RT-PCR結(jié)合地高辛標(biāo)記定量檢測猴免疫缺陷病毒RNA

1、    RT-PCR 結(jié)合地高辛標(biāo)記定量檢測 猴免疫缺陷病毒 RNA        摘要：從感染猴免疫缺陷病毒(SIV)的恒河猴血漿和培養(yǎng)細(xì)胞株中分別純化病毒 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增SIV gag基因特異的 DNA 片段。將 RT-PCR 產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記，檢測靈敏度比凝膠電泳和斑點雜交提高 100 倍。用已知拷貝數(shù)的 RNA 作為定量標(biāo)準(zhǔn)，可估計待測樣本中 SIV RNA 的拷貝數(shù)。主題詞：SIV/免疫學(xué)；聚合酶鏈反

2、應(yīng)；遺傳標(biāo)記；地高辛/診斷應(yīng)用中分類號：文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3213(1999)01-0066-03Quantitative Detection of Simian Immunodeficiency Virus RNA by RT-PCR Combined with Digoxin LabelingCHEN Zheng-tu，ZENG Qing-ping，F(xiàn)U Lin-chun(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)Abstract:A simian immun

3、odeficiency virus(SIV)gag gene-specific DNA fragment was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)of RNA purified from the serum of SIV-infected marcaque monkey and a cultured cell line. The detection sensitivity of RT-PCR products by digoxin labeling was 100 folds as that

4、 by gel electrophoresis and dot blotting. The copy number of SIV RNA to be measured could be estimated by using a standard RNA whose copy number was known.Key words:SIV/immunology;POLYMERASE CHAIN REACTION;猴艾滋病模型1是當(dāng)今國際公認(rèn)的評價艾滋病治療藥物與疫苗療效及安全性的最佳實驗動物模型，俗有“黃金標(biāo)準(zhǔn)”(gold standard) 之稱2。對用藥后艾滋病模型猴外周血中猴免疫缺陷病毒(S

5、IV) RNA 的定時、定量、動態(tài)監(jiān)測是正確評價藥物療效的重要環(huán)節(jié)之一，也是目前國際上公認(rèn)的病毒負(fù)荷檢測指標(biāo)。以往采用競爭性聚合酶鏈反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (PCR/RT-PCR) 對 DNA/RNA 進(jìn)行定量檢測時，常因凝膠分辨力差或顯示信號不足而導(dǎo)致檢測靈敏度下降，有時還得出“假陰性”結(jié)果。為此，我們采用 RT-PCR 結(jié)合高效地高辛標(biāo)記的雙重放大技術(shù)檢測 SIV RNA，檢測靈敏度大幅度提高，重復(fù)性好，適合進(jìn)行大樣本中 SIV RNA 的定量測定，為今后開發(fā)高效、實用的 DNA/RNA 定量檢測試劑盒打下了良好的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1SIV 核酸提取  感染 SIVmac2

6、51 的恒河猴血漿和感染 SIVmac 的CEMx174 細(xì)胞由本所吳小閑教授提供。采用德國寶靈曼公司病毒核酸提取試劑盒提取 SIV RNA/DNA，所用樣本量為 200 L，核酸提取產(chǎn)物定容為 50 L。1.2RT-PCR 擴增SIV gag 上游引物為5AATGAGGAGGCTGCAGATTGGGACTTG3，下游引物為 5GCACTATCTTGCAATCTGGGTTAGC3，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所合成。擴增反應(yīng)條件為 48 ，45 s，94 ，2 min，然后94 ，30 s，60 ，1 min，68 ，2 min，循環(huán) 40 次，最后 68 ，7min。所用標(biāo)本量為 2 L。標(biāo)

7、準(zhǔn) RNA 及其擴增引物均購自美國普羅麥格公司。采用英國 UVP GDS-760 凝膠聯(lián)機成像系統(tǒng)檢測擴增產(chǎn)物。1.3地高辛標(biāo)記與斑點雜交采用德國寶靈曼公司的地高辛試劑盒及尼龍膜進(jìn)行標(biāo)記、雜交。1.4探針純化按美國普羅麥格公司 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說明書操作。2結(jié)果2.1凝膠電泳檢測靈敏度將標(biāo)準(zhǔn) RNA 的RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)倍比稀釋后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果只在稀釋 10 倍和 102 倍時檢出特異性擴增帶(1)。    2倍稀釋液結(jié)果表明，凝膠電泳檢測 RT-PCR 產(chǎn)物的分辨力較低，即使采用先進(jìn)的凝膠聯(lián)機成像系統(tǒng)，也只能檢測稀釋 102 倍的擴增產(chǎn)物。

8、2.2地高辛標(biāo)記 RT-PCR 產(chǎn)物的顯色靈敏度在對 106 拷貝的標(biāo)準(zhǔn) RNA 進(jìn)行 RT-PCR 擴增后，經(jīng)地高辛標(biāo)記、稀釋和顯色，結(jié)果如2所示。    234倍稀釋液結(jié)果表明，RT-PCR 擴增后標(biāo)記產(chǎn)物稀釋 104 倍后仍能顯色，檢測靈敏度比凝膠電泳提高了 100 倍。根據(jù)起始拷貝數(shù)( 106拷貝)推算，可檢出的 RNA 為 102拷貝。將編號為 115 的猴血漿和感染 SIV 的 CEMx174 細(xì)胞的 RT-PCR 產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記，純化后與標(biāo)準(zhǔn) RNA 的 RT-PCR 標(biāo)記產(chǎn)物共同顯色，結(jié)果從細(xì)胞和血漿標(biāo)本中分別可檢出稀釋 103 倍和

9、104 倍的 SIV RNA (3)。    234倍稀釋液以最低檢測閾值為 102拷貝計算，可反推出細(xì)胞和血漿標(biāo)本中所含 SIV RNA 分別為 10?5 拷貝 和106 拷貝。按濃縮比為 250 計算，兩樣本實際 SIV RNA 濃度分別為 2.5×107/ mL和 2.5×108/ mL。2.3RT-PCR 產(chǎn)物的斑點雜交用地高辛標(biāo)記的來自 CEMx174 細(xì)胞的 RT-PCR 產(chǎn)物作探針，分別與上述血漿和細(xì)胞來源的經(jīng)過倍比稀釋的 RT-PCR 產(chǎn)物雜交，結(jié)果如 4 所示。    6543

10、2拷貝由 4 可見，在 102 稀釋倍數(shù)以下雜交呈陽性，而在 103 倍以上則呈陰性。由起始拷貝數(shù)可知，雜交只能檢測到 104 拷貝以上的 RNA。3討論血漿病毒 RNA水平是檢測體內(nèi)病毒負(fù)荷的常用手段，也是評價藥物療效的重要之一。然而，常用的核酸定量技術(shù)PCR/RT-PCR 一般采用凝膠電泳檢測其擴增產(chǎn)物，當(dāng)起始 RNA 以及隨后的擴增產(chǎn)物濃度較低時，可能會因為凝膠電泳的分辨力差而出現(xiàn)漏檢(假陰性)。因此，無論是采用凝膠成像系統(tǒng)檢測還是電泳后進(jìn)行目測比較，檢測結(jié)果的分析都會受到凝膠分辨力的限制。為了有效地提高檢測水平，我們將 RT-PCR 產(chǎn)物用“高效引導(dǎo)”(high-prime) 地高辛標(biāo)

11、記和顯色系統(tǒng)加以檢測，結(jié)果在RT-PCR 產(chǎn)物稀釋 104 倍后仍能顯色，使檢出 RNA 的靈敏度從 104 拷貝提高到 102 拷貝，提高幅度高達(dá) 100 倍左右，接近質(zhì)控定量 PCR (QC-PCR) 的檢測水平 3。用已知拷貝數(shù)的 RNA 作為參比標(biāo)準(zhǔn)，通過平行的 RT-PCR 擴增和擴增后標(biāo)記及顯色，即可估計待測樣本中的 RNA 拷貝數(shù)。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)靈敏有效和經(jīng)濟實用的 PCR/RT-PCR 定量檢測試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。另外 ，地高辛標(biāo)記比同位素標(biāo)記需時更短，操作更簡單和更安全，二者的檢測靈敏度相近，故地高辛的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛。鑒于斑點雜交的檢測水平與凝膠電泳相當(dāng)，故 RT-PCR 產(chǎn)物的定量不必采用操作較為復(fù)雜的分子雜交法。但是，在定量測定前先采用雜交法排除假陽性，將能確保定量測定結(jié)果的可靠性?；痦椖浚簢易匀豢茖W(xué)基金資助課題(39870725)和廣東省自然科學(xué)基金資助課題(980642)作者簡介：陳征途，女，實驗師；作者單位：陳征途（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）曾慶平（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）符林春（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）參考文獻(xiàn)：1盧耀增，吳小閑，涂新明，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建