米曲霉GN―2菌株產(chǎn)中性蛋白酶固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

1、米曲霉 GN 2 菌株產(chǎn)中性蛋白酶固體發(fā)酵條件的優(yōu)化摘要：對米曲霉( Aspergillus oryaze ) GN-2 菌株產(chǎn)中 性蛋白酶固體發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明， 米曲霉的固體適宜發(fā)酵條件為發(fā)酵原料麩皮：豆粉為4 : 1(質(zhì)量比，下同)，培養(yǎng)時(shí)間60 h,培養(yǎng)溫度25 C,培養(yǎng)基 加水量10 mL，接種量1X 106個(gè)/mL孢子懸液2.0 mL ,培養(yǎng) 基起始 pH 6.0， 0.02%(NH4 ) 2SO4 溶液 1 m L 。正交試驗(yàn)結(jié) 果表明，在溫度25 C、加水量20 mL、麩皮：黃豆粉為4 : 1、培養(yǎng)時(shí)間 72 h 的條件下酶活力最高，達(dá) 1 016.9 U/

2、g。關(guān)鍵詞：米曲霉( Aspergillus oryaze )；中性蛋白酶；產(chǎn) 酶條件中圖分類號： TQ92 5 ； Q93-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號：0439-8114 ( 2014) 07-1637-04Optimizing the Solid Fermentation Conditions of Neutral Protease fromAspergillus oryzae GN-2 StrainHUANG Yan ， JU Lu-ning( Minbei V ocational and Technical College ， Nanping 353000， Fujian ， C

3、hina)Abstract ： The optimal solid fermentation conditions of neutral protease from Aspergillus oryzae GN-2 strain was studied. The results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4 : 1,

4、fermentation time 60 h , temperature 30 °C, water addition 10 mL , inoculum amount 2.0 mL 1 x 106 spores/mL spore suspension， the initial medium pH 6.0 ， 0.02%(NH4)2SO4 1 mL. The results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid ferme

5、ntation was carried out at 25 C for 72 h ， water addition 20 mL and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4: 1， with the highest neutral protease activity of 1 016.9 U/g.Key words ： Aspergillus oryzae ； neutral protease； enzyme production conditions中性蛋白酶是指最適作用pH介于6.07.5的一類蛋白酶，能催化蛋白質(zhì)肽鍵水

6、解。它是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工 業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶制劑，被廣泛應(yīng)用于皮革脫毛、飼料加工、 畜禽血液蛋白質(zhì)水解、酒和飲料的澄清以及醫(yī)藥治療等領(lǐng)域 1-3。米曲霉( Aspergillus oryaze )具有豐富的蛋白酶系，能 產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶，能耐受較高溫度，廣泛地應(yīng) 用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中 4 。米曲霉易于固體培養(yǎng)， 所產(chǎn)的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性高，有利于酶制劑的制作和保 存，培養(yǎng)原料來源廣泛，價(jià)格便宜，用于食品行業(yè)和化妝品 行業(yè)將有廣泛的前景 5 。吳繼星等 6研究表明， 微生物培養(yǎng) 基組成與產(chǎn)酶有極大的相關(guān)性。近年來，研究者采用正交設(shè) 計(jì)的方法對培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，

7、并取得一 定成效 7 。本研究從釀造醬油曲精中分離到一株米曲霉菌株，命名為 GN-2 ，研究了培養(yǎng)條件對米曲霉 GN-2 產(chǎn)中性蛋白酶的影 響，通過正交試驗(yàn)確定了其中 4 個(gè)影響因素的最優(yōu)組合，為 該菌株的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料菌株來源：米曲霉 GN-2 ，從上海迪發(fā)釀造生物制品有 限公司優(yōu)質(zhì)醬油曲精分離純化得到。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g/L ，蔗糖 20 g/L。豆粉汁培養(yǎng)基： MgSO4 0.5 g/L ，KH2PO4 1.0 g/L ，（NH4 ）2SO4 0.5 g/L ，可溶性淀粉 20 g/L ，黃豆汁 1 L。發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉 3 g, 麩皮1

8、2 g，去離子水15 mL , 裝入 250 mL 三角瓶攪拌混合均勻。1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：干酪素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） ； L- 酪氨酸（上海翔軍生物科技有限公司） ；福林酚試劑（上海分子免疫生化實(shí)驗(yàn)室有限公司）主要儀器： YC-W 型冷凍恒溫振蕩器（鎮(zhèn)江格瑞生物工 程有限公司） ；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司 醫(yī)療設(shè)備廠） ； TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機(jī)（湖南長沙 湘儀離心機(jī)儀器有限公司） ； 721E 型可見分光光度計(jì)（上海 光譜儀器有限公司） ；DHG-9070 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司） ； 作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）

9、 （北京賽多利儀器有限公司） （意大利 HANNA ）。1.3.1 菌種的分離純化 理鹽水中， 磁力攪拌器攪拌SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工 ； ALC-114 型電子分析天平 ；pH211C 型臺式數(shù)顯酸堿度計(jì) 1.3 方法挑取 2 環(huán)曲精于 100 mL 無菌生30 min 打散孢子， 采用稀釋平板 涂布法對供試菌種進(jìn)行分離純化。培養(yǎng)后，挑取生長快、產(chǎn) 孢子致密、表面顏色一致的單菌落，移入 PDA 斜面培養(yǎng)基， 培養(yǎng)后置于4 C冰箱保存。孢子懸液的制備 挑取斜面培養(yǎng)基米曲霉 GN-2 孢子兩環(huán)，于 100 mL 無菌生理鹽水中， 磁力攪拌器攪拌 30 min 打散孢子，取樣置于光學(xué)顯

10、微鏡下，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)， 調(diào)整孢子密度約為 1 X 106個(gè)/mL。發(fā)酵條件 取接種孢子懸液 2.0 mL 于發(fā)酵培養(yǎng)基 中，30 C恒溫培養(yǎng)72 h。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮：黃豆粉=4 : 1,加水量為15 mL ，裝料量 15 g。蛋白酶活力測定 參照文獻(xiàn) 8 繪制 L- 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定中性蛋白酶的活力。酶活力單位定義：40 C、pH 7.2條件下，每克米曲霉I min水解酪蛋白產(chǎn)生1卩g酪 氨酸定義為 1 個(gè)中性蛋白酶活力單位（ U/g）。發(fā)酵條件對米曲霉 GN-2 產(chǎn)中性蛋白酶的影響1 ）發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵培養(yǎng)基接種后，分別在24、 36、 48、60、 72 h 取樣，測定酶活力

11、。2）培養(yǎng)基組分。在總量不變前提下，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮與黃豆粉的比例分別為1 : 4、2 ： 3、1 ： 1、3 ： 2和4 :1 ，滅菌后接種培養(yǎng)，取樣測定酶活力。3） 培養(yǎng)基加水量。發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加水10、15、20、25、 30 mL ，其他發(fā)酵條件不變，滅菌后接種培養(yǎng)，取樣測 定酶活力。4） 溫度。將接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于20、25、30、 35、40 C培養(yǎng)72 h，取樣測定酶活力。5） 接種量。發(fā)酵培養(yǎng)基中加水量分別為14.5、14.0、13.5、13.0、12.5 mL ,滅菌后分別接入 0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 mL 孢子懸液，培養(yǎng)后取樣測定酶活力。6

12、） 培養(yǎng)基起始pH。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入適量的 1 moI/L HCI 或 NaOH 溶液，調(diào)整后使培養(yǎng)料的 pH 分別為 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0，滅菌接種后培養(yǎng)，取樣測定酶活力。7)無機(jī)鹽。以 15 mL 下列無機(jī)鹽溶液： 0.05% MgSO4?7H2O 、0.1%K2HPO4 、0.2%KNO3 、 0.001%FeS04?7H20 和 0.02% (NH4 ) 2SO4,代替發(fā)酵培養(yǎng) 基中的去離子水，滅菌接種后培養(yǎng)，取樣測定酶活力。以上各試驗(yàn)每個(gè)處理 3 次重復(fù)。8)發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果，選擇培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基組分(麩皮：豆粉)、加水量、培

13、養(yǎng)溫度 4 個(gè)因素進(jìn)行發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)， 按照 L9( 34)設(shè)計(jì) 4 因素 3 水平試驗(yàn)， 9 個(gè)組合， 3 次重復(fù)，優(yōu)化發(fā)酵條件。正 交試驗(yàn)因素和水平如表 1 所示。粗酶液的制備 準(zhǔn)確稱取固體發(fā)酵樣品 5 g 于25 mL , pH 7.2的0.5 mol/L磷酸緩沖液中，攪拌均勻后于40 C 恒溫振蕩鍋中，100 r/min浸提30 min。浸提液過濾后所得濾 液即為粗酶液，用于后期測定。1.4 數(shù)據(jù)處理與分析采用 Excel 2003 和 SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方 差分析， 差異顯著性分析采用多重比較法( LSD) ，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。2 結(jié)果與分析2.

14、1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在波長680 nm處，酪氨酸濃度在1080 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 其回歸方程為 y=0.092 9x+0.015 8， R2=0.991 5標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1 所示2.2 發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶的影響圖 2 結(jié)果表明，在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，米曲霉 GN-2 菌株 產(chǎn)中性蛋白酶活力呈先升高后降低的變化規(guī)律。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間 為 60 h 時(shí)，中性蛋白酶酶活力達(dá)到最高值， 為( 244.1±8.93) U/g 。之后繼續(xù)培養(yǎng)，中性蛋白酶活力降低。2.3 培養(yǎng)基組分對產(chǎn)酶的影響圖 3 結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮與黃豆粉的比例對米 曲霉 GN-2 產(chǎn)中性蛋白酶有明顯影響。麩皮所

15、占比例越大， 米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力越高。當(dāng)麩皮：黃豆粉=4 : 1時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為(538.6 土 12.21) U/g。這 可能與麩皮原料對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的誘導(dǎo)作用有關(guān)。2.4 培養(yǎng)基加水量對產(chǎn)酶的影響由圖 4 可以看出，培養(yǎng)基加水量對米曲霉 GN-2 產(chǎn)中性 蛋白酶有明顯影響。 在本試驗(yàn)條件下， 產(chǎn)酶最適加水量為 10 mL ，且隨著培養(yǎng)基加水量的增加， 中性蛋白酶酶活力逐漸下 降?？赡芤环矫媸怯捎谂囵B(yǎng)基含水量過高， 菌絲體前期徒長， 形成孢子的時(shí)間延長，使中性蛋白酶產(chǎn)量下降；另一方面， 培養(yǎng)基含水量過高致使培養(yǎng)基的透氣性下降，氧氣供給不 足，使菌體生長不良，產(chǎn)酶

16、量也下降。2.5 溫度對產(chǎn)酶的影響由圖 5 可以看出，溫度對米曲霉的產(chǎn)酶能力有較大的影響。25 C以下，菌體生長緩慢，產(chǎn)酶量較少。溫度高于30 C 時(shí)，產(chǎn)酶量迅速下降。培養(yǎng)溫度為25、30 C時(shí)，酶活力較高。當(dāng)培養(yǎng)溫度為 25 C時(shí)，酶活力達(dá)到最高值，為(635.6 ± 16.31) U/g。當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 C時(shí)，可能由于固體發(fā)酵 料中心熱量不能及時(shí)擴(kuò)散，導(dǎo)致燒曲現(xiàn)象，以至酶活力降到 最低點(diǎn)，約為最高值的 4.57%。2.6 接種量對產(chǎn)酶的影響表 2 結(jié)果表明，接種量可影響米曲霉 GN-2 產(chǎn)中性蛋白 酶的活力。隨著接種量的增加，米曲霉產(chǎn)酶能力呈先增強(qiáng)后 減弱的趨勢；當(dāng)接種量為 2

17、.0 mL 時(shí)，中性蛋白酶酶活力最高， 達(dá)到(656.3 ± 16.64) U/g。可能是因?yàn)榻臃N量過小時(shí)，菌 體生長緩慢，發(fā)酵遲緩；接種量過大時(shí)，則因菌體生長過快 導(dǎo)致營養(yǎng)和氧氣缺乏， 從而影響酶的產(chǎn)生 3 。2.7 培養(yǎng)基起始 pH 對產(chǎn)酶的影響表 3 結(jié)果表明，培養(yǎng)基起始 pH 對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶 有一定影響。隨著培養(yǎng)基起始 pH 的增大，中性蛋白酶酶活 力呈先升高后降低的變化趨勢； pH 為 6.0 時(shí)，酶活力最高， 達(dá)到(589.4土 15.22) U/g。pH為7.0時(shí)，酶活力下降到(461.5 ± 13.85) U/g 。當(dāng) pH 為 9.0 時(shí)，酶活力降低

18、到最小值，為(315.9± 11.76) U/g。2.8 無機(jī)鹽對產(chǎn)酶的影響由表 4可知，無機(jī)鹽對米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶也有影響，Mg2+、K+、NH4+對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+對產(chǎn)酶有明顯的 抑制作用。當(dāng)無機(jī)鹽為 0.02%(NH4)2SO4 溶液時(shí)，中性蛋 白酶酶活力最高，達(dá)到( 859.6± 16.34) U/g。2.9 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中各 組分的配比與培養(yǎng)條件。由表 5 可知，試驗(yàn)條件下優(yōu)化水平 的最佳組合為 A1B3C3D3 ，米曲霉 GN-2 產(chǎn)中性蛋白酶的最 優(yōu)培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基組分麩皮：豆粉為4

19、: 1、培養(yǎng)溫度25 C、加水量20 mL、培養(yǎng)時(shí)間72 h。極差分析 可知，各因子對酶活力影響大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組 分、培養(yǎng)時(shí)間、加水量。方差分析(表6)表明，培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶量的影響顯著，而發(fā)酵培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間以及加 水量對產(chǎn)酶量的影響不顯著。按照最佳組合試驗(yàn)得到的酶活 力為 1 016.9 U/g 。3 結(jié)論與討論 單因素試驗(yàn)表明，固體發(fā)酵的適合產(chǎn)酶條件為麩皮：黃 豆粉為4 ： 1,發(fā)酵時(shí)間60 h，培養(yǎng)溫度25 C,培養(yǎng)基加 水量 10 mL ，接種量 2.0 mL 孢子懸液，培養(yǎng)基起始 pH 6.0， 無機(jī)鹽0.02% (NH4 ) 2SO4 1 mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，

20、培養(yǎng) 溫度為25 C、加水量為20 mL、麩皮：豆粉為 4 : 1、培養(yǎng) 時(shí)間為 72 h 的組合酶活力最高，達(dá) 1 016.9 U/g 。筆者在后 續(xù)試驗(yàn)中采用該正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件， 進(jìn)行了 3 次發(fā)酵培養(yǎng)， 結(jié)果酶活力均值為( 993.6± 14.62) U/g 。說明經(jīng)過優(yōu)化， 酶活力得到了提高。中性蛋白酶可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過微生 物生產(chǎn)。由于動(dòng)植物資源受到各種條件的限制，不易擴(kuò)大生 產(chǎn)。而微生物具有生長快、 種類多等優(yōu)點(diǎn)， 且微生物易變異， 通過菌種改良可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量，改善酶的生產(chǎn)和酶 的性質(zhì)，因此目前工業(yè)酶制劑大部分都是通過微生物發(fā)酵進(jìn) 行大規(guī)模制造的?？梢陨a(chǎn)蛋白酶的微生物有細(xì)菌、放線菌 和真菌等。米曲霉可以生產(chǎn)多種酶，如淀粉酶、果膠酶、脂 肪酶等，中性蛋白酶為其中的一種。米曲霉是一種常用的酶 制劑生產(chǎn)菌種。本試驗(yàn)主要探討了多種因素對米