專題講座資料（2021-2022年）復(fù)習(xí)題3細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、第三章復(fù)習(xí)題：基本概念：1.分辨率resoving power ：指人眼或顯微鏡在25cm明視距離處，能分辨被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)最小距離的能力，其單位為長度單位，常用的有毫米、微米、納米等。2.冰凍蝕刻freeze etching電子顯微鏡技術(shù)：是為配合透射電鏡觀察而設(shè)計的一種標(biāo)本制作技術(shù)。其原理及過程是用快速低溫冷凍法將樣品迅速冷凍，然后在低溫下進(jìn)行斷裂。這時，樣品往往從其結(jié)構(gòu)相對脆弱的部位（膜脂雙分子層的疏水端）斷裂，從而顯示出鑲嵌在膜脂中蛋白質(zhì)顆粒。由于冰在真空中少量升華，可進(jìn)一步增強(qiáng)浮雕式的蝕刻效果。用鉑、金等金屬進(jìn)行傾斜噴鍍，以形成對應(yīng)于凹凸的電子反差，在經(jīng)碳垂直于斷面進(jìn)行真空噴鍍形成一

2、個連續(xù)的碳膜，然后，用消化液把贗品本身消化掉，將剩下的碳膜及其構(gòu)成圖形的金屬微粒移到載網(wǎng)上用電鏡進(jìn)行觀察。冰凍蝕刻技術(shù)主要用于觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)，圖形富有立體感，樣品不需包埋甚至也不需固定，同時能更好地保持樣品的真實結(jié)構(gòu)。它是研究生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一種有用技術(shù)。3.細(xì)胞化學(xué)法：是一類經(jīng)典的細(xì)胞生物學(xué)實驗方法，其特點是不依賴經(jīng)驗染色技術(shù)，而是基于已有的化學(xué)反應(yīng)，在細(xì)胞原位上顯示出細(xì)胞的化學(xué)成分以及在不同條件下的形態(tài)、成分和功能的綜合變化，將結(jié)構(gòu)和機(jī)能更緊密地聯(lián)系在一起。為了能在完好的結(jié)構(gòu)上同時顯示其化學(xué)物質(zhì)，細(xì)胞化學(xué)技術(shù)必須滿足下列要求：保持細(xì)胞在生活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)；保持細(xì)胞內(nèi)的生

3、前化學(xué)成分及酶活性；進(jìn)行的方法是已知的化學(xué)反應(yīng)；具有高度特異性；反應(yīng)產(chǎn)物是一種有色物質(zhì)，能形成穩(wěn)定的沉淀，定位精確，或者電子密度高以供電子顯微鏡觀察用。4.Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。這種反應(yīng)通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)：可以特定顯示DNA的分布，酸水解可以去除RNA，并去除DNA上嘌呤脫氧核糖核酸上的嘌呤，使脫氧核糖核酸的醛基曝露，自由的醛基與Schiff反應(yīng)呈紫紅色 ）。5.顯微放射自顯影microautoradiography ：是將放射性分子引入機(jī)體或細(xì)胞,使其滲入生物大分子,或結(jié)合于一定部位.在利用放射性同位素的電離輻射

4、對乳膠的感光作用顯示樣品中放射物質(zhì)的所在.由此指示某種生物大分子質(zhì)合成及部位,或特定物質(zhì)的定位.放射自顯影術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等，其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)

5、行定位或相對定量測定。6.電子顯微鏡三維重構(gòu)技術(shù):是電子顯微術(shù)電子衍射與計算機(jī)圖像處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù).尤其適用于分析難以形成三維晶體的膜蛋白以及病毒和蛋白質(zhì)核酸復(fù)合物等大的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu).其基本步驟是對生物樣品在電鏡中不同傾角下進(jìn)行拍照,得到一系列電子顯微鏡圖片后在經(jīng)傅立葉變換等處理,從而展現(xiàn)出大分子及其復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的電子密度圖.7.密度梯度離心 density gradient centrifugation:是細(xì)胞組分通過某些梯度密度溶液離心使得各個成分互相分開的技術(shù).操作時應(yīng)將要分離細(xì)胞組分小心地鋪在含有密度不斷增加的、形成密度梯度的高溶解性的惰性物質(zhì)（如蔗

6、糖）溶液的表面。在這種條件下進(jìn)行離心，不同組分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉淀帶，而使不同的組分得以分離。8.差速離心differential centrifugation:是利用不同速度離心所產(chǎn)生的不同離心力將各亞細(xì)胞組分或各種顆粒分次沉淀的分離技術(shù)。8.熒光原位雜交 fluorescent in situ hybridization,FISH：是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將熒光探針注入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，通過觀察熒光標(biāo)記物的雜交位置來定位染色體或其他結(jié)構(gòu)的標(biāo)記技術(shù)。根據(jù)所用探針種類和要檢測核酸的不同可分為DNA-DNA、 RNA DNA、RNA-RNA雜交。無論哪一種雜交，其基

7、本程序都是適當(dāng)處理是細(xì)胞通透性增加，探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交、洗脫等步驟。9.細(xì)胞株cell strain和細(xì)胞系cell line:原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞生長出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，但有極少數(shù)細(xì)胞可渡過危機(jī)而存活下去。這些存活的細(xì)胞一般可順利地傳4050代次，并且仍然保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為。很多學(xué)者把這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株。一般情況下，當(dāng)細(xì)胞株傳至50代后又要出現(xiàn)危機(jī)，不能再傳下去。但如有部分細(xì)胞發(fā)生了遺傳突變，產(chǎn)生癌細(xì)胞的特點，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。細(xì)胞系細(xì)胞的根本特點是染色體明顯改變，一

8、般呈現(xiàn)亞二倍體或非整倍體，失去接觸抑制的細(xì)胞容易傳代培養(yǎng)。10.原代細(xì)胞培養(yǎng)：是指直接從有機(jī)體中取得細(xì)胞或組織后立即進(jìn)行的培養(yǎng)，嚴(yán)格的說是指成功繼代之前的培養(yǎng)，此時細(xì)胞保持原有的基本性質(zhì)，通常把第一代到第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為元代細(xì)胞培養(yǎng)。11.核酸的雜交：通過互補(bǔ)的DNA或RNA探針與研究的DNA或RNA之間進(jìn)行堿基配對，分離或鑒定特異的核酸片斷。也可用于比較兩個核酸之間的相似性。12.顯微操作技術(shù)（micromanipulation technique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器（micrcmanipulator）進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射

9、針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置。13.分子雜交技術(shù)（molecular hybridization）是在研究DNA分子復(fù)性變化基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其原理是，具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。14.細(xì)胞融合:真核細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cell fusion）.基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體（homokaryon）；來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體（heterok

10、aryon）。15、核酸的雜交：通過互補(bǔ)的DNA或RNA探針與研究的DNA或RNA之間進(jìn)行堿基配對，分離或鑒定特異的核酸片斷。也可用于比較兩個核酸之間的相似性。問答題：1.簡述細(xì)胞生物學(xué)的主要研究方法？代表細(xì)胞生物學(xué)傳統(tǒng)和發(fā)展方向的研究方法，可以分為四大方面。（1）顯微技術(shù)，這是進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的方法，包括光學(xué)顯微術(shù)、電子顯微術(shù)和掃描隧道顯微術(shù)等，目前的分辨本領(lǐng)已達(dá)到0.1nm的水平，可以直接觀察到DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子及生物膜、病毒等結(jié)構(gòu)。（2）細(xì)胞組分的分析與原為檢測技術(shù)，這類方法可對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大分子進(jìn)行分離和純化，并可在細(xì)胞的原位上檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和某些大分子的存在狀

11、況；（3）細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞工程技術(shù)，這是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)研究和生物工程中重要的實驗技術(shù)，具有廣泛的、重要的理論意義和實踐價值；（4）分子生物學(xué)技術(shù)，如核酸和蛋白成分的分析和序列測定；核酸的雜交、PCR、基因的克隆與表達(dá)以及基因的剔除、RNA干擾技術(shù)等，這些都是當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)研究中常常使用的實驗方法。而且一些物理、化學(xué)和信息處理技術(shù)也正在被用于細(xì)胞生物學(xué)的研究。現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的方法及其多樣和處于不斷的發(fā)展當(dāng)中。2.簡述動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的過程。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是一項復(fù)雜而且涉及內(nèi)容廣泛的技術(shù)，其制作過程如下：（1）克隆目的基因；（2）給目的基因接上適當(dāng)?shù)膯幼釉?；?）外源基因的導(dǎo)入，即

12、利用顯微操作或其他方法將外源基因注射到動物早期胚胎中，再把胚胎植入動物子宮內(nèi)；（4）外源基因整合與表達(dá)的檢測。轉(zhuǎn)入基因一般是隨機(jī)整合到宿主動物基因組，但并非所有的外源基因都能整合到動物基因組，而整合的基因也并非都能表達(dá)。因此需要對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行嚴(yán)格的檢測和篩選。在轉(zhuǎn)基因動物制作中，基因轉(zhuǎn)移是影響外源基因整合效率的關(guān)鍵步驟，也是技術(shù)難度最大的步驟。3.在進(jìn)行細(xì)胞組分的分離時，實驗方案設(shè)計的一般原則是什么？根據(jù)不同的細(xì)胞器或分子具有不同的體積與密度，通過離心力場的作用加以分離。根據(jù)這兩個主要因素可設(shè)計不同的離心方法：速度離心、等密度離心等。4匹配題：從下列20種方法中挑選一種最佳方法來探測下面的1

13、0個問題。a. 電子顯微鏡三維成像與X射線衍射及核磁共振技術(shù)； b. southern 雜交；c.掃描電鏡技術(shù)；d.細(xì)胞顯微分光光度法；e.免疫熒光技術(shù)；f.電子顯微鏡超薄技術(shù)；g.Northern雜交；h.放射自顯影技術(shù)； I.超離心技術(shù)；j.DNA序列分析；k.原位雜交技術(shù)；l.Western雜交技術(shù)；m.單克隆抗體技術(shù)；n.電子顯微鏡復(fù)染技術(shù)；o.細(xì)胞融合技術(shù)；p.流式細(xì)胞術(shù)；q.免疫電子顯微鏡技術(shù)；r.冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)；s.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；t.顯微操作技術(shù)。問題：1. 高等動物克隆的制作（T ）。2. 某種抗癌藥物的作用機(jī)制是阻止腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制還是阻止蛋白質(zhì)合成( H )。3. 已

14、克隆了雞卵清蛋白的基因，如何證明在雛雞的輸卵管中該基因不轉(zhuǎn)錄而在產(chǎn)卵母雞輸卵管中活躍的轉(zhuǎn)錄（G ）。4. 已克隆了人的rDNA，問rDNA分布在人的那幾條染色體上（K）。5. 研究線粒體中F0-F1-ATP酶、泛素依賴性蛋白水解酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)機(jī)作用機(jī)制（A）。6. 體外細(xì)胞培養(yǎng)，從G1期到S期，細(xì)胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化（C ）。7. 研究表皮生長因子受體分布的部位及其合成、轉(zhuǎn)運和降解的動態(tài)過程（Q）。8. 原代培養(yǎng)細(xì)胞長成致密蛋層，由于接觸抑制作用DNA合成停止，如何證明（P ）。9. 觀察縣病毒衣殼表面的亞單位-衣粒形態(tài)與排列方式（ N）。10.研究酵母菌在無氧和有氧條件下生長時，其線粒體形態(tài)

15、結(jié)構(gòu)的變化（F ）。1.    超微結(jié)構(gòu)是如何定義的?也稱為亞顯微結(jié)構(gòu)，指在電鏡下所觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體等細(xì)胞器的微細(xì)結(jié)構(gòu)。顯微結(jié)構(gòu)是指在光鏡下所觀察到樣品的各種結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞大小、外部形態(tài)以及細(xì)胞核、線粒體等內(nèi)部構(gòu)成都屬于顯微結(jié)構(gòu)。2.    相差與微分干涉顯微鏡在用途上有何區(qū)別?微分干涉差顯微鏡是在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明的。相差顯微鏡其優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。微分干涉差顯微鏡與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。微分干涉顯微鏡使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特

16、別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。相差顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。 微分干涉顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡，技術(shù)設(shè)計要復(fù)雜得多。微分干涉顯微鏡利用的是偏振光，有四個特殊的光學(xué)組件：偏振器（polarizer）、微分干涉顯微鏡棱鏡、微分干涉顯微鏡滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡，即微分干涉顯微鏡棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器

17、將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Wollaston棱鏡，即微分干涉顯微鏡滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡微分干涉顯微鏡影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時，穿過的光達(dá)到最大值。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗

18、差。為了使影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)微分干涉顯微鏡滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，光程差可改變影像的亮度。調(diào)節(jié)微分干涉顯微鏡滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交有何區(qū)別?細(xì)胞融合（cell fusion）又稱細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指兩個或兩個以上的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的現(xiàn)象。沒有什么區(qū)別只是叫法不一樣。4.所做習(xí)題中的第五項為何選C? 掃描電鏡觀察的不是已經(jīng)死亡的細(xì)胞嗎?有動態(tài)變化?第七項與第七項有何區(qū)別?觀察的不是已經(jīng)死亡的細(xì)胞嗎? 因為觀察的是細(xì)胞表

19、面形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，題目中并沒有給出觀察活體細(xì)胞，觀察表面的結(jié)構(gòu)最好用掃描電鏡。第七項看的是線粒體的結(jié)構(gòu)變化，必須用透射電鏡。用掃描電鏡沒法觀察它的結(jié)構(gòu)。3. STM與(電子顯微鏡三維成像與X射線衍射技術(shù)及核磁共振技術(shù))的用途是否等同?若不同,區(qū)別是什么?不等同。各有各的用途。STM適合觀察細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)等細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。   也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細(xì)胞形態(tài)的測量。三維重構(gòu)技術(shù)適合分析不能形成三維晶體的膜蛋白以及病毒、蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物等大的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。X衍射線衍射技術(shù)是能夠根據(jù)X-射線通過結(jié)晶樣品形成的衍射樣式成

20、像。這一技術(shù)可用于在原子分辨的水平上推測分子的結(jié)構(gòu)。實際上X-射線衍射技術(shù)是目前在原子水平上分析蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子的惟一方法。核磁共振技術(shù)可以直接研究溶液或細(xì)胞中分子量較小的蛋白質(zhì)、核酸以及其他的分子的結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡三維成像（重構(gòu)）理論運用的數(shù)學(xué)原理：將一個密度函數(shù)進(jìn)行三維傅立葉變換，密度函數(shù)就變?yōu)轭l率函數(shù)。這樣一個三維信息就壓縮到一個二維平面上,這就是電鏡照片的情況。取一個中心截面,那么一個投影的富氏變換就相當(dāng)于一個三維富氏變換的中心截面。根據(jù)這樣的原理，就可以根據(jù)投影得到的信息通過三維變換來算出分子在的結(jié)構(gòu)。比如,分子在溶液中不同的去向,分子直立或躺倒的狀態(tài)，在電鏡觀察時，投影是

21、不一樣的，然后將投影進(jìn)行傅立葉變換，理論上說,如果得到足夠多的投影,就是得到分子在所有方向上的投影,然后進(jìn)行傅氏變換,就可得到三維結(jié)構(gòu).這就是三維重構(gòu)的具體原理。根據(jù)樣品臺的特點，在實際操作中有不同的方法。對于二維結(jié)構(gòu),怎么得到不同的截面呢？可以從水平開始,傾斜不同角度,以得到投影。這樣的技術(shù)存在一個問題：由于樣品臺傾斜角度的限制,只能在0-70度之間轉(zhuǎn)動,不可能從0度傾斜到90度，所以70-90度之間沒有信息,這就是一個視錐問題,分辨率只有3-5埃米.第二種情況就是對于在溶液中的分子,分子取向是隨機(jī)分布的,所以只要分子數(shù)量足夠多,所觀察的現(xiàn)象就可得到在不同方向上的投影,也不必旋轉(zhuǎn)載物臺,不必

22、傾斜角度.以上二維結(jié)構(gòu)和溶液中分子的觀察,都是疊加后取平均分布結(jié)果.還有一種情況就是對于大的物體,如細(xì)胞器,細(xì)胞,由于存在個體差異,不可能用平均分布,這時就要攝取一個細(xì)胞進(jìn)行照相,進(jìn)行不同角度傾斜,同樣由于視錐問題,70-90度之間沒有數(shù)據(jù)。三維重構(gòu)技術(shù)適合分析不能形成三維晶體的膜蛋白以及病毒、蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物等大的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。X衍射線衍射技術(shù)是能夠根據(jù)X-射線通過結(jié)晶樣品形成的衍射樣式成像。這一技術(shù)可用于在原子分辨的水平上推測分子的結(jié)構(gòu)。實際上X-射線衍射技術(shù)是目前在原子水平上分析蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子的惟一方法。核磁共振技術(shù)可以直接研究溶液或細(xì)胞中分子量較小的蛋白質(zhì)、核酸以及其

23、他的分子的結(jié)構(gòu)。它的原理是，原子核有自旋運動，在恒定的磁場中，自旋的原子核將圍繞外加磁場作回旋運動，也稱進(jìn)動，進(jìn)動的頻率與所加磁場的強(qiáng)度成正比。如果在此基礎(chǔ)上再加一個固定頻率的電磁波，并調(diào)節(jié)外加磁場的強(qiáng)度，使進(jìn)動頻率與電磁波頻率相同。這時原子核的進(jìn)動與電磁波產(chǎn)生共振，就稱作核磁共振。核磁共振時，原子核吸收電磁波的能量，記錄下的吸收曲線就是核磁共振譜。由于不同分子中原子核的化學(xué)環(huán)境不同，將會有不同的共振頻率，產(chǎn)生不同的共振譜，記錄這種波譜就可以判斷該原子在分子中所處的位置及相對數(shù)目。用以進(jìn)行定量分析及分子質(zhì)量的測定，并對有機(jī)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。5.X衍射線衍射技術(shù)及核磁共振技術(shù)的用途是否一樣？

24、X-衍射技術(shù)并不涉及顯微鏡， 但是能夠根據(jù)X-射線通過結(jié)晶樣品形成的衍射樣式成像。這一技術(shù)可用于在原子分辨的水平上推測分子的結(jié)構(gòu)。實際上X-射線衍射技術(shù)是目前在原子水平上分析蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子的惟一方法。Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的主要依據(jù)之一就是根據(jù)Franklin對DNA晶體衍射的結(jié)果.X-射線晶體學(xué)技術(shù)，這是唯一能給出高分辨率的技術(shù),他可以分辨到一個原子水平，這是X-射線晶體學(xué)的優(yōu)點，現(xiàn)在測定一個大分子，最基礎(chǔ)的根據(jù)就是X射線晶體學(xué)；它的缺點是首先要拿到晶體,但是不是所有的生物大分子都能夠獲得晶體，有些大分子的復(fù)合物晶體獲得比較困難,所以有些大分子達(dá)不到測定

25、的要求；其次分子在晶體中往往是被鎖定于某一狀態(tài),晶體培養(yǎng)的時間較長,所得到的晶體往往是分子處于基態(tài),而分子功能的行使多發(fā)生在激發(fā)態(tài),過渡態(tài)，X射線晶體技術(shù)很難捕捉的分子的功能狀態(tài)。核磁共振衍射技術(shù)同樣具有高分辨率的特點,僅次于X-射線晶體學(xué)技術(shù),另外可以在溶液中操作,接近生理狀態(tài),缺點是所作樣品的分子量要比較小,一般 在50KD以下,而且分子量越大所測到的譜線就越多，有時各譜線很難分辨，所以有時波譜不容易分辨.當(dāng)然隨著超導(dǎo)磁鐵的發(fā)展,有可能分子量向大分子挺進(jìn)，但還是有一定限制。另外核磁共振衍射技術(shù)的反應(yīng)體系是溶液,這對不溶的蛋白比較困難,如膜蛋白,很難溶解，需要用去垢劑才可溶解,這就使研究復(fù)雜

26、化。在核磁共振衍射的觀察中,去垢劑會造成很大的噪音和假相. 與前兩種技術(shù)不同，以上兩種方法都是間接觀察,都是利用衍射譜.而先進(jìn)的冷凍電子顯微鏡是直接觀察生物大分子,是直接看到分子，因此這樣的性質(zhì)就決定分子越大反而越好，越利于觀察,因此原則上來講用冷凍電子顯微鏡觀察分子，分子的大小沒有上限,可用于復(fù)雜大分子,超分子體系。另外由于這種技術(shù)的特點，它可以捕捉到活化的過渡狀態(tài)，可以研究分子的功能狀態(tài).另外適于薄體系,二維平面。冷凍電子顯微鏡最大的缺點是低分辨率,最高只達(dá)到3埃米,這是很難達(dá)到的,而X-射線晶體學(xué)技術(shù)分辨率是1埃米,核磁共振衍射技術(shù)分辨率是2埃米.     X-射線晶體學(xué)