HPLC法測定注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)

1、HPLC法測定注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)    【摘要】  改進HPLC測定注射用頭孢噻肟鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法。在美國藥典和歐洲藥典(英國藥典)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了兩種不同流動相系統(tǒng)，用梯度洗脫對注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)進行了分離。結(jié)果樣品中各成分的分離度及檢出靈敏度完全滿足有關(guān)物質(zhì)限度的測定要求。改進后的RP?HPLC方法能更加真實有效的反映注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)含量，可有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】  頭孢噻肟鈉； 有關(guān)物質(zhì)； 高效液相色譜法    ABSTRACT  To impro

2、ve the method for determination of related substances of cefotaxime sodium for injection. On the basis of USP and EP (BP) methods, different mobile phase systems were optimized. Gradient elution was applied on the separation of cefotaxime sodium and its related substances. The resolution and sensiti

3、vity of related substances were acceptable. The detection limit was 100ng. This method was found to be simple and selective. It could be used to control the quality of product effectively.    KEY WORDS  Cefotaxime sodium;  Related substances;  HPLC    注射用

4、頭孢噻肟鈉(cefotaxime sodium)為第三代頭孢菌素，抗菌譜廣，抗菌活性強，臨床應(yīng)用廣泛1，2。中國藥典1995年版采用微生物檢定法測定頭孢噻肟鈉的含量，2000年版修訂為HPLC法，但直到2005年版仍未對有關(guān)物質(zhì)進行要求。美國、歐洲和英國35等各國藥典對注射用頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)的測定方法均有收載，且在歐洲藥典中已確證頭孢噻肟鈉中可能存在4個雜質(zhì)，國內(nèi)尚未見有報道。為完善我國藥典收載的質(zhì)量標準，本文借鑒美國藥典、歐洲藥典和英國藥典的方法，建立切實可行的控制頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)的方法。    1  儀器與試藥   

5、 1.1  儀器    島津10A高效液相色譜儀(LC?10ATvp高壓泵，SIL?10ADvp進樣器，SPD?M10A PDA檢測器，DGU?14A在線脫氣機)；Milli?Q純水機(Millipore公司)。1.2  藥品與試藥    注射用頭孢噻肟鈉(批號0406132)由哈藥集團三精制藥有限公司提供；注射用頭孢噻肟鈉(批號050103)由浙江亞太藥業(yè)股份有限公司提供；注射用頭孢噻肟鈉(批號050321025)由蘇州東瑞制藥有限公司提供。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。   

6、2  方法與結(jié)果    2.1  色譜條件    色譜柱為Hypersil Gold(250mm×4.6mm，5m)；檢測波長235nm；流速1.0ml/min；進樣體積10l。    流動相I(梯度洗脫)  流動相A為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液甲醇(8614)；流動相B為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液甲醇(6040)。    0.05mol/L磷酸鹽緩沖液的配制  取7.1g磷酸氫二鈉至1000ml量瓶中，加水溶解至接近

7、刻度，用磷酸調(diào)節(jié)溶液pH至6.25，加水定容至1000ml)，梯度洗脫程序見表1。    流動相II(等度洗脫)  流動相為磷酸鹽緩沖鹽甲醇(8515)。    磷酸鹽緩沖液的配制  3.5g磷酸二氫鉀和11.6g磷酸氫二鈉至1000ml量瓶中，加水溶解至接近刻度，調(diào)pH至7.0，加水定容至1000ml。    2.2  樣品溶液的配制    取頭孢噻肟鈉40mg至50ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。   

8、; 2.3  流動相I與流動相II的比較    (1)分離效果的比較  流動相I  流動相I系統(tǒng)為美國藥典分析頭孢噻肟鈉采用的系統(tǒng)。完全按照流動相I的梯度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)主峰與前后相鄰的雜質(zhì)不能很好的分離。針對分離情況，將梯度洗脫程序進行相應(yīng)調(diào)整后，調(diào)整后的洗脫程序如表2所示。結(jié)果分離效果較好，主要分離出樣品中含有的12個雜質(zhì)(圖1)。    流動相II為歐洲藥典(英國藥典)在分析頭孢噻肟鈉采用的系統(tǒng)。完全按照流動相II的等度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)主峰前分離出的雜質(zhì)個數(shù)與流動相I的相同，但是主峰后的雜質(zhì)在1h之內(nèi)沒

9、有出峰。為了縮短分析時間，將主成分出峰后改為梯度洗脫，樣品色譜圖顯示45min之內(nèi)可以將主峰后的雜質(zhì)完全洗脫，洗脫程序如表3所示，但是色譜基線漂移比較嚴重(圖2)。    (2)最低檢出限的比較  兩種流動相在同一根色譜柱上得出的頭孢噻肟鈉的最低檢出限(以S/N=3表1    流動相I梯度洗脫程序 計)基本一致，為100ng。    2.4  兩種流動相比較結(jié)果小結(jié)    通過對流動相I和流動相II在同一根色譜柱上分離效果及最低檢出限的比較，發(fā)現(xiàn)對流動相比

10、例作適當調(diào)整后，流動相I和流動相II均能檢出相同數(shù)量的雜質(zhì)，分離效果均較好，但是流動相II為等度洗脫，主成分后雜質(zhì)的酯溶性較強，若維持原流動相中有機比例不變，主成分后雜質(zhì)在1h內(nèi)不能出峰，將主成分出峰后改為梯度洗脫，增加流動相中有機溶劑的比例，可將主峰后雜質(zhì)洗脫，但是相對于流動相I，調(diào)整后流動相II的基線漂移幅度較大，且梯度洗脫的流動相為純水相和純有機相，而流動相I中兩相流動相A和流動相B均為加有不同有機溶劑比例的混合相，有利于色譜條件的穩(wěn)定，同時兩種方法的最低檢出限基本一致，所以最終采用流動相I的洗脫方法進行粗放性考察。    2.5  系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

11、溶液的選擇    美國藥典中系統(tǒng)適應(yīng)性實驗溶液配制  取1ml對照品溶液加7ml水和2ml甲醇，加25mg碳酸鈉固體混合溶解，室溫放置10min，加3滴冰乙酸，1ml對照品溶液，混合均勻。    歐洲藥典(英國藥典)中系統(tǒng)適應(yīng)性實驗的溶液配制  取4.0ml樣品溶液加入1.0ml稀鹽酸溶液，40加熱2h，加5.0ml pH6.6的緩沖溶液，1.0ml稀氫氧化鈉溶液。百事通    美國藥典中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液是頭孢噻肟鈉的堿破壞溶液，而歐洲藥典(英國藥典)中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液是頭孢噻肟鈉的酸

12、破壞溶液。從色譜圖可以看出，美國藥典中的系統(tǒng)適應(yīng)性實驗主要產(chǎn)生一個雜質(zhì)(雜質(zhì)1)，產(chǎn)生的雜質(zhì)數(shù)目較少，而歐洲藥典(英國藥典)中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，產(chǎn)生的雜質(zhì)較多，不僅產(chǎn)生雜質(zhì)1，而且還產(chǎn)生明顯的雜質(zhì)2、雜質(zhì)3和雜質(zhì)4。從樣品的色譜圖可以看出，雜質(zhì)1在多數(shù)樣品中是最大雜質(zhì)，而且樣品中也存在與雜質(zhì)1相鄰的雜質(zhì)2，與主峰相鄰的雜質(zhì)4在樣品中也存在，兩對雜質(zhì)的分離效果是確定色譜條件的關(guān)鍵，因此雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的分離度以及雜質(zhì)4和主峰的分離效果可以充分體現(xiàn)色譜系統(tǒng)的分離效果。所以，采用歐洲藥典(英國藥典)中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液更能保證色譜條件的分離效果(圖3)。    2.6

13、60; 方法的粗放性考察    采用另外兩根B型色譜柱和一根A型色譜柱對方法進行粗放性考察。結(jié)果顯示兩種類型色譜柱的分離效果均較好，但是B型色譜柱的色譜峰對稱性較好(拖尾因子小于1.2)，不拖尾；而A型色譜柱的色譜峰有明顯拖尾(拖尾因子大于1.5)，所以優(yōu)先選擇B型色譜柱(圖4)。    2.7  三批樣品的測定結(jié)果    對三批實際樣品， 采用Hypersil Gold(250mm×    圖3    系統(tǒng)適應(yīng)性溶液及樣品溶

14、液的HPLC色譜圖圖4    系統(tǒng)適應(yīng)性溶液在不同類型色譜柱上的HPLC色譜圖    4.6mm，5m)色譜柱進行有關(guān)物質(zhì)測定，計算方法采用1%對照品對照法，結(jié)果見表4。    3  討論    3.1  色譜柱的選擇性6    A型色譜柱  早期色譜柱，無定型或球形硅膠，與B型相比，硅膠純度較低，重金屬含量較高，鍵合密度較低，碳載量較低，未采用封尾技術(shù)或不完全封尾技術(shù)，硅羥基活性較高，殘留硅羥基導(dǎo)致的“第二效應(yīng)”較

15、強，能與堿性(含N原子)化合物、酸性化合物發(fā)生氫鍵和離子交換作用，造成色譜峰拖尾，但對于某些極性化合物，硅羥基是組分分離的主要因素。    B型色譜柱  球型高純硅膠，重金屬含量相對較低，鍵合密度較高，碳載量較高，采用非極性基團封尾技術(shù)(短碳鏈烷基)或其它技術(shù)，使硅羥基活性較低，能改善堿性(含N原子)化合物、酸性化合物的分離。    試驗結(jié)果也充分證明B型色譜柱色譜峰的拖尾因子要明顯小于A型色譜柱的色譜峰。    3.2  系統(tǒng)適應(yīng)性實驗及梯度洗脫比例的調(diào)整  &#

16、160; 采用歐洲藥典(英國藥典)的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，在調(diào)整后的USP色譜系統(tǒng)的HPLC色譜圖中雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的分離度以及雜質(zhì)4和主峰的分離情況可以充分體現(xiàn)出色譜系統(tǒng)的分離效果。采用不同色譜柱進行方法粗放性試驗，發(fā)現(xiàn)有些色譜柱需要對梯度洗脫的表4  三批注射用頭孢噻肟鈉樣品的有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果 程序表進行一些必要的調(diào)整才能達到比較好的分離效果。在對色譜條件的梯度洗脫程序進行調(diào)整時，需要確保雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的分離度在1.0以上，雜質(zhì)4和主成分的分離度在1.5以上，以保證色譜的分離能力；此外，根據(jù)文獻7，應(yīng)在頭孢噻肟主峰出峰結(jié)束時再改換梯度洗脫。    3.3&#

17、160; 有關(guān)物質(zhì)的限度    美國藥典、歐洲藥典(英國藥典)對注射用頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)含量的計算方法均是采用1%對照品對照法，但是限度的規(guī)定卻不是一致的。美國藥典規(guī)定單個雜質(zhì)不得超過6.0%，總雜質(zhì)不得過10.0%；歐洲藥典(英國藥典)規(guī)定單個雜質(zhì)不得過1.0%，總雜質(zhì)不得過4.0%。三批樣品均符合規(guī)定，提示有關(guān)物質(zhì)的限度以歐洲藥典(英國藥典)為準更為妥當。    4  結(jié)論    通過對美國藥典、歐洲藥典(英國藥典)中頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)測定方法的比較，得出美國藥典中色譜方法的分離效果和色譜穩(wěn)

18、定性等方面均優(yōu)于歐洲藥典(英國藥典)的方法。對美國藥典方法的粗放性考察，結(jié)果顯示應(yīng)優(yōu)先選擇B型色譜柱。色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性溶液采用歐洲藥典(英國藥典)方法中的酸破壞溶液，以保證色譜條件的分離效果。有關(guān)物質(zhì)的限度，從本文三批樣品的測定結(jié)果來看，采用歐洲藥典(英國藥典)中規(guī)定的限度更適合?！緟⒖嘉墨I】  1 霍天鳳，周棟梁. HPLC測定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉的含量及有關(guān)物質(zhì)J. 華西藥學(xué)雜志，2005，20(3)：249251.2 陳吉生. 反相高效液相色譜法測定頭孢噻肟鈉的含量J. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20(6)：341342.3 The United States Pharmacopoeial Convention Inc. The United States Pharmacopoeia XXIX S. Rochville MD: the United States Pharmacopoeial Convention Inc., 2006:422.4 European Directorate for the Quality of Medicine. The European Pharmacopoeia 5.0 S. Strasbourg, France: the Directora