人肝癌細胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹突狀細胞對T細胞的激活效應

1、人肝癌細胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹突狀細胞對T細胞的激活效應         08-12-26 13:02:00     編輯：studa20                   作者：單鐵英 蘇安英 唐軍民 【摘要】  目的：采用Trizol一步法提取人肝癌細胞總RNA電轉(zhuǎn)染人外周血樹

2、突狀細胞（Dendritic Cell,DC），觀察其對混合T淋巴細胞的體外激活效應。方法：通過密度梯度離心法分離人外周血單核細胞，用細胞因子體外培養(yǎng)誘導其成為DC。Trizol一步法提取人肝癌細胞總RNA。通過電轉(zhuǎn)染法將人肝癌細胞總RNA導入DC內(nèi)；通過混合淋巴細胞實驗，獲取DC激活的特異性效應T細胞。用MTT法測定效應T細胞的增殖率。結(jié)果：電轉(zhuǎn)染方法可將人肝癌細胞總RNA導入DC；電轉(zhuǎn)染前后DC分子表達無顯著差異。轉(zhuǎn)染了人肝癌細胞總RNA的DC可特異的激活T細胞且增殖率明顯增強（P<0.05）。結(jié)論：電轉(zhuǎn)染為人肝癌細胞總RNA導入DC提供技術上的可行性；轉(zhuǎn)染了人肝癌細胞總RNA的DC

3、可特異激活T細胞。 【關鍵詞】  樹突細胞 核糖核酸 轉(zhuǎn)染 肝腫瘤    【ABSTRACT】  Objective:To investigate the activation effect in human peripheral blood Dendritic Cell（DC)electransfecting total RNA of hepatocarcinoma cells extracted by Trizol in vitro.Methods:Monocytes obtained from human peripheral blood

4、 by density guadient centrifugation were induced into DC in the presence of cytokines in vitro.The total RNA of hepatocarcinoma cells was extracted by Trizol and was eletransfected into monocytederived DC.Effective T cells were got by mixed lymphology reaction,in which DC activated T cells gradually

5、,then the proliferation rate of effective T cells could be examined by the MTT method.Results:Electransfection could successfully make RNA into DC.There was no significant difference in DC molecule expression after the electransfection.DC with total RNA of hepatocarcinoma cells could activate specif

6、ically T cells and Proliferation rate was significant high.Conclusion:Electransfection provides a technical possibility to make hepatocarcinoma total RNA into DC.DC with total RNA of hepatocarcinoma cells can activate specifically T cells.    【KEY WORDS】  Dendritic Cells,RNA,Tran

7、sfection,Liver Neoplasms    肝癌的治療手段有多種，但對于進展期肝癌，仍然無法徹底解決腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移的問題。近年來文獻報道腫瘤細胞RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細胞（Dendritic Cell，DC）可以誘導強烈的抗腫瘤免疫，但在用RNA電轉(zhuǎn)染DC的方法尚無報道，我們研究了肝癌細胞株Bel7402總RNA電轉(zhuǎn)染的DC對T細胞的體外激活效應，以探索其治療肝癌的可行性。    1  材料與方法    11一般資料  新鮮人外周血，購自北京市血庫。人肝癌細胞株Bel7402，由

8、北京大學基礎醫(yī)學院免疫學系惠贈。淋巴細胞分離液（Ficoll，1.077g/mL），購自上海試劑二廠。鼠抗人CD14、鼠抗人MHC、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S100，即用型二步法生物素檢測試劑盒（PV9000）、FITC標記的第II抗體工作液購自北京中山生物技術有限公司。TRIZOL試劑盒、綠色熒光蛋白（GFP）mRNA，購自Invitrogen公司。    12  方法    1.2.1  單核細胞、未成熟樹突狀細胞（Immature Dendritic Cell,imDC）的獲得及培養(yǎng) 

9、 取正常人新鮮外周血200mL，以淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，在37和5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)2h，取貼壁細胞即單核細胞，加入RPMI1640液、10%胎牛血清（FCS）和細胞因子rhGMCSF 1000U/mL；rhIL4 500U/mL繼續(xù)培養(yǎng)。第7d收獲的細胞為imDC。    1.2.2  肝癌細胞株Bel 7402總RNA的獲得  常規(guī)方法對肝癌細胞株Bel7402進行培養(yǎng)。以Trizol一步法抽提肝癌細胞總RNA，-20保存。測定260nm和280nm分光光度值，估計其純度并定量，進行RNA電泳觀察其18S和28S條帶完

10、整性。    2008年10月單鐵英等：人肝癌細胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹突狀細胞對T細胞的激活效應第5期2008年10月河北北方學院學報（醫(yī)學版）第5期1.2.3  肝癌細胞總RNA電轉(zhuǎn)染imDC并培養(yǎng)為成熟樹突狀細胞（Mature Dendritic Cell,mDC)  收集誘導7d的imDC，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL。分兩組：一組為人肝癌細胞總RNA、PBS、GFPmRNA分別以50g/mL與imDC在電轉(zhuǎn)杯中混合。均在300V、500uS的條件下進行電轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染后靜置5min，將細胞移入6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。另一組為imDC

11、與上述濃度的人肝癌細胞總RNA混合，兩組均培養(yǎng)3d即為mDC。    1.2.4  T細胞的獲得  按上述獲得單核細胞的方法，取非貼壁細胞即為淋巴細胞，將3×107/mL的淋巴細胞注入尼龍毛柱，放入37，5%CO2培養(yǎng)箱靜置1h。用預溫的37含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液洗柱，洗下的即為T細胞，并將其放入上述培養(yǎng)液和細胞因子rhIL2 500U/mL；于37和5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)待用。    1.2.5  mDC促進T細胞增殖實驗  用T細胞培養(yǎng)液懸浮上述T細胞為2&#

12、215;105/100L，以100L/孔加入96孔板，作為反應細胞。分別取5×106/mL電轉(zhuǎn)染人總RNA的mDC和與肝癌細胞總RNA共培養(yǎng)的mDC作為實驗1組和實驗2組，經(jīng)電轉(zhuǎn)染PBS的mDC作為對照組，以絲裂霉素(25g/mL)滅活45min，用RPMI1640洗3遍，作為刺激細胞。調(diào)整mDC濃度2×103/孔、1×104/孔、2×104/孔分別與T細胞混合，總體積200L/孔，每組設5個復孔。置37，5%CO2孵箱培養(yǎng)120h,于最后18h加入10L MTT(5mg/mL)。收集細胞，酶標儀檢測OD值，結(jié)果以5孔平均值表示。  

13、  增殖指數(shù)為：實驗組OD值反應細胞對照組OD值刺激細胞對照組OD值/反應細胞對照組OD值。    1.2.6  數(shù)據(jù)處理  所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0軟件進行處理，樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。    2  結(jié)果    21  培養(yǎng)imDC的形態(tài)學觀察及表型分析  細胞體積增大，形態(tài)為長梭形或不規(guī)則形，并向四周伸出不規(guī)則狀的突起。表型分析:MHC+、S100+、CD86weak+、CD83weak+。    22

14、60; 肝癌細胞總RNA質(zhì)量檢測  本試驗中經(jīng)Trizol提取的肝癌細胞總RNA，107個細胞可得到48g RNA，經(jīng)RNA電泳，可見到完整的18S和28S條帶，分光光度計檢測OD260/OD280=1.821.8。證明所用RNA未降解，質(zhì)量可靠。    23  電轉(zhuǎn)染人肝癌細胞總RNA后的imDC的形態(tài)學觀察及表型分析  電轉(zhuǎn)染24h后，細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，開始貼壁生長，有少量的死亡細胞呈脫壁生長，形態(tài)變差，但絕大多數(shù)細胞可恢復至電轉(zhuǎn)染前的正常狀態(tài)。24h臺盼藍測電轉(zhuǎn)后細胞死亡率為15%25%。熒光顯微鏡下可見：在450490nm的波長觀察GFPmRNA電轉(zhuǎn)染后的imDC，電轉(zhuǎn)染45h后imDC內(nèi)表達黃綠色熒光，此熒光可持續(xù)表達2430h。細胞計數(shù)：細胞中表達GFP的細胞占細胞總數(shù)的49.07%。