人血小板凍干前負(fù)載海藻糖技術(shù)的研究

1、人血小板凍干前負(fù)載海藻糖技術(shù)的研究               作者：盧發(fā)強(qiáng)，劉景漢，歐陽錫林，李錫金，周俊，莊遠(yuǎn)【摘要】  為研究人血小板凍干前負(fù)載海藻糖技術(shù)與方法，篩選出最佳負(fù)載海藻糖實(shí)驗(yàn)條件并進(jìn)一步研究血小板在溫度37條件下、 負(fù)載海藻糖4小時后的平均體積、體外激活程度和聚集反應(yīng)性的變化，繪制血小板胞內(nèi)海藻糖負(fù)載效率及濃度隨溫度、時間、胞外海藻糖濃度變化曲線，篩選合適的負(fù)載條件，分別以凝血酶、ADP、膠原、瑞斯托霉素4種物質(zhì)作為血小板激活誘導(dǎo)劑，用血

2、小板聚集儀分別檢測血小板負(fù)載海藻糖前后的聚集反應(yīng)性，用流式細(xì)胞儀檢測分析血小板負(fù)載海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表達(dá)率，加可逆性激活抑制劑PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。結(jié)果表明：海藻糖負(fù)載效率與孵育時間（2小時后）、溫度（30-40）呈良好線性關(guān)系，在37條件下經(jīng)4小時孵育后負(fù)載效率可達(dá)60%，載入到胞內(nèi)海藻糖濃度隨胞外海藻糖濃度（50 mmol/L的升高而遞增；同負(fù)載前相比較，血小板平均體積（MPV）、血小板對4種激活誘導(dǎo)劑的最大聚集率均無顯著性差別（P0.01），經(jīng)4小時負(fù)載海藻糖后血小板膜表面CD62p表達(dá)率升高，但聯(lián)合添加可逆性激活抑制劑PGE-1、腺

3、苷后CD62p表達(dá)率顯著下降。結(jié)論： 37、4小時、胞外海藻糖濃度小于50 mmol/L為合適負(fù)載條件，添加可逆性血小板激活抑制劑后，凍干前負(fù)載海藻糖過程對血小板的體外激活和聚集活性沒有顯著影響。 【關(guān)鍵詞】  海藻糖Process of Human Platelets Loaded with  Rehalose before Lyophili-zationAbstract  The aim of this research was to study the technology and methods of loading lyoprotectant-treha

4、lose into cytoplasm of human platelets before lyophilization，to optimize experimental conditions of loading trehalose，to investigate the changes of platelets response to agonists and activation after incubation of platelets for 4 hours at 37  in the presence of lyoprotectant-trehalose，to protra

5、ct  the figures of loading efficiency and intracellular trehalose concentration versus incubation time，temperature and external trehalose concentration，to optimize loading parameters. The response of platelets to different agonists   thrombin，ADP，collagen and  ristocetin were measured

6、 respectively by APACT2 aggregometer before and after loading trehalose into platelets；the expressions of CD62p and PAC-1 on platelet membranes in the presence and absence of  reversible platelets activation inhibitors  were  measured by flow cytometry respectively before and after lo

7、ading trehalose into cytoplasm of platelets. The results showed that the loading efficiency was linear to incubation time (2 hours later) and incubation temperature (rang from 30 to 40)，respectively. The loading efficiency almost reached 60% when the platelets were incubated at 37  for 4 hours.

8、 The intracellular trehalose concentration was higher with the increase of the extracellular trehalose concentration（50 mmol/L. Compared to untreated groups，the  values of MPV and aggregation to different agonists  in treated groups  showed no significant difference，respectively (P0.0

9、1). After incubation of platelets for  4 hours，the expression of  CD62p increased to some extent，however，the expression of  CD62p decreased again  when  the reversible platelets activation inhibitor PGE-1 and adenosine were added to the incubation buffer. It is concluded tha

10、t 37，4 hours  and   the extracellular trehalose concentration  50 mmol/L  are the optimal  conditions for loading with trehalose.   The processing of loading with trehalose before platelet lyophilization has no significant effects on response of platelets to a

11、gonists and activation.Key words  trehalose；freeze dried platelets；Platelets activation；Aggregation；reversible activation inhibitors血小板有效負(fù)載海藻糖至胞內(nèi)是血小板凍干保存的重要環(huán)節(jié)1。凍干保護(hù)劑海藻糖是一種分子量較大的非還原性二糖，血小板胞膜對其是非滲透性的2，3，如何克服細(xì)胞膜的非滲透性而有效將海藻糖載入到血小板胞內(nèi)是目前國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，Wolkers等2發(fā)明了一種簡便有效的將海藻糖負(fù)載到血小板胞內(nèi)的方法液相內(nèi)吞方法。本研究在此實(shí)驗(yàn)方法

12、的基礎(chǔ)上作了進(jìn)一步的探討和研究，篩選出負(fù)載海藻糖技術(shù)的最適實(shí)驗(yàn)條件，同時附帶實(shí)驗(yàn)研究了血小板凍干前負(fù)載海藻糖過程對其體外聚集反應(yīng)性和激活程度的影響。為此，我們既做了反映血小板主要功能活性的實(shí)驗(yàn)聚集實(shí)驗(yàn)，同時也做了反映血小板體外激活程度的實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)測定血小板膜糖蛋白分子表達(dá)實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)將血小板凍干制備必經(jīng)步驟胞內(nèi)海藻糖負(fù)載技術(shù)的系列實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果報(bào)告如下。材料和方法濃縮血小板來源全部標(biāo)本均來自解放軍總醫(yī)院輸血科2004年1月至2005年8月間無償獻(xiàn)血者200毫升全血中分離的新鮮富含血小板血漿（FPRP）。主要試劑及儀器海藻糖(廣西南寧中諾生物科技有限公司)、負(fù)載緩沖液A(100 mmol/L Na

13、Cl、 10  mmol/L KCl、 10  mmol/L EGTA、 10  mmol/L咪唑、10 mol/l 前列腺素-E1，pH 6.8)、80%甲醇溶液、硫酸蒽酮試劑、4種血小板聚集反應(yīng)誘導(dǎo)劑： 凝血酶、ADP、膠原、瑞斯托霉素，熒光標(biāo)記抗血小板表面糖蛋白單克隆抗體（2-8保存）：CD62p-PE、CD61-Percp、PAC-1-FITC、RGDS(PAC1阻斷劑)，含1% 多聚甲醛及0.1%疊氮鈉的PBS（pH 7.2）固定液，可逆性血小板激活抑制劑PGE-1和腺苷（Sigma公司產(chǎn)品）。酶標(biāo)儀、恒溫水浴箱、抽真空干燥器、可調(diào)溫度孵育箱、超聲清洗器

14、、分析天平，Nihonkohden(MEK-6108K)血細(xì)胞自動分析儀。蘭波APACT2血小板聚集儀（美生實(shí)業(yè)有限公司），F(xiàn)ACS流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司），一次性12mm×75mm Falcon試管（Becton Dickinson公司）、CaliBRITE Beads/FACSComp軟件（FACS儀器校正，預(yù)設(shè)獲取條件）、CellQuest軟件（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取和分析軟件）、微量加樣器和加樣頭。血小板的洗滌將富含血小板血漿320×g離心8分鐘，移去紅細(xì)胞和白細(xì)胞，上清液用負(fù)載緩沖液A溶液離心洗滌2次（480×g離心22分鐘，480&

15、#215;g離心15分鐘），用血細(xì)胞自動分析儀計(jì)數(shù)并調(diào)整血小板濃度在（1-2）×109/ml之間。血小板負(fù)載海藻糖方法及胞內(nèi)海藻糖濃度的計(jì)算將調(diào)整好濃度在（1-2）×109/ml范圍間的血小板置負(fù)載緩沖液A中負(fù)載不同濃度海藻糖（濃度范圍： 0-80 mmol/L），在不同的孵育溫度范圍（4-37）和不同的孵育時間范圍（0.5-4小時）條件下孵育，觀察并記錄海藻糖載入到血小板胞內(nèi)的效率及濃度與孵育溫度和時間的關(guān)系。經(jīng)孵育之后的血小板溶液用負(fù)載緩沖液A洗滌2次（20 000×g臺式離心機(jī)離心20秒，20 000×g離心45秒），留取血小板沉淀，用80%甲醇提

16、取載入到血小板胞內(nèi)的海藻糖，80條件下加熱30分鐘。用硫酸蒽酮反應(yīng)定量載入到血小板胞內(nèi)的海藻糖，用酶標(biāo)儀測定用甲醇提取后的海藻糖溶液的吸光度值。繪制6-300 g/ml范圍內(nèi)的海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線核對檢測的每個標(biāo)本的吸光度值，換算成負(fù)載到每個血小板胞內(nèi)的海藻糖摩爾數(shù)，海藻糖摩爾數(shù)/血小板平均體積的一半即胞內(nèi)海藻糖的濃度。海藻糖的負(fù)載效率（取均值）負(fù)載到胞內(nèi)的海藻糖濃度/初始胞外海藻糖濃度×100。血小板負(fù)載海藻糖前后平均體積的變化用血細(xì)胞分析儀分別測定。血小板聚集反應(yīng)用APACT2型血小板聚集儀分別測定血小板在負(fù)載海藻糖前后對誘導(dǎo)劑凝血酶(1 U/ml)、膠原(2 g/m

17、l)、ADP(20 mol/L)、瑞斯托霉素(1.6 mg/ml)的聚集率，調(diào)整血小板計(jì)數(shù)為250×109/L，取調(diào)整好的FPRP  250 l，加入25 l誘導(dǎo)劑，記錄最大聚集率。流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜表面糖蛋白分子的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測海藻糖負(fù)載前后血小板表面激活指標(biāo)CD62p（磷脂酰絲氨酸，Ps）、PAC-1（活化的gpb/a復(fù)合物）的表達(dá)率，添加可逆性激活抑制劑PGE-1和腺苷后CD62p、PAC-1的表達(dá)率，表達(dá)用“”表示，未表達(dá)用“”表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照管：取新鮮血小板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)在（1 000-2 000）×109/L，取5 l加PE同型對照（IgG1

18、 PE）、CD61-PerCP、PAC-1 FITC、RGDS各5 l；陽性對照管:取血小板5 l加入2 l凝血酶充分激活，再加1 l  GPRP (Gly-Pro-Arg-Pro)（防止血小板聚集），在試驗(yàn)管中加入3種抗體各5 l和血小板5 l后，輕輕混勻，室溫暗處孵育15-20分鐘，各管中加入05 ml冷的固定液 (2-8)，充分混勻，在2-8陰暗處放置30分鐘。上機(jī)獲取數(shù)據(jù)： 開機(jī)后，打開CellQuest，順序放置對照管和試驗(yàn)管。獲取數(shù)據(jù)： 調(diào)出，獲取條件、FSC和SSC選擇Log方式；獲取條件為CD61 PerCP陽性，使用對照管調(diào)整FL1和FL2的PMT，使陰性群體位于F

19、L1 vs FL2點(diǎn)圖左下角，分別使用PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP調(diào)整FL2-FL1和FL1-FL2補(bǔ)償，獲取各管的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果分析：在CD61 vs SSC點(diǎn)圖中找出CD61 PerCP陽性的血小板群 (單個血小板和黏附在白細(xì)胞上的血小板)設(shè)門。門內(nèi)做PAC-1 FITC vs CD62P PE點(diǎn)圖的雙參數(shù)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。         統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將不同時間、溫度、胞外海藻糖濃度對應(yīng)的胞內(nèi)

20、海藻糖濃度的多個均數(shù)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，胞內(nèi)海藻糖的濃度以x±SD表示，用CHISS統(tǒng)計(jì)軟件錄入數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。結(jié)   果胞內(nèi)海藻糖濃度及負(fù)載效率與不同孵育溫度（）的關(guān)系在胞外海藻糖濃度50 mmol/L、4小時孵育后，負(fù)載到血小板內(nèi)部的海藻糖濃度（ mmol/L）及負(fù)載效率（%）與不同孵育溫度（）的關(guān)系見表1。在25以下，胞內(nèi)濃度及負(fù)載效率很低，且差別不大；當(dāng)負(fù)載溫度超過30以后，胞內(nèi)濃度及負(fù)載效率急劇增加；37時，負(fù)載效率可達(dá)35；37以后，負(fù)載效率維持在一平穩(wěn)水平。Table 1. Relationship between intracellular t

21、rehalose concentration，loading effeciency and incubation temperature  (略)胞內(nèi)海藻糖濃度及負(fù)載效率與不同孵育時間的關(guān)系在胞外海藻糖濃度為25 mmol/L、孵育溫度37條件下負(fù)載到血小板胞內(nèi)海藻糖濃度（ mmol/L）及負(fù)載效率（%）與不同負(fù)載時間(分鐘)的關(guān)系見表2。孵育2小時之前，胞內(nèi)海藻糖濃度及負(fù)載效率較低，2小時后，胞內(nèi)海藻糖濃度及負(fù)載效率隨時間的延長呈線性增加的趨勢，4小時后維持在一平衡水平。Table 2. Relationship between intracellular trehalose co

22、ncentration，loading effeciency and incubation time   (略)血小板胞外海藻糖濃度與胞內(nèi)海藻糖濃度的關(guān)系在37孵育、經(jīng)4小時負(fù)載后，不同胞外海藻糖濃度（mmol/L）與負(fù)載到血小板胞內(nèi)海藻糖濃度（mmol/L）的關(guān)系見表3。從表3可以看出，在37條件下，隨胞外海藻糖濃度（50 mmol/L）的升高，其胞內(nèi)海藻糖的濃度也隨著升高，但當(dāng)胞外濃度70  mmol/L時，胞內(nèi)海藻糖的濃度反而降低。在4條件下，胞內(nèi)海藻糖的濃度一直維持在一較低水平。Table 3. Relationship between original

23、extracellular trehalose  concentration and intracellular trehalose concentration at 4 and 37 after incubation for 4 hours   (略)血小板胞內(nèi)海藻糖的載入效率（%）隨孵育時間、孵育溫度及細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度的關(guān)系血小板胞內(nèi)海藻糖的載入效率（%）隨孵育時間，孵育溫度的關(guān)系曲線如圖1、圖2所示。在37和4溫度條件下載入到細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度與不同胞外海藻糖濃度的關(guān)系曲線如圖3所示。由圖1可見，孵育4小時后負(fù)載效率高，可達(dá)60%，但4小時后負(fù)載效率并不隨孵育

24、時的延長而明顯增加。圖2表明，37時負(fù)載效率較高，可達(dá)35%，但負(fù)載效率并不隨孵育溫度升高而明顯增加。圖3顯示，37孵育4小時細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度明顯高于4孵育4小時時。細(xì)胞外海藻糖濃度為50 mmol/L時細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度最高，而細(xì)胞外海藻糖濃度高于50 mmol/L時，細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度卻下降。海藻糖負(fù)載前后血小板MPV(fl)的變化檢測結(jié)果表明：負(fù)載前MPV為6.3±1.10fl，負(fù)載后MPV為6.7±1.23 fl，負(fù)載前后比較，t=1.084，P=0.285（0.05），差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故負(fù)載過程不影響MPV變化。海藻糖負(fù)載前后血小板對4種誘導(dǎo)劑的最大聚集率結(jié)果見表4

25、。由表4可見，血小板負(fù)載海藻糖過程對血小板聚集反應(yīng)性無顯著影響。Table 4.  Comparion of platelets Aggregation rates（） caused by 4 different agonists before and after loading with  trehalose（略）海藻糖負(fù)載前后、加和未加可逆性激活抑制劑PGE-1（10ug/ml）、腺苷（5 mmol/L）后血小板膜表面糖蛋白磷脂酰絲氨酸（CD62p）、PAC-1的表達(dá)率流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見表5。從表5可見，在孵育溶液中加了可逆性血小板激活抑制劑PGE-1和腺苷后，CD6

26、2p的表達(dá)明顯抑制，而PAC-1的表達(dá)保持穩(wěn)定。Table 5.  Expression  of platelet membrane glycoprotein（CD62p）and PAC-1 before and after loading with trehalose  (%) (略)討  論通過與血小板胞膜第二相變溫度（3037）有關(guān)的液相細(xì)胞內(nèi)吞途徑，血小板可將胞外海藻糖有效載入到細(xì)胞內(nèi)部。海藻糖在干燥狀態(tài)下維持玻璃化狀態(tài)，有著獨(dú)特的保護(hù)大分子蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的作用4。圖1所示血小板負(fù)載海藻糖可在37條件、短短幾小時時間內(nèi)順利完成，僅經(jīng)4小時孵育，海

27、藻糖負(fù)載效率可達(dá)50%以上，表明有限幾小時時間內(nèi)，胞內(nèi)海藻糖跟胞外海藻糖的濃度便達(dá)到了化學(xué)平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血小板從開始孵育起到2小時內(nèi)對海藻糖的吸收速率較慢，但2小時后，細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量增加很快，這表明吸收后的海藻糖均勻分布在血小板胞質(zhì)內(nèi)，而非僅僅局限在幾個有限細(xì)胞器內(nèi)5。Tablin等1 和Wolkers等6利用一種分子量類似海藻糖的熒光染料(LYCH)作為標(biāo)記也驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)的正確性，即熒光染料起初在內(nèi)吞囊泡，短暫時間后，熒光染料便均勻分布在血小板胞質(zhì)中，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探討。圖3所示在胞外海藻糖濃度0-30 mmol/L范圍、37條件下，吸收到胞內(nèi)海藻糖濃度與胞外海藻糖濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。但在胞外海藻糖濃度超過50 mmol/L，經(jīng)過4小時孵育后，血小板體積變大，腫脹，且血小板聚集實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證其對包括凝血酶在內(nèi)誘導(dǎo)劑的聚集反應(yīng)性降低，吸收到胞內(nèi)海藻糖濃度也開始降低。血小板細(xì)胞膜有兩個相變溫度范圍，第一相變范圍為膜磷脂相變范圍，溫度為15-18，第二相變范圍為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域包括膽固醇在內(nèi)的相變范圍，溫度為30-37。圖2顯示，在第一相變點(diǎn)15時，海藻糖只能少量緩慢吸收，當(dāng)在第二相變點(diǎn)37時，海藻糖卻被快速有效吸收，吸收效率可達(dá)35%。負(fù)載海藻糖后的血小板經(jīng)凍干、再水化后，通過掃描電鏡、流式細(xì)胞儀 、聚集實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞膜的完整性、血小板的回收率、血小板同