蛋白定量試劑盒-改良Lowry法

1、蛋白定量試劑盒-改良Lowry法貨號(hào)：P040005描述：許多年來(lái)，Lowry法是最常用也是被引用次數(shù)最多的蛋白質(zhì)定量方法。其原理是在堿性條件和福林酚Folin-Ciocalteu Reagent存在下，銅離子與蛋白質(zhì)形成可溶性蘭色復(fù)合物，在750 nm有最大光吸收值。Lowry法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，對(duì)脂質(zhì)、SDS等干擾物質(zhì)不甚敏感。經(jīng)典Lowry法的主要缺點(diǎn)是，每次蛋白定量之前必須用兩種不同的試劑A和B (Reagent A and B)新鮮配制堿性銅試劑(Reagent C)。堿性銅試劑(Reagent C)不穩(wěn)定因而必須每天新鮮配制；另外，經(jīng)典Lowry法產(chǎn)生的蛋白顏色復(fù)合物穩(wěn)定性較差，在

2、反應(yīng)20-120分鐘內(nèi)變化9.2%；蛋白濃度低于15µg/ml時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的重復(fù)性較差； 本試劑盒采用改良的Lowry法，用單一添加有穩(wěn)定劑的堿性銅試劑代替經(jīng)典Lowry法的試劑A、試劑B、和試劑C。這種改良?jí)A性銅試劑在室溫下穩(wěn)定12個(gè)月以上；測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生的銅蛋白-藍(lán)色復(fù)合物相當(dāng)穩(wěn)定，在2小時(shí)內(nèi)的變化不超過(guò)0.3%；反應(yīng)曲線(xiàn)幾乎100%與原有方案吻合，重復(fù)性佳。因而改良Lowry法蛋白定量試劑盒#P1512，與BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒#P1511一樣，具有非常好的試劑穩(wěn)定性、檢測(cè)靈敏度、和重復(fù)性，并且測(cè)定過(guò)程變得十分簡(jiǎn)捷，是經(jīng)典Lowry法忠實(shí)用戶(hù)的理想選擇。測(cè)定范圍1-2000 &#

3、181;g/ml。可進(jìn)行1000次微量測(cè)定及200次1-ml比色杯測(cè)定。Kit Contents (1000次微量測(cè)定或200次1-ml比色杯測(cè)定)Modified Lowry Protein Assay Reagent, 200 ml, containing cupric sulfate and sodium tartrate. 4ºC2N Folin-Ciocalteu Reagent, 10 ml, 4ºCAlbumin Standard, 4 mg/ml, 1 ml BSA in 0.9% saline and 0.05% sodium azide, 20º

4、;CStorage: Upon arrival store at 4ºC. Product shipped at ambient temperature. Discard any kit reagent that shows discoloration or reddish precipitate. This product is guaranteed for one year from the date of purchase when handled and stored properly.表1 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定和微板測(cè)定方案的加樣量和比例微板(microplate)測(cè)定方案標(biāo)準(zhǔn)比色杯測(cè)

5、定方案孔數(shù)蛋白濃度(µg/ml)標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)樣品體積 (µl)Modified Lowry (µl)Folin phenol (µl)標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)蛋白體積 (ml)Modified Lowry (ml)Folin phenol (ml)12022010122022010132022010142022010151252022010162502022010175002022010181000202201019待測(cè)樣品20220101標(biāo)準(zhǔn)加樣比例1 volume4 volume1/8 volume1 volume4 volume1/8 volume標(biāo)準(zhǔn)加樣舉例50

6、2001說(shuō)明：表的下面兩行是推薦的標(biāo)準(zhǔn)加樣比例及示例，因其加入的樣品量多故靈敏度較高。但為方便加樣操作，用戶(hù)完全可以在靈敏度符合要求的情況下調(diào)整加入的樣品體積范圍為1060 µl；Modified Lowry試劑為200250 µl; 2 N Folin-phenol試劑均為10 µl。測(cè)定范圍1-2000 µg/ml。標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制：用雙蒸水、0.9%生理鹽水、或用待蛋白樣品之緩沖液進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋。蛋白測(cè)定蛋白質(zhì)濃度線(xiàn)性檢測(cè)范圍為501,000 µg/ml。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，用比色計(jì)測(cè)定。微板測(cè)定用96孔板，反應(yīng)終體

7、積250 µl，用酶標(biāo)儀、微板比色儀測(cè)定。1. 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定：將0.12 ml標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本加入管中，加2 ml Modified Lowry試劑混合，室溫10分鐘。加入2 N Folin-phenol試劑80 µl，振蕩混勻，室溫20-30分鐘。750 nm (500-770 nm之間)測(cè)定OD值。2. 微板測(cè)定：將20 µl標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本加入管中，加入220 µl Modified Lowry試劑混合，室溫10分鐘。加入2 N Folin-phenol試劑10 µl，振蕩混勻，室溫20-30分鐘。750 nm (500-770 nm之間)測(cè)

8、定OD值。3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算蛋白濃度。說(shuō)明1. 如樣品含干擾測(cè)定物質(zhì)，可采用BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒，或Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)液體樣品蛋白抽提試劑沉淀后，可去除干擾測(cè)定的物質(zhì)。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)該每次新做。但每一稀釋度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品可預(yù)先配好-20ºC凍存?zhèn)溆?，注意在使用這種非新鮮配制的BSA時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的某一些點(diǎn)偏差較大，說(shuō)明稀釋的BSA已經(jīng)壞掉應(yīng)予重配。3. 欲獲最大靈敏度應(yīng)該在750 nm測(cè)定OD值。500-770 nm間測(cè)定具有良好的線(xiàn)性但靈敏度稍微不同。4. 表1最下面兩行是推薦的標(biāo)準(zhǔn)加樣比例及示例，因其加入的樣品量多故靈敏度較高。但用

9、戶(hù)完全可以在靈敏度符合要求的情況下調(diào)整加樣品體積，使加樣操作更加方便快捷?？蓞⒖嫉捏w積范圍：待測(cè)樣品為1060 µl；Modified Lowry試劑為200250 µl; 2 N Folin-phenol試劑均為10 µl。Table 2: Modified Lowry蛋白測(cè)定兼容性表- A dashed-line entry indicates that the material is incompatible with the assay.Ammonium sulfate -CHAPSO 0.031%2-Mercaptoethanol 1 mMAsparag

10、ine 5 mMOctyl -glucoside 0.031%Potassium thiocyanate 100 mMCesium bicarbonate 50 mMNonidet P-40 (NP-40) 0.016%Acetone 10%Glycine 100 mMSDS 1.0%Aprotinin 10 mg/LHEPES, pH 7.5 1 mMSpan 20 0.25%DMF 10%Imidazole, pH 7.0 25 mMTriton X-100, X-114 0.031%DMSO 10%MES, pH 6.1 125 mMTween-20 0.062%Ethanol 10%S

11、odium acetate, pH 4.8 200 mMTween-80 0.031%Glycerol (Fresh) 10%Sodium azide 0.2%EDTA 1 mMHydrochloric Acid 100 mMSodium bicarbonate 100 mMEGTA 1 mMLeupeptin 10 mg/LSodium chloride 1 MSodium citrate 100 mMMethanol 10%Sodium phosphate 100 mMAscorbic acid 1 mMPhenol Red 0.01 mg/mlTris 250 mMCysteine 1 mMPMSF 1 mMBrij-35 0.031%Dithioerythritol (DTE) -Sodium Hydroxide 100 mMBrij-56, Brij-58 0.062%Dithiothreitol (DTT) -Sucrose 7.5%CHAPS 0.0