ng/ml) stimulation,  than the phosphorylation of ERK,  p38MAPK, Akt following HGF stimulation were analyzed b

5、y Western blotting;  To determine which pathway involved in HGF induced proliferation activity,  proliferation activity were analyzed by 3H thymidine incorporation.  Results  The ERK,  p38MAPK, Akt pathways were activated by HGF, and involved in mediating cellular proliferat

6、ion.  The proliferation effects of HGF were inhibited when MAPK pathway was abolished by the specific inhibitor U0126, but not inhibited when PI3K/AKT pathway was abolished by inhibitor Ly294002. It suggest that ERK, p38MAPK pathways are involved in  HGF-induced proliferation in WB cells.

7、But  PI3K/AKT pathways are not involved in HGF-induced proliferation.  Conclusion  HGF activated ERK, P38 MAPK, and PI3K/AKT pathways; ERK, p38MAPK pathways are involved in  HGF-induced proliferation in WB cells. But  PI3K/AKT pathways are not involved in HGF-induced prolife

8、ration.    【Key words】  hepatic stem cells; cell factor;signal conduction    MAPK是一族胞漿內(nèi)廣泛分布的蛋白激酶,包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular-signal Regulated Kinase, ERK)、P38-MAPK、c-JUN N端激酶(JNK)。在細(xì)胞的增殖、分化和生存中起著重要作用1,2 ,多種增殖和抗凋亡信號通過MAPK的激活進(jìn)行調(diào)控。它們參與細(xì)胞對各種信號的調(diào)節(jié),觸發(fā)級聯(lián)性活化,在不同的時(shí)間將信號傳導(dǎo)至不同的區(qū)

9、域,產(chǎn)生如增殖、分化或凋亡等多種生物效應(yīng)。    HGF是一種具有多種生物功能的細(xì)胞生存調(diào)節(jié)因子,能夠介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、離散及抗凋亡作用1,2。HGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過其受體C-met的酪氨酸磷酸化而激發(fā),HGF作用于c-met的-亞單位C末端多功能位點(diǎn),導(dǎo)致C-met和一些胞漿信號蛋白的相互作用,依次激活MAPK和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等信號途徑3,4。在大鼠肝干細(xì)胞系WB F344細(xì)胞,HGF能夠誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞增殖,然而HGF/met介導(dǎo)的信號系統(tǒng)在肝干細(xì)胞的傳導(dǎo)機(jī)制還不十分清楚。 &#

10、160;  HGF誘導(dǎo)的肝干細(xì)胞的增殖作用是否也通過MAPK途徑?這些信號途徑如何參與肝干細(xì)胞的增殖調(diào)控?為此,我們的研究將探討MAPK信號途徑在HGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)控。    1  材料與方法    1.1  主要試劑   肝細(xì)胞生長因子Hepatocytes Growth Factor(HGF),  購自 Sigma. 不同信號途徑的特異抑制劑均購自Promega 溶于 DMSO。 ERK 特異抑制劑U0126、 PI3K特異抑制劑Ly294002、 所用濃度均為

11、20M。 p38 MAPK 特異抑制劑 SB 203580,所用濃度為15M;ERK、p38MAPK,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體,ECL檢測系統(tǒng)均為Santa Cruz 產(chǎn)品 。     DMEM為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為Life Technologies 公司產(chǎn)品,胰酶為Gibco公司產(chǎn)品, PMSF為Sigma公司產(chǎn)品, PVDF膜為Amersham公司產(chǎn)品。    1.2  主要儀器及設(shè)備  細(xì)胞培養(yǎng)箱:Heraeus;超凈工作臺:北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠; 倒置顯微鏡:重慶光學(xué)儀器廠XDS-1;液

12、閃儀:蛋白電泳儀及電轉(zhuǎn)移裝置:BIO-RAD 美國;成像儀:Stratagen Eagleeye II: 美國;可見/紫外分光光度儀:Beckman;PM-30自動(dòng)照相系統(tǒng):Olympus; Kodak Scientific Imaging Systems  軟件分析系統(tǒng)。    1.3  細(xì)胞培養(yǎng)  大鼠WB-F344肝干細(xì)胞系,我所提供。    1.4  3H-TdR摻入DNA的方法來檢測細(xì)胞的增殖細(xì)胞  細(xì)胞用胰酶消化,稀釋細(xì)胞密度至50000細(xì)胞/ml,按每孔100l接種于96

13、孔細(xì)胞培養(yǎng)板,375%CO2下培養(yǎng)24h,在含0.5%血清的培養(yǎng)液中饑餓24h, WB細(xì)胞用或不用各種特異的抑制劑(U0126 20 M;SB203580 15M; Ly294002 20M)預(yù)處理,然后加入HGF(40ng/ml)刺激24h, 每孔加入1.85×104Bq3H-TdR, 3h后收集細(xì)胞,以液閃計(jì)數(shù)表示刺激活性。    1.5  Western Blotting    1.5.1  細(xì)胞蛋白提取  WB細(xì)胞在含0.5%血清的培養(yǎng)液中饑餓12h,然后用HGF(40ng/ml)刺激不

14、同時(shí)間(0、5、15、30、60、120min),收集細(xì)胞,用冰冷的PBS洗細(xì)胞3次,加入600l RIPA裂解液(2×106 細(xì)胞), 置于冰上作用30min, 用細(xì)胞刮取器刮下細(xì)胞, 4離心15000g離心,30min,上清即為總的細(xì)胞蛋白溶解成分。    1.5.2  比色法測定蛋白質(zhì)濃度  分別在5ml離心管中加入0.2mg/ml牛血清白蛋白0、 50、 100、 200、 300、 400、 500, 以去離子水補(bǔ)足至500l, 各管加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色液,振蕩混勻,測定A595, 取A595吸光值對標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度作圖;測

15、定待測樣品的A595,從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定其蛋白濃度。30g 蛋白等量上樣。    1.5.3  蛋白印跡  按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE,分離膠為10%;100轉(zhuǎn)膜(經(jīng)甲醇處理的PVDF膜),封閉1h, 用TBS-T洗一次5min, 置于兔抗鼠一抗 (用封閉液1:2000稀釋)中,搖床上緩慢搖動(dòng)1h,簡單地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min,置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗 (用封閉液1:5000稀釋)中,   搖床上緩慢搖動(dòng)1h,簡單地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次1

16、0min。用ECL系統(tǒng)進(jìn)行檢測,將A液與B液等體積混合,配成發(fā)光劑,均勻地涂在PVDF膜上,1min后吸去發(fā)光劑,用保鮮膜將PVDF膜包裹,X線片壓片,曝光20s5min, 顯影2min,定影5min。    2  結(jié)果    2.1  細(xì)胞因子對肝干細(xì)胞增殖的影響  我們用不同的細(xì)胞因子,以不同的濃度對WB細(xì)胞進(jìn)行作用,24h后,用H3-TDR摻入法檢測細(xì)胞因子對WB細(xì)胞體外生長的影響。發(fā)現(xiàn),HGF對WB-F344細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用,并具有劑量效應(yīng)正相關(guān)(見圖1)。注:縱坐標(biāo)為H3-TDR摻入CPM值

17、;橫坐標(biāo)為細(xì)胞因子劑量    2.2  HGF 刺激WB細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活   ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt等信號途徑可以被多種細(xì)胞生長因子激活, 參與介導(dǎo)細(xì)胞增殖、離散、抗凋亡及分化。在肝干細(xì)胞,HGF是否激活這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而參與細(xì)胞調(diào)控?為此我們將WB 細(xì)胞在含0.5%血清的培養(yǎng)液中饑餓 12h, 然后用 HGF (40ng/ml)刺激不同時(shí)間(0、5、15、30、60、120min),通過western blotting 檢測 ERK、 p38MAPK、 Akt 信號分子及磷酸化ERK、 p38MAPK

18、、 Akt(P-ERK,P-p38MAPK, P-Akt)。結(jié)果顯示(見圖2), 在WB細(xì)胞,HGF確實(shí)能夠激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt途徑。ERK 途徑在HGF刺激 5min后發(fā)生磷酸化,并且完全磷酸化發(fā)生在HGF作用15min,1h后逐漸消失。 Akt作為PI3K的下游靶蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)因子,參與細(xì)胞生存和凋亡的調(diào)控。 Akt 也在HGF作用5min后發(fā)生磷酸化, 15min后達(dá)到完全磷酸化并且持續(xù)至少2h。 P38 MAPK 途徑也在 5min后開始激活,在 30min后逐漸減少,持續(xù)大約 3h。    2.3  MAPK信

19、號途徑在肝干細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用  為明確MAPK途徑在HGF介導(dǎo)的WB F-344細(xì)胞增殖中的作用,我們用特異的抑制劑(U0126 20M;SB203580 15 M)預(yù)處理WB細(xì)胞,分別阻斷不同的信號途徑,再用HGF(40ng/ml)刺激,24h后用H3摻入法檢測細(xì)胞的增殖效應(yīng),發(fā)現(xiàn)用U0126、 SB203580 處理后能夠明顯減低HGF誘導(dǎo)的增殖效應(yīng),表明, ERK1/2和p38MAPK 途徑的激活參與HGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng)(見圖3)。    3  討論    細(xì)胞對于外界刺激的反應(yīng)是通過信號之間的相互作

20、用和交流進(jìn)行的。當(dāng)不同的信號進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞必須對多種信號進(jìn)行平衡調(diào)節(jié),最終作出一種適當(dāng)?shù)姆磻?yīng),如增殖、分化、生存或凋亡。蛋白激酶系列是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì),外界信號刺激后,可以觸發(fā)多種蛋白激酶的級聯(lián)活化,與各種信號相適應(yīng),傳遞并能夠放大信號,從而在不同的時(shí)間將信號傳導(dǎo)至不同的區(qū)域,維持不同的時(shí)間,并且產(chǎn)生多種及適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)方式5,6。     MAPK是一族胞漿內(nèi)廣泛分布的含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。哺乳動(dòng)物的MAPK家族包括ERK、JNK、P38-MAPK,由它們構(gòu)建了幾條基本的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:(1)Ras/ERK通路;(2)JNK/SAPK通路;(

21、3)P38-MAPK通路。MAPK途徑,是將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核,介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞信息傳遞的重要通路, MAPK介導(dǎo)細(xì)胞生長、分裂、凋亡以及細(xì)胞間功能等多種細(xì)胞生理過程7  。在生長因子及環(huán)境應(yīng)激的作用下,絲裂原激活蛋白激酶被激活后可以調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制與基因的表達(dá)。    研究表明MAPK的激活可能對決定細(xì)胞的命運(yùn)起重要作用,比如細(xì)胞的生存、分化和凋亡8。炎性因子TNF及各種刺激誘導(dǎo)的JNK和(或)P38途徑的早期短暫激活和晚期持續(xù)激活分別與細(xì)胞的生存、分化及凋亡相關(guān)。    在我們的研討中發(fā)現(xiàn),HGF可以激活E

22、RK、 p38MAPK 途徑, ERK 途徑在HGF刺激 5min后活化, 在15min時(shí)發(fā)生完全磷酸化,1h后逐漸消失。P38 MAPK 途徑也在 5min后發(fā)生磷酸化激活,在 30min達(dá)到高峰,持續(xù)大約 3h。 我們進(jìn)一步用U0126,SB203580特異地阻斷ERK及p38-MAPK途徑,再觀察HGF介導(dǎo)的增殖作用。發(fā)現(xiàn),U0126,SB203580處理后能夠明顯減低HGF誘導(dǎo)的增殖效應(yīng),表明,ERK1/2 and p38MAPK 途徑的激活參與了HGF介導(dǎo)的WB細(xì)胞的增殖調(diào)控。    總之,這些結(jié)果表明,在WBF-344細(xì)胞,HGF可以激活ERK、p38

23、MAPK途徑;ERK、p38MAPK途徑參與HGF介導(dǎo)的WB 細(xì)胞在增殖調(diào)控;由于ERK、p38MAPK途徑介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理生化功能9,10,因而,在體內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)中的作用十分復(fù)雜,與細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有著密切的聯(lián)系,這些信號間的復(fù)雜關(guān)系及相互作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。    【參考文獻(xiàn)】    1 Bliska JB. Yersinia inhibits host signaling by acetylating MAPK kinases. ACS Chem Biol,2006,1(6):349-351.&#

24、160;   2 Wang Z, Yang H, Tachado SD,et al. Phosphatase-mediated crosstalk control of ERK and p38 MAPK signaling in corneal epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006,47(12):5267-5275.     3 Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced sign

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