病理組織學診斷檢材的制備技術(shù)

1、病理組織學診斷檢材的制備技術(shù)一、組織的固定 凡需要進行病理組織學檢查的標本（器官或組織），于離體（活體或尸體）后，應盡快置放（浸 泡）于裝有足夠量固定液的容器中固定。固定液量應為被固定標本體積的 510倍。置放標本的 容器大小視標本和固定液的體積而定，應適當大一些。臨床科室切取的標本置放于容器中固定后， 應盡快送交病理科繼續(xù)固定。未能及時、充分固定的干涸或腐敗標本不能再進行固定和用于制做 切片。 常規(guī)固定液為 4%中性甲醛（10%中性福爾馬林），應預先多量配制貯存，以備隨時使用。小 標本的固定時間為 46 小時，大標本為 1824小時或更久。 根據(jù)病理學特殊檢查（特殊染色和組織化學染色、免疫組

2、織化學染色和原位核酸分子雜交染色、 16電鏡觀察等）的需要，應選用其他適宜的固定液進行固定參見后述的“固定液的常用種類和 制備”。 器官、組織固定的基本方法 另參見本章第四節(jié)（病理標本的肉眼檢查和組織學切片取材技術(shù)） 1食管、胃、腸、膽囊、膀胱等空腔器官：依規(guī)范方法剪開后，按其自然狀態(tài)平鋪于硬紙板上 （重點暴露黏膜面或內(nèi)表面的病變處），并用大頭針將標本邊緣處固定于紙板上，然后放入 4% 中性甲醛中固定（黏膜面或內(nèi)表面朝向容器的液面，并覆蓋薄層脫脂棉）。 2肝、脾：由器官背面，沿其長軸每間隔 1.5縱向平行剖開，切成數(shù)片。將每片肝或脾 輕輕地平放于裝有 4%中性甲醛的容器中，容器底面襯以脫脂棉。

3、應避免標本彎曲和相互間的疊 壓。 3肺葉：放入固定液中的肺葉漂浮于液面，需在肺表面覆蓋薄層脫脂棉。必要時從支氣管注入 適量 4%中性甲醛。 4腎：沿腎外緣中線朝腎門方向作一水平切面（深達于腎盞），再行固定。 5淋巴結(jié)：先用 4%中性甲醛固定 1小時后，再沿其長軸切成數(shù)片（厚 2 3mm），繼續(xù)固定。 6骨組織：先鋸成小片（若是長骨應作橫向鋸片） ，在 4%中性甲醛中固定 24 小時后，再進行 脫鈣。 7微小組織或液體沉淀物：先用拭紙或濾紙妥為包裹（需用大頭針扎牢），然后放入專用小盒 內(nèi)進行中性 4%甲醛固定，以防檢材遺失。 8凡進入固定程序的標本必須連帶其正確無誤的病理檢驗號（病理號）。 多數(shù)

4、固定液對人體有害，需要防護，必須在封閉的通風條件下進行操作。 組織塊的切取和固定：由較大標本切取用于制作切片的組織塊（取材）時，應與標本的斷面 ×11.5以內(nèi)。切取組織塊 的形狀，在充分包括肉眼病變的前提下盡量規(guī)則些（例如方形、矩形、三角形等）；由一個標本 切取的多塊組織的形狀有所不同，便于蠟塊與其相應切片的核對。 固定組織塊的固定液量， 一般應為組織塊總體積的 510倍以上。室內(nèi)常溫（25左右）下的固定時間為 324小時； 低溫（4）下的固定時間應延長。固定組織塊的容器要大一些。組織塊固定期間需要間斷 地輕搖或攪動固定液以利于固定液的滲入。 常用固定液 14%中性甲醛（10%中性福

5、爾馬林）固定液 甲醛（40%） 100 ml 無水磷酸氫二鈉 6.5g 磷酸二氫鈉 4.0g 蒸餾水 900ml 2乙醇甲醛（酒精福爾馬林，AF）固定液 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml 說明一般組織塊經(jīng)乙醇甲醛固定 12小時后，即可移入 95%乙醇內(nèi)脫水。 3Carnoy 固定液 無水乙醇 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 說明組織化學染色的常用固定液，組織經(jīng) Carnoy 液固定 12 小時后，即可移入無水乙醇 中脫水。 4Zenker 固定液 17升汞 重鉻酸鉀 硫酸鈉 1.0g 蒸餾水（加至） 100ml 說明配制本液時，先將升汞溶于蒸餾水中、加溫至 405

6、0溶解后，再加入重鉻酸鉀，最 后加入硫酸鈉，貯存待用。使用前加入 5ml 冰醋酸，混合。組織塊需固定 1224小時。切片染 色前，需進行脫汞沉淀處理。 5Bouin 固定液 飽和苦味酸水溶液（約 1.22%） 75ml 甲醛（40%） 25ml 冰醋酸 5ml 說明本液臨用時配制。組織塊置于 Bouin 液固定 1224小時即可（小塊組織只需固定數(shù)小 時） 。經(jīng) Bouin 液固定的組織被苦味酸染成黃色，可用水洗滌 12小時后進入乙醇脫水（兼脫色）。 不必將組織中的黃色除凈（殘存于組織中的苦味酸無礙染色） 6過碘酸賴氨酸多聚甲醛固定液（PLP） A液：賴氨酸 蒸餾水 50ml 0.1mol/L

7、 磷酸鹽緩沖液(pH7.4) 50ml B液：8%多聚甲醛水溶液 100ml 說明本液臨用時配制：取 A 液 3 份、B 液 1 份，混合后，加入過碘酸鈉，使液體終濃度為 2%。組織塊在 4下固定3654小時。本液對細胞結(jié)構(gòu)和抗原性保存較好。 7B5（醋酸鈉升汞甲醛）固定液 無水醋酸鈉 1.25g 升汞 6.0g 蒸餾水 90ml 說明將以上物質(zhì)混合、溶解，使用前加入甲醛 10ml。本液多用于固定淋巴組織。染色前應 進行脫汞沉淀處理。如不加甲醛稱為 B4固定液（蒸餾水為 100 ml）。 8丙酮固定液 冷丙酮（4）固定液用于酶組織化學染色。細胞標本的免疫組化染色也常用冷丙酮固定 10 分 鐘。

8、 青青靈芝草2010-01-31 22:30二、常規(guī)石蠟包埋組織切片（常規(guī)切片）的制備 組織塊依序進行：水洗，脫水，透明，浸蠟，包埋和切片。 組織切片制備及其HE 染色過程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蠟等為 易燃、有毒物，必須專人管理，2m以內(nèi)不得有明火，局部環(huán)境應有良好的通風和消防設(shè)施。 常規(guī)切片的手工操作（步驟次序和各步驟的持續(xù)時間） 1水洗：用流水沖洗已經(jīng)固定的組織塊 30min。 2脫水（常溫下） （1）乙醇甲醛（AF）液固定 60120min （2）80%乙醇 60120min （3）95%乙醇 60120min （4）95%乙醇 60120min （5）無水乙醇 60120min

9、 （6）無水乙醇 60120min （7）無水乙醇 60min 18注意事項未經(jīng)充分固定的組織不得進入脫水程序。用于脫水的試劑容積應為組織塊總體 積的 510 倍以上。自低濃度乙醇向高濃度乙醇逐級移進脫水。脫水試劑應及時過濾、更 換（500ml乙醇可用于 500個組織塊脫水；加入硫酸銅的無水乙醇變藍時，提示需要更換） 。 較大組織塊的脫水時間長于較小者，應將兩者分開進行脫水。組織置于無水乙醇內(nèi)的時間不宜 過長（以免硬化）。丙酮脫水性能強，會使組織塊過縮、硬脆，不宜用以替代無水乙醇。 3透明 （1）二甲苯 20min （2）二甲苯 20min （3）二甲苯 20min 注意事項二甲苯的容積應為組

10、織塊總體積的 510 倍以上。組織塊在二甲苯中透明的 時間不宜過長（以防組織硬、脆），并依不同種類組織及其大小而異；組織呈現(xiàn)棕黃或暗紅色透 明即可。二甲苯應及時過濾、更換。組織經(jīng)二甲苯適度處理后不顯透明時，常提示該組織的 固定或脫水不充分，應查找原因并妥善處理。 4浸蠟 （1）石蠟（4550） 60min （2）石蠟（5658） 60min （3）石蠟（5658） 60min 注意事項熔化石蠟必須有專人負責，必須在熔蠟箱內(nèi)或水浴中（70 ）進行，不得用明火加溫。熔蠟的容積應為組織塊總體積的 510 倍以上。組織塊經(jīng)二 甲苯適度透明后方可轉(zhuǎn)入浸蠟過程，應盡可能減少將透明后組織塊表面的二甲苯帶入熔

11、蠟中。 浸蠟時間適宜，過短時浸蠟不充分（組織過軟），過長時組織硬脆。熔蠟應及時過濾、更換。 5包埋 （1）先將熔化的石蠟傾入包埋模具中，再用加熱的彎曲鈍頭鑷子輕輕夾取已經(jīng)過浸蠟的組織塊， 使組織塊的最大面或被特別指定處的組織面向下埋入熔蠟中；應將組織塊平正地置放于包埋模具 底面的中央處；包埋于同一蠟塊內(nèi)的多塊細小組織應彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮膚和 黏膜組織必須垂直包埋（立埋）。 （2）將與組織塊相關(guān)的病理號小條置入包埋模具內(nèi)熔蠟的一側(cè)。 （3）待包埋模具內(nèi)的熔蠟表面凝固后，即將模具移入冷水中加速凝固。 （4）從包埋模具中取出凝固的包埋蠟塊（簡稱蠟快），用刀片去除組織塊周圍的過多石蠟（

12、組 織塊周圍保留 12mm石蠟為宜）。將包埋蠟塊修整成為規(guī)則的正方形或長方形。 （5）將病理號小條牢固地烙貼在蠟塊一側(cè)（編號應清晰可見）。 （6）把修整好的蠟塊烙貼在支持器上，以備切片。 （7）使用包埋機的方法按有關(guān)廠商的說明書操作。 （8）注意事項 應將組織塊嚴格分件包埋。包埋時一定要首先認真核對組織塊的病理號（包括亞號） 、塊 數(shù)和取材醫(yī)師對包埋面的要求，準確地包入相應的病理號小條。發(fā)生包埋差錯時，必須立即與取 材醫(yī)師和病理科當班負責人取得聯(lián)系，及時處置。 必須嚴防各種異物污染，勿將無關(guān)組織（包括縫線、紙屑或其他異物（尤其是硬質(zhì)異物）埋入 蠟塊內(nèi)。 包埋過程要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前

13、熔蠟凝固。 包埋用的熔蠟應純凈，熔點適宜。浸蠟用軟蠟（熔點為 4550），浸蠟、和包埋用蠟 均用硬蠟（熔點為 5658）。 包埋用熔蠟使用前應將先靜置沉淀、過濾。 熔蠟時不得使用明火，以防燃燒。包埋用熔蠟的溫度應<65；包埋用的鑷子不可加溫過高， 19以免燙傷組織。 6切片 （1）切片刀或一次性切片刀片必須鋒利。使用切片刀時，必須精心磨備（在低倍顯微鏡下確認 刀刃無缺口）；使用一次性切片刀片時，應及時更新。 （2）載玻片必須潔凈、光亮。 （3）將切片刀或刀片安裝在持刀座上（以 15°為宜）。 （4）將蠟塊固定于持支持器上，并調(diào)整蠟塊和刀刃至適當位置（刀刃與蠟塊表面呈 5

14、6;夾角）。 （5）細心移動刀座或蠟塊支持器，使蠟塊與刀刃接觸，旋緊刀座和蠟塊支持器。 （6）修塊（粗切）：用右手勻速旋轉(zhuǎn)切片機輪，修切蠟塊表面至包埋其中的組織塊完整地全部 切到。修塊粗切片的厚度為 1520m。注意：對于醫(yī)囑再次深切片（特別是在原切片中發(fā)現(xiàn) 了有意義病變而進行的深切片），應盡量少修塊，以盡量好地獲得有關(guān)病變的連續(xù)性。 （7）調(diào)節(jié)切片厚度調(diào)節(jié)器（一般為 46m），進行切片，切出的蠟片應連續(xù)成帶，完整無缺， 厚度適宜（35m）、均勻，無刀痕、顫痕、皺折、開裂、缺損、松解等。 （8）以專用小鑷子輕輕夾取完整、無刀痕、厚薄均勻的蠟片，放入伸展器的溫水中（45左右） ， 使切片全面展開

15、。注意：必須水溫適宜、潔凈（尤其是水面）；每切完一個蠟塊后，必須認真清 理水面，不得遺留其它病例的組織碎片，以免污染。 （9）將蠟片附貼于涂有蛋白甘油或經(jīng) 3氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxy silane，APES)處理過的載玻片上（HE 染色時酌情使用，可省略，必要時）。蠟片應置放在載玻 片右（或左）2/3 處的中央，留出載玻片左（或右）1/3 的位置用于貼附標簽。蠟片與載玻片之 間無氣泡。 （10）必須立即在置放了蠟片的載玻片一端（待貼標簽的一端） ，用優(yōu)質(zhì)記號筆或刻號筆準確、 清楚標記其相應的病理號（包括亞號）。注意：必須確保載玻片上的病理號與相關(guān)組織石蠟

16、包埋 塊的病理號完全一致，不得錯寫或漏寫病理號。 （11）將置放了蠟片的載玻片呈 45角斜置片刻；待載玻片上的水分流下 后，將其置于烤箱中烘烤（6062，3060min），然后即可進行染色。 （12）注意事項 組織塊固定、脫水、透明和浸蠟的質(zhì)量直接影響切片制備。切片過程中遇到的困難首先應注意 從切片前的上述各環(huán)節(jié)中尋找原因。 切片機的質(zhì)量是制備優(yōu)質(zhì)切片的重要前提。要使用質(zhì)量好的切片機，規(guī)范地切片，精心維護切 片機。 經(jīng)由內(nèi)窺鏡、穿刺等獲取的細小組織，應間斷性連續(xù)切片多面（一般至少制備 6 張蠟片，必 要時制備更多張）。需作特殊染色、免疫組化染色等的病例，可預制蠟片備用。 切片人員應細心操作，防

17、范被切片刀具割傷。 常規(guī)切片的自動組織處理機操作（步驟次序和各步驟的持續(xù)時間，總計需要 14小時） 1乙醇甲醛（AF）固定液 2×60min 295%乙醇 2×60min 395%乙醇 2×60min 4無水乙醇 60min 5無水乙醇 60min 6二甲苯 30min 7二甲苯 30min 8石蠟 30min 9石蠟 60min 10石蠟 90min 2011包埋 （1）手工常規(guī)包埋：參見上述的“手工操作”項。 （2）用組織包埋機時，按有關(guān)廠商說明書的規(guī)定操作。 13切片：參見上述的“手工操作”項。 14注意事項 （1）必須按有關(guān)說明書的規(guī)定，使用和維護自動組織

18、處理機、包埋機、磨刀機、封蓋玻片機等 儀器等。 （2）要嚴防因停電、機械故障等造成的組織塊損壞。一旦發(fā)生此類事故，必須及時向科主任報 告，盡快采取應急措施妥善處置。 （3）使用自動組織處理機時：合理設(shè)定的運行時間（充分利用夜間）。固定、脫水的環(huán)境 溫度不得>30。乙醇、二甲苯和熔蠟的容積，要大于組織塊總體積的 510倍以上，并應經(jīng) 常過濾，保持清潔；應經(jīng)常檢查試劑的濃度，及時更新。對于多量組織塊，可按其大小分批進 行處理；小塊組織可適當縮短處理時間。 青青靈芝草2010-01-31 22:30三、快速石蠟包埋組織切片的制備 煮沸固定切片法 1固定：切取大小適宜（厚度<2mm）的組織

19、塊，盡快置入裝有 58ml 10%中性 4甲醛的試 管中煮沸 1min，然后已入冷水中。 2脫水 （1）將已經(jīng)煮沸固定的組織塊取出，用刀片將其厚度修切至<1.5mm，隨 即置入盛有 58 ml丙酮的試管中，煮沸 2 min，然后將丙酮傾棄。 （2）再向該試管中重新加入 58 ml丙酮并煮沸 2min。如此重復34 次。 3浸蠟：將已經(jīng)丙酮脫水的組織塊由試管中取出，用吸水紙去除其表面液體，隨即置入 7580 熔化的石蠟中，待組織塊下沉、不再出現(xiàn)氣泡時（約需 30s），即可包埋。 4包埋、切片和染色。 （1）用熱鑷子將預制的蠟塊表面熔化，埋入已經(jīng)浸蠟的組織塊。 （2）待埋入組織塊的蠟塊表面凝

20、固后，即用載玻片輕壓蠟塊表面片刻，使 蠟塊表面平整。 （3）將蠟塊置入冰水中，使其變硬。 （4）迅速切片，裱片后用吸水紙去除載玻片上的水分。 （5）將載玻片用火焰烘干（勿距火焰太近）。 （6）迅速進行 HE 染色。 5注意事項 （1）為了盡量縮短制片時間，必須預先作好有關(guān)準備工作，備齊取材用具、試管、固定液、丙 酮、酒精燈、火柴（或其他引火器）、包埋用蠟塊、載玻片和染色試劑等，放在固定部位待用。 （2）全部制片過程一般在 2025min內(nèi)完成。 （3）制片后剩余組織塊應作常規(guī)石蠟包埋切片染色，進一步診斷。 （4）含脂肪較多的組織，須經(jīng)多次丙酮處理。 （5）用于組織固定、脫水、透明的試劑和浸蠟用

21、的石蠟應及時過濾、更換。 （6）丙酮、乙醇、二甲苯等為易燃物，進行上述各項流程時，2m 距離內(nèi)不得存在明火。加溫 脫水和浸蠟過程必須應用隔水溫箱，不得使用干烤箱操作。青青靈芝草2010-01-31 22:31蘇木素伊紅（HE）染色 HE染色是應用最廣泛的組織病理學常規(guī)染色技術(shù)。 染色程序 1石蠟切片HE染色（常規(guī) HE 染色） （1）二甲苯 510min （2）二甲苯 510min （3）無水乙醇 13min （4）無水乙醇 13min （5）95%乙醇 13min （6）95%乙醇 13min （7）80%乙醇 1min （8）蒸餾水 1min （9）蘇木素液染色 510min （10）流水

22、洗去蘇木素液 1min （11）1%鹽酸-乙醇 13s （12）稍水洗 12s （13）返藍（用溫水或 1%氨水等） 510s （14）流水沖洗 12min （15）蒸餾水洗 12min （16）0.5%伊紅液染色 13min （17）蒸餾水稍洗 12s （18）80%乙醇 12s 23（19）95%乙醇 23min （20）95%乙醇 23min （21）無水乙醇 35min （22）無水乙醇 35min （23）石炭酸-二甲苯 35min （24）二甲苯 35min （25）二甲苯 35min （26）二甲苯 35min （27）中性樹膠封固 注：（12）和（13）項可省去，但（14）的沖

23、水時間需延長至 1015min（細胞核顯示更清 晰）。 （23）項可用無水乙醇代替；北方地區(qū)可省略。 2冰凍切片HE染色 （1）冰凍切片固定 1030s （2）稍水洗 12s （3）蘇木素液染色（60） 3060s （4）流水洗去蘇木素液 510s （5）1%鹽酸-乙醇 13s （6）稍水洗 12min （7）返藍（用溫水或 1%氨水等） 510s （8）流水沖洗 1530s （9）0.5%伊紅液染色 12min （10）蒸餾水稍洗 12min （11）80%乙醇 12min （12）95%乙醇 12min （13）無水乙醇 12min （14）無水乙醇 12min （15）石炭酸-二甲苯 23min （16）二甲苯 23min （17）二甲苯 23min （18）中性樹膠封固 注：（7）和（8）項可省去，但（9）的沖水時間需延長至 1015min（細胞核顯示更清晰）。 （15）項可用無水乙醇代替；北方地區(qū)可省略。 染色結(jié)果：細胞核呈藍色，細胞漿、肌纖