腎小管重吸收白蛋白的分子機(jī)制及病理意義 - 鮑浩 - 圖文-

1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 作者單位南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所(南京,210002腎小管重吸收白蛋白的分子機(jī)制及病理意義鮑浩綜述李世軍審校關(guān)鍵詞白蛋白M ega lin Cubilin 分子機(jī)制病理正常人體由于腎小球的有限濾過以及腎小管重吸收功能,尿液中的白蛋白(a l b um in ,A l b 含量極為有限。但當(dāng)免疫或非免疫因素?fù)p害腎小球濾過屏障或者腎小管功能發(fā)生障礙時,尿中A l b 排泄量會顯著增加。研究發(fā)現(xiàn),腎小管間質(zhì)病變進(jìn)展速度與尿蛋白含量有關(guān),降低尿蛋白可延緩腎臟疾病進(jìn)展1。A l b 作為腎小球濾液中最重要的一種蛋白質(zhì),可以激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子B (NF -B ,誘導(dǎo)炎性浸

2、潤、細(xì)胞凋亡以及間質(zhì)纖維化,進(jìn)而導(dǎo)致腎小管萎縮和腎功能減退2。本文旨在對近來有關(guān)腎小管重吸收A lb 的研究作一綜述。腎小球A lb 的濾過3。M aack 通過微穿刺法測定小鼠原尿中A l b 濃度僅為150g /m l ;M ogensen 等則通過賴氨酸阻斷法測定人體A l b 的排泄率約為281g /m in 。此外最近有研究者通過放射標(biāo)記和高效液相色譜法,發(fā)現(xiàn)尿液中含有許多A lb 的代謝片斷,并且不能被放射免疫測定(RI A 等常規(guī)方法檢測。利用這種新的方法,Gudeh it h l u 等測定正常小鼠腎臟A l b 的濾過率約為6.5mg /100g h 4。A lb 重吸收的分

3、子機(jī)制腎小球A l b 的濾過速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過肝臟A lb 的合成速率,所以腎小管對濾液中A lb 的重吸收,對于維持機(jī)體蛋白質(zhì)的平衡尤為重要。研究表明,腎小管對A lb 的重吸收主要發(fā)生在近曲小管,只有少量在亨利袢和遠(yuǎn)端小管完成。而Cub ilin M /ega lin -籠形蛋白途徑是A lb 重吸收的主要通道5。M egali n 結(jié)構(gòu)和功能M egalin 屬于低密度脂蛋白受體家族成員,分子量600kD ,其結(jié)構(gòu)分為三個部分,包括4400個氨基酸構(gòu)成的胞膜外區(qū)、22個氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)以及213個氨基酸構(gòu)成的胞漿內(nèi)尾巴(圖16。胞膜外區(qū)又包括4個由低密度脂蛋白受體A 樣重復(fù)序列組成的配體結(jié)

4、合結(jié)構(gòu)域、17個表皮生長因子(E GF 樣重復(fù)序列以及8個含有YWTD 重復(fù)序列的間隔區(qū)。胞漿區(qū)則包含2個NPXY 基序、數(shù)個SH 3結(jié)構(gòu)域和1個SH 2結(jié)構(gòu)域等。NPXY 基序可以通過和相應(yīng)的銜接蛋白結(jié)合,介導(dǎo)受體-配體復(fù)合物向由籠形蛋白包被的小窩區(qū)聚集,并激活細(xì)胞內(nèi)信號通路。圖1M egali n 和Cub ili n 結(jié)構(gòu)示意圖22M egali n 基因在人體中定位于2q24-q31,最早可在受精后第4日的胚泡中表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)翻譯后加工過程依賴于受體相關(guān)性蛋白(RAP 。RAP 主要起分子伴侶作用,它有助于M ega lin空間折疊結(jié)構(gòu)的形成,并且可以防止M egalin與胞內(nèi)配體過早結(jié)

5、合。M egalin在體內(nèi)表達(dá)于多種上皮細(xì)胞表面,比如回腸上皮細(xì)胞、卵黃囊上皮細(xì)胞、型肺泡上皮細(xì)胞、甲狀旁腺分泌細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞等。人體腎臟中主要見于近端小管刷狀緣、內(nèi)吞泡以及細(xì)胞內(nèi)溶酶體上。Le w is小鼠的足細(xì)胞表面也有M egalin 表達(dá),但在其它品系小鼠和物種中未發(fā)現(xiàn)M egalin 在足細(xì)胞表面表達(dá)7。M egalin是一種多功能的內(nèi)吞受體,它可以和許多不同結(jié)構(gòu)的配體蛋白相結(jié)合。包括:(1維生素結(jié)合蛋白:內(nèi)因子(I F-B12、維生素D結(jié)合蛋白(DBP、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP;(2脂蛋白:脂蛋白B、E、J、H;(3低分子量蛋白及激素:甲狀旁腺素(PTH、胰島素、2微球蛋白(2

6、-MG、免疫球蛋白;(4藥物:氨基糖甙類、多粘菌素B等;(5其它: A l b、RAP、甲狀腺球蛋白(Tg8。其中大多數(shù)配體蛋白分子凈電荷為負(fù)。而研究發(fā)現(xiàn)M egali n與大多數(shù)配體蛋白之間的結(jié)合都存在鈣離子依賴性和正電荷依賴性,故配體分子空間電荷的分布在結(jié)合中起著重要作用。Cubilin結(jié)構(gòu)和功能Cubilin分子量約460kD,無跨膜區(qū),主要通過氨基末端的110個氨基酸殘基錨定在質(zhì)膜表面,故一般需在M ega lin的協(xié)同下才能完成配體內(nèi)吞過程。分子其它部分包括8個E GF 樣結(jié)構(gòu)域和27個CUB結(jié)構(gòu)域(C lr/C ls、Uegf、Bone m o r phogenic prote i

7、n-19。Cubilin基因在人體中定位于10p12.33p13,最早可以在受精后第6日的原始內(nèi)胚層細(xì)胞中表達(dá)。該分子在細(xì)胞中的正常定位依賴于一種分子量約45kD的跨膜蛋白AMN。AMN通過和Cubili n的E GF樣重復(fù)序列相作用形成Cubili n-AMN復(fù)合物,在Cubilin從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向質(zhì)膜移位以及內(nèi)吞過程中,發(fā)揮了重要作用。I m ersl u nd等10曾報道三個挪威家族,由于AMN基因單個核苷酸缺失,導(dǎo)致Cubili n定位異常、腎小管上皮細(xì)胞重吸收障礙,家族中多個成員出現(xiàn)病理性蛋白尿。Cubilin體內(nèi)的分布范圍明顯較M egali n窄,主要見于腎臟、卵黃囊、小腸、胎盤滋養(yǎng)層

8、等處的上皮細(xì)胞表面。配體分子包括:A l b、I F-B12、RAP、免疫球蛋白輕鏈、血紅蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、鈣離子(C a2+、M egalin等。分子結(jié)構(gòu)中的CUB結(jié)構(gòu)域是配體的主要結(jié)合位點。Cub ilin和A lb結(jié)合的kd值約為0.6M。研究表明I F-B12可以競爭性抑制A l b 和Cubili n的結(jié)合,K i值約為1.7mM;兩者的結(jié)合位點都在CUB結(jié)構(gòu)域和EGF樣結(jié)構(gòu)域相連接處的113個氨基酸殘基中,但并不完全一致。此外I F-B12還可與CUB5-8相結(jié)合。M egali n/C ub ilin在腎小管上皮細(xì)胞重吸收A l b 過程中的作用Christensen和W

9、illno w通過對M egali n基因敲除小鼠的研究,發(fā)現(xiàn)小鼠尿液中蛋白質(zhì)排泄量顯著增加,近端小管上皮細(xì)胞表面質(zhì)膜內(nèi)陷小窩和內(nèi)吞泡減少,但水、電解質(zhì)、葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)的排泄量未發(fā)生變化11。同樣在Dent病(Dents disease患者也發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞M ega-lin表達(dá)量的減少和內(nèi)吞障礙。Cub ilin在腎小管上皮細(xì)胞重吸收中的作用,最初則是在“I m erl u ndG räsbeck綜合征”患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。這類患者由于Cub ilin功能缺陷,在出現(xiàn)腸粘膜上皮細(xì)胞I F-B12吸收障礙、巨幼細(xì)胞性貧血的同時,往往伴有明顯的蛋白尿12。W ah lsted t-F

10、r oberg 等13就報道兩個芬蘭家族,一個因CUB8處單個氨基酸發(fā)生置換,臨床可出現(xiàn)輕重不一的蛋白尿;另一個因CUB6處點突變產(chǎn)生新的剪切位點,臨床則均表現(xiàn)為大量蛋白尿。所以臨床蛋白尿的水平可能與基因突變類型和Cub ilin分子功能受影響的程度有關(guān)。此外,在AMN基因發(fā)生變異的實驗狗體內(nèi),由于Cubili n定位異常,通過熒光示蹤法同樣可以發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞表面白蛋白內(nèi)吞障礙14。Cub ilin分子結(jié)構(gòu)上缺少跨膜結(jié)構(gòu)域,因此在和配體分子A lb結(jié)合后,需要在M egalin的協(xié)同下才能完成配體內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。免疫膠體金技術(shù)可以清楚顯示Cub ilin和M egali n在腎臟中的分

11、布基本一致,主要位于近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣。體外實驗也證實,M egalin和Cubilin能夠高親和力結(jié)合,結(jié)合位點可能在CUB1-2上;同時還發(fā)現(xiàn)抗M ega lin抗體和抗M egali n寡核苷酸片斷可以抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白(ApoA-I/H DL等Cubilin配體的重吸收14。當(dāng)然也有研究者通過瓊脂糖層析法發(fā)現(xiàn)M egali n可以和A l b直接結(jié)合,所以不能排除M ega-lin在體內(nèi)單獨發(fā)揮內(nèi)吞作用。當(dāng)A lb和M ega li n/C ub ilin受體結(jié)合后,質(zhì)膜發(fā)生內(nèi)陷,然后分離形成內(nèi)吞泡。小的內(nèi)吞泡會相互融合,或者與已經(jīng)存在的大內(nèi)吞泡融合。由于內(nèi)吞泡中pH 的下降,

12、受體和配體分離,并以出芽的方式形成受體小囊泡,返回腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)膜表面,受體重復(fù)利用,但也有部分受體被轉(zhuǎn)運至溶酶體降解。剩余內(nèi)吞泡中的配體被轉(zhuǎn)運至溶酶體或進(jìn)入胞質(zhì)溶膠以降解、利用(圖2。體外實驗,通過對OK 細(xì)胞(opossum kidney cells 重吸收白蛋白過程的研究,發(fā)現(xiàn)G 蛋白通過PI 3K 和蛋白激酶參與了內(nèi)吞小泡的轉(zhuǎn)運過程,并在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用15 。圖2M egali n /Cub ili n 介導(dǎo)的白蛋白重吸收過程22M egalin /C ubilin 對A l b 的重吸收具有低親和力、高容量的特點,重吸收速率主要取決于受體表達(dá)量和受體循環(huán)速率。所以腎小

13、管中液體流速和小管長度對A l b 重吸收尤為重要。研究證實,在小鼠和實驗兔體內(nèi),近端小管越短,流速越快,A lb 重吸收率就越低16。同樣由于其高容量的特點,大量蛋白尿時,由于受體循環(huán)加速,A l b 重吸收量會顯著增加,可以在尿液中只檢測出A l b 分子少量增加。A lb 重吸收的病理意義W oh lfarth 等17曾證實重吸收活性低的腎小管上皮細(xì)胞,A l b 所激發(fā)的膠原合成水平也較低。Gbu r ek 則證實M ega lin 表達(dá)缺陷的細(xì)胞對血紅蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性低。提示M ega lin /C ubilin 所介導(dǎo)的A l b 重吸收可能在小管間質(zhì)慢性化病變中發(fā)揮了作用

14、。M egalin 胞漿內(nèi)尾巴與細(xì)胞內(nèi)多個配體結(jié)合。尿中A l b 等物質(zhì)與M egali n 結(jié)合后,M egalin 空間構(gòu)型發(fā)生改變,可以啟動細(xì)胞內(nèi)多條信號通路,包括劑量依賴性上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞Fas (CD95和Fas 相關(guān)死亡域(FADD 的表達(dá),增加半胱氨酸蛋白酶8(caspase 8的活性,同時NF -B 的DNA 結(jié)合活性也呈濃度依賴性增加。隨之會誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表達(dá)許多促炎和促纖維化因子,包括RANTES 、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP -1、白介素8(I L -8、F r acta l k ine 、腫瘤壞死因子(TNF -、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF -、膠原蛋白等;并導(dǎo)致上皮細(xì)胞表

15、面整合素表達(dá)量改變,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,間質(zhì)發(fā)生慢性纖維化18。有研究者還發(fā)現(xiàn)A lb 尿誘發(fā)的TGF -可反饋性促進(jìn)腎小球A l b 的濾過,最終導(dǎo)致尿A l b 排泄量進(jìn)一步增加19。此外,與A lb 結(jié)合的配體成分以及腎小管上皮細(xì)胞表面其它一些隸屬于低密度脂蛋白受體家族的受體也參與了跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究證實低密度脂蛋白受體、極低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白、載脂蛋白E 受體2通過其尾側(cè)的NPXY 基序和胞漿中Dab1等配基蛋白結(jié)合,均可以活化胞內(nèi)信號通路,參與小管間質(zhì)病變過程20。另外一些研究者發(fā)現(xiàn),脫脂化的A lb 與上皮細(xì)胞受體結(jié)合后,有助于減少

16、腎臟局部氧自由基的產(chǎn)生,延緩腎功能減退。所以,A l b 重吸收過程是引發(fā)保護(hù)還是損害效應(yīng),可能一定程度上還取決于A l b 所攜帶的分子類型。基于上述認(rèn)識,可以考慮通過抑制級聯(lián)反應(yīng)的某些步驟,以減少A lb 重吸收引發(fā)的腎臟損害。由于M egalin 和Cubilin 是多種配體的受體,參與了維生素的重吸收和代謝等重要生理過程,所以完全阻斷細(xì)胞表面受體會產(chǎn)生很多不良反應(yīng),不是一個理想的方法。近來有研究者通過轉(zhuǎn)染MCP -1拮抗劑或短型IkB 來抑制細(xì)胞內(nèi)NF -,達(dá)到了減少A l b 介導(dǎo)小管間質(zhì)損害的目的21。還有研究發(fā)現(xiàn),目前臨床普遍使用的腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻斷劑不僅可以減少尿液蛋白排

17、泄,也可以降低A lb 對腎小管上皮細(xì)胞的活化作用。結(jié)語:腎小球濾液中的A l b ,主要在近端小管通過M egalin /C ubilin 途徑重吸收。當(dāng)濾過屏障異常、尿中A lb 顯著增加時,M ega lin /C ubilin 以及其它受體介導(dǎo)的通路高度活化,細(xì)胞分泌大量炎癥和促纖維化因子,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)小管間質(zhì)慢性化病變。目前已有研究者考慮通過轉(zhuǎn)染MCP-1拮抗劑或短型IkB等方法阻斷整個級聯(lián)反應(yīng)的某些步驟,以減少A l b所介導(dǎo)小管間質(zhì)損害,但具體臨床應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1N akaji m a H,Tak enakaM,Kai mori J Y,et al.G ene

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