非病毒載體負(fù)載增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染永生化神經(jīng)前體細(xì)胞

1、非病毒載體負(fù)載增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染永生化神經(jīng)前體細(xì)胞                 作者：桂伶俐，劉志恒，張傳漢，高峰【關(guān)鍵詞】 綠色熒光蛋白質(zhì)類；,基因表達(dá)；,轉(zhuǎn)染；,神經(jīng)前體細(xì)胞Transfection of enhanced green fluorescent protein into immortalized neural progenitor cells by nonviral vectors【Abstract】 AIM:

2、 To investigate an effective transfection method of nonviral vectors and the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in the transfected immortalized neural progenitor cells (INPC). METHODS: The plasmid EGFPC1 was transfected into INPC by three different nonviral vectors respectively,

3、 including Lipofectamine 2000, TRANSfection and Sofast. The expression of EGFP and the transfection efficiency of the 3 vectors were measured at 24 h after transfection. The transfection efficiency of the vector which was the most efficient, was detected 12, 24, 48 and 72 h after transfection to det

4、ermine the expression peak of EGFP. The viability of transfected and nontransfected cells was measured by trypan blue rejection test. After the plasmid EGFPC1 was transfected into INPC, the stable cell clone designated INPC/EGFP was isolated by G418 selection. The positive rate of EGFP was observed.

5、 And the specific molecular marker of neural progenitor cells, nestin, was detected using immunocytochemistry. After INPC/EGFP was induced by 50 mL/L fetal bovine serum, the cell morphology and the expression of EGFP were observed in the differentiated cells. RESULTS: The transfection efficiency of

6、Lipofectamine 2000, TRANSfection and Sofast was (25.5±2.9)%, (4.0±1.7)%, (7.9±1.4)% respectively, at 24 h after transfection. And Lipofectamine 2000 was the most efficient. Its transfection efficiency at 12, 24, 48 and 72 h after transfection was (17.1±0.7)%, (25.5±2.9)%, (1

7、9.4±0.9)%, (15.6±1.4)%, respectively. The expression of EGFP was the highest at 24 h after transfection. The positive rate of EGFP was 95% in INPC/EGFP. And INPC/EGFP was still nestin positive. The differentiated cells presented as neurons or astrocytes, and EGFP was still found in their s

8、omas and processes. CONCLUSION: Extrinsic genes can be effectively transfected into INPC by Lipofectamine 2000. And EGFP is one of the valuable trac ,非病毒載體負(fù)載增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染永生化神經(jīng)前體細(xì)胞 king tools for INPC.【Keywords】 green fluorescent protein; gene expression; transfection; neural progenitor cell【摘要】 目的: 尋找

9、能高效轉(zhuǎn)染永生化神經(jīng)前體細(xì)胞(INPC)的非病毒載體，觀察轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá). 方法: 用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，TRANSfection或陽離子聚合物Sofast分別負(fù)載質(zhì)粒EGFPC1轉(zhuǎn)染INPC，利用熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染后24 h的轉(zhuǎn)染效率. 對轉(zhuǎn)染效率最高的一種載體，觀察其轉(zhuǎn)染后12，24，48和72 h轉(zhuǎn)染效率，確定EGFP表達(dá)最高峰. 用臺盼藍(lán)排斥試驗檢測轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力. 質(zhì)粒EGFPC1轉(zhuǎn)染INPC后，經(jīng)G418篩選，挑選細(xì)胞克隆，命名為INPC/EGFP,觀察其EGFP陽性率. 應(yīng)用巢蛋白抗體鑒定INPC/EGFP. 50

10、 mL/L胎牛血清誘導(dǎo)INPC/EGFP分化，觀察分化后細(xì)胞的形態(tài)及EGFP表達(dá). 結(jié)果: Lipofectamine 2000，TRANSfection和Sofast轉(zhuǎn)染INPC后24 h，轉(zhuǎn)染效率分別為(25.5±2.9)%，(4.0±1.7)%，(7.9±1.4)%. Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染效率最高. 其轉(zhuǎn)染后12，24，48和72 h的轉(zhuǎn)染效率分別為(17.1±0.7)%，(25.5±2.9)%，(19.4±0.9)%，(15.6±1.4)%，EGFP在轉(zhuǎn)染后24 h表達(dá)最高. INPC/EGFP

11、中，EGFP陽性率約為95%. INPC/EGFP巢蛋白表達(dá)陽性，其分化后呈神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞樣，且胞體及突起中仍可見綠色熒光. 結(jié)論: Lipofectamine 2000可高效轉(zhuǎn)染INPC. EGFP是INPC理想的示蹤方法之一.【關(guān)鍵詞】 綠色熒光蛋白質(zhì)類；基因表達(dá)；轉(zhuǎn)染；神經(jīng)前體細(xì)胞0引言永生化神經(jīng)前體細(xì)胞（immortalized neural progenitor cell, INPC）具有自我更新、無限增殖及多向分化的潛能，且較原代神經(jīng)前體細(xì)胞易行基因操作，成為神經(jīng)系統(tǒng)損傷細(xì)胞替代及基因治療的理想靶細(xì)胞1. 而選擇高效的外源基因?qū)胂到y(tǒng)對基因治療的效果至關(guān)重要. 盡管病毒介導(dǎo)的

12、基因轉(zhuǎn)染具有更佳的轉(zhuǎn)染效率2，但由于其安全性和技術(shù)方面的原因,探討高效率的非病毒載體基因轉(zhuǎn)染方法更具意義. 本實驗擬以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)為報告基因， 采用不同種類陽離子脂質(zhì)體或陽離子聚合物轉(zhuǎn)染大鼠INPC, 檢測其轉(zhuǎn)染效率， 并觀察EGFP的表達(dá)， 以期尋找轉(zhuǎn)染效率較高的非病毒載體及理想的INPC示蹤方法.1材料和方法Neurobasal，B27添加劑，胎牛血清購自美國GIBCO公司；堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、表皮生長因子（epidermal

13、 growth factor, EGF）購自英國PeproTech公司；多聚鳥氨酸、明膠購自美國SIGMA公司； Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；TRANSfection購自北京天為時代公司；Sofast購自北京天來公司；巢蛋白抗體購自美國NeoMarkers公司；免疫組化試劑盒購自北京中山公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜公司；攜帶質(zhì)粒EGFPC1（美國BD公司）的菌種由同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室保存.原代大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞后建立的INPC，由同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室構(gòu)建并保存1. INPC應(yīng)用含20 mL/L B27，20 g/L bFGF，20 g/L EGF的無

14、血清Neurobasal培養(yǎng)基，在預(yù)先采用10 mg/L多聚鳥氨酸和2 g/L明膠包? ( 非病毒載體負(fù)載增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染永生化神經(jīng)前體細(xì)胞(2) 壞牧裝逯刑諗嘌?將攜帶EGFPC1質(zhì)粒的菌種接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，振搖12 h，按試劑盒操作說明提取質(zhì)粒，采用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法確定質(zhì)粒的純度與濃度. 分別參照陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，TRANSfection及陽離子聚合物Sofast的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒按說明書推薦量）. 將兩者混合物輕輕滴加于匯合率為80%90%的INPC中，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后換液. 每組設(shè)3 個復(fù)孔. 轉(zhuǎn)染后24

15、 h，倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá). 分別記錄每個轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)孔隨機(jī)5個視野內(nèi)明視野和暗視野所觀察到的細(xì)胞數(shù). 轉(zhuǎn)染效率（%）暗視野發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)/明視野細(xì)胞數(shù)×100%. 對轉(zhuǎn)染效率最高的一種載體，在轉(zhuǎn)染后12，24，48和72 h觀察轉(zhuǎn)染效率.細(xì)胞活力取出同期培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染剛結(jié)束的細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫下用0.4 g/L臺盼藍(lán)溶液染色10 min. 顯微鏡下隨機(jī)取培養(yǎng)孔5個視野. 未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞. 活細(xì)胞率（%）活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%.EGFPC1質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染INPC后24 h傳代，

16、轉(zhuǎn)染后48 h加入G418 200 g/mL篩選14 d，通過倒置熒光顯微鏡挑選陽性克隆，命名為INPC/EGFP，并計算EGFP陽性細(xì)胞百分率. INPC/EGFP行巢蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色. 加入50 mL/L胎牛血清誘導(dǎo)INPC/EGFP分化7 d，觀察細(xì)胞形態(tài)及EGFP的表達(dá).統(tǒng)計學(xué)處理： 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗      數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較用單因素方差分析后Duncan檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果三種非病毒載體Lipofectamine 2000，TRANSfection和Sof

17、ast負(fù)載EGFPC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INPC后24 h，轉(zhuǎn)染效率分別為(25.5±2.9)%，(4.0±1.7)%，(7.9±1.4)%，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1）. Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染效率最高.A: 陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000; B: 陽離子脂質(zhì)體TRANSfection; C: 陽離子聚合物Sofast.2.2Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染INPC后不同時間點的轉(zhuǎn)染效率Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染后12，24，48和72 h轉(zhuǎn)染效率分別為（17.1±0.7）%，（

18、25.5±2.9）%，（19.4±0.9）%，（15.6±1.4）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05）. EGFP表達(dá)最高峰在轉(zhuǎn)染后24 h.臺盼藍(lán)排斥試驗檢測未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和Lipofectamine 2000，TRANSfection及Sofast轉(zhuǎn)染剛結(jié)束后活細(xì)胞率，分別是（97.0±1.0）%，（95.7±1.2）%，（96.0±1.0）%，（95.7±0.6）%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05）.2.4INPC/EGFP中EGFP陽性率轉(zhuǎn)染EGFPC1質(zhì)粒后，經(jīng)G418篩選所得細(xì)胞克隆INPC/EG

19、FP中，EGFP陽性率約為95%，EGFP熒光均勻地充滿胞漿和胞核（圖2）.INPC/EGFP的細(xì)胞形態(tài)及生長特性較INPC無明顯改變，仍以橢圓形或三角形為主，有23個突起，胞核圓形、較大，而胞質(zhì)較少（圖3A）. 其巢蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色仍呈胞漿陽性（圖3B）. 其分化7 d后，可觀察到大量不同形態(tài)的新生神經(jīng)細(xì)胞，呈現(xiàn)為具有12個細(xì)長突起的神經(jīng)元樣或多個粗短突起的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài). 熒光顯微鏡下觀察到分化后細(xì)胞的胞體與纖細(xì)突起仍表達(dá)EGFP（圖3C）.3討論目前，非病毒轉(zhuǎn)染法中以陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物呈現(xiàn)顯著優(yōu)勢3-4，影響它們轉(zhuǎn)染效率的因素眾多. 本實驗中，細(xì)胞種類、細(xì)胞密度、質(zhì)粒及轉(zhuǎn)

20、染時間均相同，并參照說明書給予推薦量的轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒DNA,則轉(zhuǎn)染效率主要取決于陽離子脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)或陽離子聚合物的種類. 本研究采用常用轉(zhuǎn)染試劑陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，TRANSfection和陽離子聚合物Sofast分別介導(dǎo)INPC的基因轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)這三種非病毒載體細(xì)胞毒性都很低，且Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染效率最高，可超過20. 雖然，高峰等2發(fā)現(xiàn)利用EGFP重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染INPC，可得到高達(dá)90的轉(zhuǎn)染效率，但由于其安全性和技術(shù)方面的原因, Lipofectamine 2000仍不失為一種? 歡迎您訪問非病毒載體負(fù)載增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染永生化神

21、經(jīng)前體細(xì)胞(3) 行蟣愕淖痙椒?A: INPC/EGFP細(xì)胞形態(tài); B: INPC/EGFP巢蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色; C: INPC/EGF分化后熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá).EGFPC1質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入細(xì)胞后逐步轉(zhuǎn)錄翻譯EGFP，所以1224 h EGFP表達(dá)逐漸升高，到24 h最高，提示INPC瞬時轉(zhuǎn)染后，基因表達(dá)檢測最好在轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行. 但同時，被導(dǎo)入外源基因的靶細(xì)胞代謝發(fā)生改變,生長緩慢，轉(zhuǎn)染后有些細(xì)胞正常分裂,而另一些的細(xì)胞周期則延長,這些都影響了轉(zhuǎn)染后瞬時的表達(dá)，所以轉(zhuǎn)染后4872 h EGFP表達(dá)降低. 而高峰等2發(fā)現(xiàn)利用EGFP重組腺相關(guān)病毒

22、轉(zhuǎn)染INPC后，EGFP至轉(zhuǎn)染后72 h表達(dá)最高. 這說明病毒或非病毒載體所負(fù)載的外源基因轉(zhuǎn)染有不同的時程特點.INPC中，雖然非病毒載體的瞬時轉(zhuǎn)染效率不如病毒載體高，但經(jīng)過抗性篩選可極大提高外源基因的表達(dá)，如INPC/EGFP細(xì)胞株EGFP的陽性率可高達(dá)95%. 這是因為INPC是大T抗原轉(zhuǎn)化細(xì)胞，質(zhì)?？稍诩?xì)胞中復(fù)制, 所以易于篩選出高表達(dá)外源基因的穩(wěn)定細(xì)胞克隆.本研究中，EGFPC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INPC后，EGFP表達(dá)迅速而持久，可反映細(xì)胞形態(tài)的全貌，能在活細(xì)胞中直接觀察，具有操作簡便、可視性強(qiáng)并且不需要外源底物等優(yōu)點5-6. EGFPC1質(zhì)粒導(dǎo)入INPC后，不影響其前體細(xì)胞特性，且分化后的細(xì)胞不僅胞體而且細(xì)小的突起仍可發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光. 因此，EGFP可作為INPC良好的示蹤手段.綜上所述，本研究證實Lipofectamine 2000可高效轉(zhuǎn)染INPC. EGFP是INPC理想的示蹤方法之一. 這為神經(jīng)前體細(xì)胞在基因治療中的運用及其移植后的示蹤技術(shù)奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1高峰, 田玉科, 楊輝, 等. 猿腎病毒40大T抗原基因永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建J. 中華麻醉學(xué)雜志, 2005