重組基因導入受體細胞課件

1、重組基因導入受體細胞二、依賴于重組子結構特征分析篩選二、依賴于重組子結構特征分析篩選( (一一) )快速裂解菌落鑒定分子大小快速裂解菌落鑒定分子大小 主要是根據有外源主要是根據有外源DNA片段插入載體后的重組片段插入載體后的重組DNA與與載體載體DNA之間的大小差異來鑒定重組子。之間的大小差異來鑒定重組子。 分別提取不同轉化子的分別提取不同轉化子的DNA，經瓊脂糖凝膠電泳，由，經瓊脂糖凝膠電泳，由于重組于重組DNA是載體是載體DNA中插入了外源中插入了外源DNA片段，其分片段，其分子量大于載體子量大于載體DNA分子，在瓊脂糖凝膠板上出現的分子，在瓊脂糖凝膠板上出現的DNA帶中，落后的帶是重組帶

2、中，落后的帶是重組DNA的帶。的帶。 這是對重組子進行分析鑒定的最基本、最簡單的方法，這是對重組子進行分析鑒定的最基本、最簡單的方法，直觀快捷，只須獲得質粒直觀快捷，只須獲得質粒DNA分子的粗制裂解液即可分子的粗制裂解液即可進行瓊脂糖凝膠電泳，尤其適用于插入片段較大的重進行瓊脂糖凝膠電泳，尤其適用于插入片段較大的重組子的篩選。組子的篩選。 此方法只用于重組子的初步鑒定。此方法只用于重組子的初步鑒定。重組基因導入受體細胞重組基因導入受體細胞( (二二) )限制性內切核酸酶消化限制性內切核酸酶消化 載體被外源片段插入后，其限制性酶切割產物會發(fā)生載體被外源片段插入后，其限制性酶切割產物會發(fā)生變化，可

3、根據電泳結果來判斷外源基因是否插入了載體及變化，可根據電泳結果來判斷外源基因是否插入了載體及其插入方向。其插入方向。 通過快速裂解菌落鑒定分子大小的方法難以區(qū)分期望通過快速裂解菌落鑒定分子大小的方法難以區(qū)分期望重組子和非期望重組子，因為重組質粒重組子和非期望重組子，因為重組質粒DNA分子中，分子中，質粒載體可能會與一個以上的外源質粒載體可能會與一個以上的外源DNA片段連接重組。片段連接重組。 采用限制性核酸內切酶分析法不僅可以進一步篩選鑒采用限制性核酸內切酶分析法不僅可以進一步篩選鑒定重組子，且能判斷外源定重組子，且能判斷外源DNA片段的插入方向及分子片段的插入方向及分子質量大小等。質量大小等

4、。 基本做法是從轉化菌落中隨機挑選出少數菌落，快速基本做法是從轉化菌落中隨機挑選出少數菌落，快速提取質粒提取質粒DNA，用限制性核酸內切酶酶解，并通過凝，用限制性核酸內切酶酶解，并通過凝膠電泳分析來確定是否有外源基因插入及其插入方向膠電泳分析來確定是否有外源基因插入及其插入方向等。等。重組基因導入受體細胞完全酶切完全酶切 簡單操作過程是，用一種或兩種能將外源簡單操作過程是，用一種或兩種能將外源DNA片片段從重組質粒上切割下來的限制性核酸內切酶酶段從重組質粒上切割下來的限制性核酸內切酶酶解質粒解質粒DNA，凝膠電泳后重組質粒分子較單一載，凝膠電泳后重組質粒分子較單一載體質粒多出一條泳帶，據此將重

5、組子和非重組子體質粒多出一條泳帶，據此將重組子和非重組子分離開來。如果插入片段與載體質粒大小相近，分離開來。如果插入片段與載體質粒大小相近，則最好用合適的酶將之線性化，通過比較大小確則最好用合適的酶將之線性化，通過比較大小確定其是否為重組分子。進一步利用在外源定其是否為重組分子。進一步利用在外源DNA片片段上具有識別位點的一種或一種以上的限制性核段上具有識別位點的一種或一種以上的限制性核酸內切酶酶解重組質粒分子，根據酶切圖譜分析酸內切酶酶解重組質粒分子，根據酶切圖譜分析即可判明插入片段的方向等。即可判明插入片段的方向等。 重組基因導入受體細胞重組基因導入受體細胞重組基因導入受體細胞部分酶切部分

6、酶切 通過一種或數種限制性核酸內切酶對重組質粒通過一種或數種限制性核酸內切酶對重組質粒DNA分子進行部分酶解分析，根據部分酶解產生分子進行部分酶解分析，根據部分酶解產生的限制性片段大小，確定限制性核酸內切酶識別的限制性片段大小，確定限制性核酸內切酶識別位點的準確位置及各個片段的準確排列方式，從位點的準確位置及各個片段的準確排列方式，從而將期望重組子篩選出來。而將期望重組子篩選出來。 部分酶解法較全酶解法簡單易行，兩者通常用于部分酶解法較全酶解法簡單易行，兩者通常用于當載體和外源當載體和外源DNA片段連接后產生的轉化菌落比片段連接后產生的轉化菌落比任何一組對照連接反應任何一組對照連接反應(如只有

7、酶切后的載體或只如只有酶切后的載體或只有外源有外源DNA片段片段)都明顯多時的重組篩選。都明顯多時的重組篩選。 重組基因導入受體細胞三、核酸分子雜交分析三、核酸分子雜交分析( (一一) )分子探針分子探針 分子探針分子探針是指具有同特異性目標分子產生很強的相互作用并可對其相互作用的產物進行有效檢測的DNA分子、RNA分子或蛋白質分子。重組基因導入受體細胞分子雜交分子雜交 核酸雜交：兩種不同來源單鏈核酸雜交：兩種不同來源單鏈DNA或或RNA相互配對的過程。相互配對的過程。 分子雜交：生物大分子之間通過相互作用分子雜交：生物大分子之間通過相互作用結合在一起：核酸之間通過堿基互補配對；結合在一起：核

8、酸之間通過堿基互補配對；蛋白質之間通過抗原、抗體反應；核酸、蛋白質之間通過抗原、抗體反應；核酸、蛋白質之間通過疏水作用，氫鍵進行相互蛋白質之間通過疏水作用，氫鍵進行相互作用。作用。重組基因導入受體細胞 理想的探針標記物應滿足的條件：理想的探針標記物應滿足的條件： 1)1)標記物不會影響探針的主要理化性質，如雜交標記物不會影響探針的主要理化性質，如雜交特異性、雜交穩(wěn)定性及酶反應待征等；特異性、雜交穩(wěn)定性及酶反應待征等； 2)2)檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復性好；檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復性好； 3)3)操作簡便、省時經濟實用：操作簡便、省時經濟實用： 4)4)化學穩(wěn)定性高、易于

9、長期保存；化學穩(wěn)定性高、易于長期保存； 5)5)安全、無環(huán)境污染。安全、無環(huán)境污染。 常用于分子雜交的探針標記物可分為放射性及非常用于分子雜交的探針標記物可分為放射性及非放射性兩大類。放射性兩大類。重組基因導入受體細胞 1. 1.放射性標記物放射性標記物 放射性標記物是指以放射性同位素對核苷酸等進行標記后的放射性標記物是指以放射性同位素對核苷酸等進行標記后的產物，常見的放射性同位素有產物，常見的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其等，其中以中以32P、3H、35S最為常用。最為常用。32P標記的核苷酸具由高放射性，放射自顯影檢測靈敏度高，標記的核苷酸具由高放射性，放射自顯

10、影檢測靈敏度高，但其分辨力低，半衰期短但其分辨力低，半衰期短(14.3d)，探針不能長期保存。，探針不能長期保存。 與與32P標記物相比，標記物相比，35S的放射性較弱，檢測靈敏度低，但其分的放射性較弱，檢測靈敏度低，但其分辨力高，放射自顯影的本底低，適于細胞原位雜交等。半衰辨力高，放射自顯影的本底低，適于細胞原位雜交等。半衰期較長期較長(87.1d)，輻射危害較小，使用較為方便安全。，輻射危害較小，使用較為方便安全。3H主要用于制備高分辨力的原位雜交探針，因其釋放的放射主要用于制備高分辨力的原位雜交探針，因其釋放的放射能很低，放射自顯影的本底也不高但卻需較長的曝光時間。能很低，放射自顯影的本

11、底也不高但卻需較長的曝光時間。半衰期長半衰期長(12.35a)，標記探針可較長時間保存。，標記探針可較長時間保存。 標記物放射性的檢測主要使用蓋革計數器和液體閃爍計數器標記物放射性的檢測主要使用蓋革計數器和液體閃爍計數器等射線探測儀來完成。等射線探測儀來完成。 重組基因導入受體細胞2.非放射性標記物非放射性標記物 非放射性標記物的最大優(yōu)勢是無放射性污染，分辨非放射性標記物的最大優(yōu)勢是無放射性污染，分辨力高，穩(wěn)定性好，可以較長時間保存使用，但與放力高，穩(wěn)定性好，可以較長時間保存使用，但與放射性探針相比，多數非放射性探針的敏感性及特異射性探針相比，多數非放射性探針的敏感性及特異性較差。性較差。 目

12、前已廣泛應用的非放射性標記物有生物素目前已廣泛應用的非放射性標記物有生物素(biotin)標記的核苷酸、地高辛標記的核苷酸、地高辛(digoxigenin)標記的核苷酸和標記的核苷酸和熒光素熒光素(fluorescein)標記的核苷酸等。此外，乙?；鶚擞浀暮塑账岬?。此外，乙?；被贪被?AAF)或乙?；被廛袒蛞阴；被廛?AAIF）、汞離子、）、汞離子、金顆粒、銀顆粒及磺基等標記的核苷酸也能作為標金顆粒、銀顆粒及磺基等標記的核苷酸也能作為標記物使用。記物使用。 重組基因導入受體細胞3.探針標記方法探針標記方法 探針的標記有體內標記及體外標記兩種方法。探針的標記有體內標記及體外標記兩種

13、方法。 體內標記法是以標記化合物作為代謝底物，通過體內標記法是以標記化合物作為代謝底物，通過活體生物或活細胞的體內代謝完成核酸分子標記，活體生物或活細胞的體內代謝完成核酸分子標記，例如在培養(yǎng)基中加入例如在培養(yǎng)基中加入3H-胸苷，就可以標記到生長胸苷，就可以標記到生長在該培養(yǎng)基中的活細胞在該培養(yǎng)基中的活細胞DNA分子上。分子上。 體內標記法受多種因素的限制，且標記活性不高，體內標記法受多種因素的限制，且標記活性不高，一般很少使用。一般很少使用。 重組基因導入受體細胞體外標記體外標記 包括化學法和酶法兩種。包括化學法和酶法兩種。 化學標記法是利用標記物的活性基團與核酸分子中的某種化學標記法是利用標

14、記物的活性基團與核酸分子中的某種基因基因(如磷酸基團如磷酸基團)發(fā)生化學反應而直接將標記物連接到探發(fā)生化學反應而直接將標記物連接到探針分子上，具有簡單快速、標記均勻的特點，尤其適于制針分子上，具有簡單快速、標記均勻的特點，尤其適于制備非放射性標記物的探針。備非放射性標記物的探針。 常用的化學標記法有光敏標記法、化學衍生結合標記法和常用的化學標記法有光敏標記法、化學衍生結合標記法和交叉相連法等。交叉相連法等。 酶標記法則是先將標記物標記在核苷酸上，然后通過酶促酶標記法則是先將標記物標記在核苷酸上，然后通過酶促聚合反應使帶標記的核苷酸摻入到核酸序列中，獲得核酸聚合反應使帶標記的核苷酸摻入到核酸序列

15、中，獲得核酸探針。酶法應用廣泛，適于制備所有放射性標記探針及部探針。酶法應用廣泛，適于制備所有放射性標記探針及部分非放射性標記探針。分非放射性標記探針。 常用的酶法有常用的酶法有DNA缺口平移標記法、缺口平移標記法、DNA隨機引物標記隨機引物標記法、法、DNA末端標記法及末端標記法及PCR標記法等。標記法等。 重組基因導入受體細胞 (1)(1)切口平移標記法切口平移標記法DNA聚合酶聚合酶重組基因導入受體細胞該法標記模板鏈該法標記模板鏈重組基因導入受體細胞(2)(2)隨機引物標記法隨機引物標記法Klenow片段催化片段催化該法標記模板互補鏈該法標記模板互補鏈隨機引物是含有各種可能排列的隨機引物

16、是含有各種可能排列的寡核苷酸片段的混合物寡核苷酸片段的混合物。重組基因導入受體細胞 隨機引物：46 使用隨機引物標記的探針一般長400-600個核苷酸，具多種序列，但都與模板互補。與切口平移法不同的是，該方法標記的是模板互補鏈，而非模板本身。 重組基因導入受體細胞( (二二) )核酸探針雜交分析核酸探針雜交分析 基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸(DNA或或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則高度度等條件下，可按堿基互補配對原則高度特異地復性形成雙鏈。特異地復性形成雙鏈。 該技術也可用于重組子的篩選鑒定，

17、雜交該技術也可用于重組子的篩選鑒定，雜交的雙方是待測的核酸序列和用于檢測的已的雙方是待測的核酸序列和用于檢測的已知核酸片段知核酸片段(稱為探針稱為探針)。 重組基因導入受體細胞核酸分子雜交技術：核酸分子雜交技術： 具一定同源性的兩條具一定同源性的兩條(DNA或或RNA)單鏈在適宜的單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下溫度及離子強度等條件下, 可按堿基互補配對原則特可按堿基互補配對原則特異性地復性，形成異性地復性，形成雙鏈雙鏈。探針探針(已知核酸片斷，單鏈已知核酸片斷，單鏈)待測核苷酸序列待測核苷酸序列(單鏈單鏈)重組基因導入受體細胞 Blot:是將待測生物大分子結合到一定的固是將待測生物大分子結

18、合到一定的固相支持物上的方法。相支持物上的方法。(這些結合在固相支持這些結合在固相支持物上的生物分子即可與存在于液相中的探物上的生物分子即可與存在于液相中的探針分子進行雜交。針分子進行雜交。)固相支持物固相支持物與與有效的轉移方法有效的轉移方法是此技術的是此技術的成敗關鍵。成敗關鍵。重組基因導入受體細胞 基本做法是將待測核酸變性后，用一定的方法將基本做法是將待測核酸變性后，用一定的方法將其固定在硝酸纖維膜其固定在硝酸纖維膜(或尼龍膜或尼龍膜)上，這個過程也上，這個過程也稱為核酸印跡轉移，然后用經標記示蹤的特異核稱為核酸印跡轉移，然后用經標記示蹤的特異核酸探針與之雜交結合，洗去其他的非特異結合核

19、酸探針與之雜交結合，洗去其他的非特異結合核酸分子后，示蹤標記將指示待測核酸中能與探針酸分子后，示蹤標記將指示待測核酸中能與探針互補的特異互補的特異DNA片段所在的位置。片段所在的位置。 根據待測核酸的來源以及將其分子結合到固相支根據待測核酸的來源以及將其分子結合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子雜交檢測法可分持物上的方法的不同，核酸分子雜交檢測法可分為菌落印跡原位雜交、斑點印跡雜交、為菌落印跡原位雜交、斑點印跡雜交、Southern印跡雜交和印跡雜交和Nothern印跡雜交四類。印跡雜交四類。 重組基因導入受體細胞 核酸分子雜交是核酸分析的重要方法，是鑒定重組核酸分子雜交是核酸分析的重要方法

20、，是鑒定重組DNADNA的最通用方法的最通用方法 雜交方法雜交方法 適用范圍適用范圍菌落印跡雜交菌落印跡雜交 檢測細菌體固定在膜上后，檢測細菌體固定在膜上后， 經裂解釋放的經裂解釋放的DNADNA斑點雜交斑點雜交 檢測未經凝膠電泳分離的，檢測未經凝膠電泳分離的， 固定在膜上的固定在膜上的DNADNA或或RNARNA原位雜交原位雜交 直接檢測細胞或組織中的直接檢測細胞或組織中的DNADNA或或RNARNASouthern Southern 印跡雜交印跡雜交 檢測經酶切、凝膠電泳分離的，檢測經酶切、凝膠電泳分離的， 已轉移到膜上的已轉移到膜上的DNA DNA NorthernNorthern印跡雜

21、交印跡雜交 檢測經凝膠電泳分離的，檢測經凝膠電泳分離的， 已轉移到膜上的已轉移到膜上的RNARNA重組基因導入受體細胞重組基因導入受體細胞(1)Southern印跡雜交印跡雜交 Southern blot DNA雜交由雜交由 E.Southern于于1975年提出。年提出。 DNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 轉移到轉移到NC膜上膜上 DNA或或RNA探針雜交探針雜交 放射自顯影顯雜交帶放射自顯影顯雜交帶Southern印跡雜交，有時又稱為印跡雜交，有時又稱為DNA印跡雜交或印跡雜交或Southern DNA印跡雜交等。印跡雜交等。 重組基因導入受體細胞 它是根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠

22、中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過與已標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用以檢測這些被轉移的DNA片段。重組基因導入受體細胞 其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。 該項技術廣泛被應用在遺傳病檢測、DNA指紋分析和PCR產物判斷等研究中。 重組基因導入受體細胞（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因同探針同源雜交的基

23、因DNA片段片段X光底片光底片重組基因導入受體細胞重組基因導入受體細胞Southern雜交紀念發(fā)明者Edward Southern（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析重組基因導入受體細胞Southern DNA 印跡雜交之印跡雜交之X光顯像圖片光顯像圖片 水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作

24、Southern雜交。X光底片中顯現的陽性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列重組基因導入受體細胞 在印跡技術中，硝酸纖維素濾膜是目前應用最廣的一種固在印跡技術中，硝酸纖維素濾膜是目前應用最廣的一種固相支持物，但它也存在一些不足之處：相支持物，但它也存在一些不足之處： 第一、硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結合第一、硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結合DNA的，的，這種結合并不十分牢固。這種結合并不十分牢固。 第二、硝酸纖維素濾膜質地校脆弱，容易碎裂，因此操作第二、硝酸纖維素濾膜質地校脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹慎須小心謹慎(待別是經烘烤后待別是經烘烤后)。 第三、硝酸纖維素濾膜與核

25、酸的結合有賴于高鹽濃度，在第三、硝酸纖維素濾膜與核酸的結合有賴于高鹽濃度，在低鹽濃度時結合低鹽濃度時結合DNA效果不佳，不適宜于電轉印跡法。效果不佳，不適宜于電轉印跡法。 第四、硝酸纖維素濾膜對于小分子質量的第四、硝酸纖維素濾膜對于小分子質量的DNA片段片段(特別特別是小于是小于200bp的的DNA片段片段)結合能力不強。結合能力不強。硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜重組基因導入受體細胞尼龍膜尼龍膜 現在人們更傾向于使用尼龍膜?，F在人們更傾向于使用尼龍膜。 尼龍膜結合尼龍膜結合DNA和和RNA的能力強于硝酸纖維素濾的能力強于硝酸纖維素濾膜，對小分子質量的核酸也能較好地結合，經烘膜，對小分子質量的核

26、酸也能較好地結合，經烘烤或紫外線照射后，這種結合更加牢固。同時尼烤或紫外線照射后，這種結合更加牢固。同時尼龍膜韌性強，操作較方便，對離子濃度要求不高，龍膜韌性強，操作較方便，對離子濃度要求不高，可重復用于雜文。但其雜交信號本底較硝酸纖維可重復用于雜文。但其雜交信號本底較硝酸纖維素濾膜高，這可通過增加預雜交液中的非待異性素濾膜高，這可通過增加預雜交液中的非待異性封閉試劑用量的方法加以克服。封閉試劑用量的方法加以克服。重組基因導入受體細胞(2) Northern印跡雜交印跡雜交 Northern印跡雜交是指將印跡雜交是指將RNA分子變性及電泳分離后、從分子變性及電泳分離后、從電泳凝膠轉移到固相支持

27、物上進行核酸雜交的方法又稱電泳凝膠轉移到固相支持物上進行核酸雜交的方法又稱為為Northern RNA印跡雜交等。印跡雜交等。 該法是在該法是在Southern印跡雜交基礎上發(fā)展起來的，主要針對印跡雜交基礎上發(fā)展起來的，主要針對RNA分子的檢測，基本步驟與分子的檢測，基本步驟與Southern印跡雜交相似。但印跡雜交相似。但RNA分子與分子與DNA分子有所不同，一般不能采用堿變性處分子有所不同，一般不能采用堿變性處理。理。 Northern雜交是研究基因表達的最嚴謹的方法之一，可以雜交是研究基因表達的最嚴謹的方法之一，可以定量分析組織中某一特異定量分析組織中某一特異mRNA的表達豐度，根據其遷

28、移的表達豐度，根據其遷移的位置也可判斷基因分子大小。這一技術應用十分廣泛，的位置也可判斷基因分子大小。這一技術應用十分廣泛，常用于基因表達調控、基因結構及功能、遺傳變異及病理常用于基因表達調控、基因結構及功能、遺傳變異及病理研究。研究。 注意：需在變性條件下電泳，防止注意：需在變性條件下電泳，防止RNA形成二級結構。形成二級結構。重組基因導入受體細胞 在在RNA變性凝膠電泳中常用的變性劑有甲變性凝膠電泳中常用的變性劑有甲醛、乙二醛、羥甲基汞、尿素和甲酰胺等。醛、乙二醛、羥甲基汞、尿素和甲酰胺等。 重組基因導入受體細胞(3) 斑點印跡雜交和狹線印跡雜交斑點印跡雜交和狹線印跡雜交 如果只要檢測克隆

29、菌株、動植物細胞株或轉基因如果只要檢測克隆菌株、動植物細胞株或轉基因個體、器官、組織提取的總個體、器官、組織提取的總DNA或或RNA樣品中是樣品中是否含有目的基因，則可采用斑點印跡雜交否含有目的基因，則可采用斑點印跡雜交(dot blotting)或狹線印跡雜交或狹線印跡雜交(slot blotting)進行檢測，進行檢測，它們是在它們是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的兩種印跡雜交的基礎上發(fā)展的兩種相似的快速檢測特異核酸相似的快速檢測特異核酸(DNA或或RNA)分子的核分子的核酸雜交技術。酸雜交技術。 重組基因導入受體細胞 兩種方法的基本原理和操作步驟相同，即兩種方法的基本原理和操作步

30、驟相同，即通過特殊的加樣裝置將變性的通過特殊的加樣裝置將變性的DNA或或RNA核酸樣品，直接轉移到適當的雜交濾膜上，核酸樣品，直接轉移到適當的雜交濾膜上，然后與核酸探針分子進行雜交以檢測核酸然后與核酸探針分子進行雜交以檢測核酸樣品中是否存在特異性樣品中是否存在特異性DNA或或RNA。兩者。兩者的區(qū)別僅在于呈現在雜交濾膜上的核酸樣的區(qū)別僅在于呈現在雜交濾膜上的核酸樣品分別為圓斑狀和狹線狀。品分別為圓斑狀和狹線狀。 重組基因導入受體細胞 斑點雜交法主要用于基因組中特定基因及斑點雜交法主要用于基因組中特定基因及其表達情況的定性和定量研究。其表達情況的定性和定量研究。 與其他核酸分子雜交法相比，斑點雜

31、交法與其他核酸分子雜交法相比，斑點雜交法具有簡單、快速、經濟等特點，一張濾膜具有簡單、快速、經濟等特點，一張濾膜上可以進行多個樣品的檢測，同時也適用上可以進行多個樣品的檢測，同時也適用于粗提核酸樣品的檢測，但該法不能用于于粗提核酸樣品的檢測，但該法不能用于鑒定所測基因的分子質量，且特異性不高，鑒定所測基因的分子質量，且特異性不高，有一定比例的假陽性。有一定比例的假陽性。 重組基因導入受體細胞(4) 菌落菌落(或噬菌斑或噬菌斑)原位雜交原位雜交 菌落菌落(或噬菌斑或噬菌斑)原位雜交是直接接把菌落或噬菌原位雜交是直接接把菌落或噬菌斑印跡轉移到硝酸纖維色濾膜上，不必進行核酸斑印跡轉移到硝酸纖維色濾膜

32、上，不必進行核酸分離純化、限制性核酸內切酶酶解及凝膠電泳分分離純化、限制性核酸內切酶酶解及凝膠電泳分離等操作，而是經溶菌和變性處理后使離等操作，而是經溶菌和變性處理后使DNA暴露暴露出來并與濾膜原垃結合，再與特異性出來并與濾膜原垃結合，再與特異性DNA或或RNA探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。 由于生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，是按由于生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，是按照其原來的位置不變地轉移到濾膜上，然后在原照其原來的位置不變地轉移到濾膜上，然后在原位發(fā)生溶菌、位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，所以菌落雜變性和雜交作用，所以菌落

33、雜交或噬茵斑雜交隸屬原位雜交范疇。交或噬茵斑雜交隸屬原位雜交范疇。 重組基因導入受體細胞原位雜交原位雜交(in situ hybridization) 將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據檢測物分細胞內原位雜交和雜交，稱原位雜交。根據檢測物分細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交；根據探針與待檢核酸分：組織切片內原位雜交；根據探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交。雜交。 特點特點 能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究 不需從組織或細胞中提取核酸，對

34、含量極低的靶序不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高列靈敏度高 能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)重組基因導入受體細胞 操作步驟操作步驟將菌落或噬菌斑原位轉移或影印到硝酸將菌落或噬菌斑原位轉移或影印到硝酸纖維素薄膜上纖維素薄膜上裂解菌落或噬菌斑并使釋放的裂解菌落或噬菌斑并使釋放的DNA原位原位結合于濾膜上結合于濾膜上固定于濾膜上的固定于濾膜上的DNA與標記探針進行雜與標記探針進行雜交交雜交后濾膜的漂洗及放射自顯影雜交后濾膜的漂洗及放射自顯影重組基因導入受體細胞溶菌、使DNA暴露洗菌體碎片和Pr使單鏈DNA牢固結合在膜上重組基因導入受體細

35、胞重組基因導入受體細胞重組基因導入受體細胞原原位位雜雜交交重組基因導入受體細胞 Southern印跡雜交是先從轉化子中提取總印跡雜交是先從轉化子中提取總DNA，經酶切及瓊脂糖凝膠電泳分帶，轉移到用于雜交經酶切及瓊脂糖凝膠電泳分帶，轉移到用于雜交的膜上，變性處理后再用的膜上，變性處理后再用DNA探針與其雜交。探針與其雜交。 斑點印跡雜交是把提取的轉化子總斑點印跡雜交是把提取的轉化子總DNA直接點樣直接點樣到用于雜交的膜上，變性處理后再用到用于雜交的膜上，變性處理后再用DNA探針與探針與其雜交。其雜交。 菌落（或噬菌斑）原位雜交是直接把菌落或噬菌菌落（或噬菌斑）原位雜交是直接把菌落或噬菌斑印跡轉移

36、到用于雜交的膜上，經溶菌和變性處斑印跡轉移到用于雜交的膜上，經溶菌和變性處理后使理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結合，再用暴露出來并與濾膜原位結合，再用DNA探針與其雜交。探針與其雜交。重組基因導入受體細胞 用用Southern印跡雜交法不僅可以鑒定重組子中含印跡雜交法不僅可以鑒定重組子中含有重組有重組DNA分子，而且還可以知道待檢測的分子，而且還可以知道待檢測的DNA分子（分子（DNA片段）的大小以及待檢測的片段）的大小以及待檢測的DNA片段片段在重組在重組DNA分子中的位置，但是此方法操作比較分子中的位置，但是此方法操作比較麻煩。麻煩。 斑點印跡雜交、菌落（或噬菌斑）原位雜交操作斑點印跡雜

37、交、菌落（或噬菌斑）原位雜交操作比較簡單，但是只能區(qū)別是否含有待檢測重組比較簡單，但是只能區(qū)別是否含有待檢測重組DNA分子的重組子。分子的重組子。 菌落（或噬菌斑）原位雜交已廣泛地用于從基因菌落（或噬菌斑）原位雜交已廣泛地用于從基因組組DNA文庫和文庫和cDNA文庫中篩選含目的基因的重文庫中篩選含目的基因的重組子。組子。重組基因導入受體細胞四、免疫化學分析檢測四、免疫化學分析檢測 如待測的重組子既無任何可供選擇的基因表型如待測的重組子既無任何可供選擇的基因表型特征，又無理想的核酸雜交探針時，可采用免疫特征，又無理想的核酸雜交探針時，可采用免疫學方法篩選重組子。學方法篩選重組子。 免疫學檢測法的

38、基本過程類似于菌落分子雜交，免疫學檢測法的基本過程類似于菌落分子雜交，不同的是該法使用抗體探針，而非不同的是該法使用抗體探針，而非DNA探針。探針。 免疫學檢測法專一性強、靈敏度高，但前提條免疫學檢測法專一性強、靈敏度高，但前提條件是克隆基因可在宿主細胞內表達，并且有目的件是克隆基因可在宿主細胞內表達，并且有目的蛋白的抗體。蛋白的抗體。 免疫學檢測法可分為抗體測定法和免疫沉淀測免疫學檢測法可分為抗體測定法和免疫沉淀測定法。定法。重組基因導入受體細胞( (一一) )抗體測定法抗體測定法1.放射性抗體測定法放射性抗體測定法 基本依據基本依據 一種免疫血清中含有多種類型的免疫球蛋白一種免疫血清中含有

39、多種類型的免疫球蛋白IgG分子，這些分子，這些IgG分子分別與同一抗原分子上不分子分別與同一抗原分子上不同的抗原決定簇特異性結合。同的抗原決定簇特異性結合。 抗體分子或其某部分可牢固地吸附在固體支抗體分子或其某部分可牢固地吸附在固體支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不會持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不會被洗脫掉。被洗脫掉。 通過體外碘化作用，通過體外碘化作用，IgG抗體會迅速地被放抗體會迅速地被放射性射性125I標記上。標記上。重組基因導入受體細胞放射性抗體測定法的操作過程放射性抗體測定法的操作過程 首先將轉化的菌體涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上，長出菌落后，首先將轉化的菌體涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上，長出菌落后，再影印到另一