p16基因與肝癌的研究近況

1、p16基因與肝癌的研究近況         【關(guān)鍵詞】  腫瘤腫瘤發(fā)生的最重要原因是細(xì)胞增殖失控，這表明調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的分子機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生1。細(xì)胞周期的運(yùn)行主要依靠一組使其進(jìn)入分裂期的依賴性細(xì)胞周期蛋白激酶（CDKS）的作用。CDKS只有和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）結(jié)合才能被激活，從而使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。同時(shí)，細(xì)胞中存在CDKS的抑制因子，抑制其活性，阻止細(xì)胞分裂。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的CDK抑制分子（CDK inhibitor，CDI），對(duì)細(xì)胞周期有負(fù)調(diào)節(jié)作用。p16基因是人們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接作用于細(xì)胞周

2、期抑制細(xì)胞分裂的抑癌基因。p16基因編碼的蛋白即p16蛋白，為CDKS和Cyclin結(jié)合的抑制蛋白。p16基因的改變（頻繁雜合缺失、純合缺失、突變及甲基化13）可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度分裂從而向惡性發(fā)展。p16基因的研究已成為當(dāng)前腫瘤分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。1  p16基因的結(jié)構(gòu)特性1993年，Serrano等4利用酵母雙雜合蛋白相關(guān)性篩選法（yeast two-hybrid protein interaction screen）研究與CDK4作用的蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)了p16基因，并克隆了p16的cDNA。1994年，美國(guó)學(xué)者Kamb5與Noborl等1同時(shí)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型抑癌基因p16

3、基因及有關(guān)p16基因的研究工作結(jié)果。應(yīng)用克隆技術(shù)對(duì)46個(gè)人類(lèi)惡性細(xì)胞系進(jìn)行了研究，現(xiàn)已確定p16基因位于人第9號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶（9p21）上，全長(zhǎng)8.5kb，由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，其5端的126bp編碼外顯子1，中間部分的307bp編碼外顯子2，3端的11bp編碼外顯子35。編碼一種分子量為15845Da的核酸蛋白p16。該蛋白包含一個(gè)148個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框架，并由4個(gè)回鉤狀重復(fù)序列組成其空間構(gòu)型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這一構(gòu)型為維持其活性所必需，主要由外顯子2編碼。p16蛋白N端含有與cyclin box具有同源性的序列，即MX3ADWLATX4RVEEVX2LL序列。p16mBNA有型

4、和型兩種不同的形態(tài),其中型與廣泛進(jìn)行研究的p16cDNA基因克隆是完全一致的，型p16mRNA的轉(zhuǎn)錄模板第1外顯子序列（E1）與型（E1）不同，第2和第3外顯子與型p16cDNA序列完全一致。和兩種不同的p16mRNA可能是由兩種不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來(lái)的。p16與CDK4有高度親和性。還能抑制與CDK4結(jié)構(gòu)相似的另一個(gè)酶CDK6。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)有關(guān)基因在多種類(lèi)型惡性腫瘤中存在基因純合缺失或突變，從而證實(shí)了它是一個(gè)多重腫瘤抑制基因（multiple tumor suppressor 1，MTS1）4，5。大量深入的研究顯示，p16基因表達(dá)異常在某些原發(fā)腫瘤中較多見(jiàn)，如星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、白血病

5、、胰腺癌、食管癌等；但在某些腫瘤中卻較罕見(jiàn)，如乳腺癌、大腸癌等3；這可能涉及到不同腫瘤的發(fā)病機(jī)制。2  p16基因的功能及作用機(jī)制將p16基因cDNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成，而且有p16基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞其體外繼續(xù)傳代受到抑制4。Jin等6將野生型p16基因連接于一個(gè)腺病毒衍生的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，并將其導(dǎo)入無(wú)p16基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞系中，結(jié)果證實(shí)導(dǎo)入的p16基因的表達(dá)可阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，并抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)及體外的增殖。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)研究了p16基因生長(zhǎng)抑制功能，發(fā)現(xiàn)將全長(zhǎng)p16基因cDNA導(dǎo)入無(wú)p16基因的人類(lèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可顯著抑制其生長(zhǎng)；但對(duì)于有內(nèi)

6、在的野生型p16基因的細(xì)胞無(wú)明顯作用?？梢?jiàn)p16基因的蛋白產(chǎn)物具有生長(zhǎng)抑制功能。真核細(xì)胞的分裂周期是由細(xì)胞周期蛋白依賴性家族所調(diào)節(jié)，其中G1-S和G2-M轉(zhuǎn)換是最重要的兩個(gè)關(guān)卡。這個(gè)家族中各成員的連續(xù)激活和隨之產(chǎn)生的各種關(guān)鍵底物的磷酸化推動(dòng)細(xì)胞周期的有序進(jìn)行。不同的細(xì)胞周期蛋白CDK復(fù)合物可以在細(xì)胞周期的特異位點(diǎn)組裝起來(lái)，細(xì)胞周期蛋白D與CDK4、CDK6有特殊的親和性，其形成的復(fù)合物使細(xì)胞內(nèi)的Rb磷酸化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。p16的主要作用在于能夠抑制CDK4CDK6介導(dǎo)的Rb基因蛋白產(chǎn)物的磷酸化。非磷酸化的Rb可結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子E2F-DNA復(fù)合物上，在啟動(dòng)子上阻斷mR

7、NA的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)又可活化轉(zhuǎn)錄因子ATF-2，促進(jìn)細(xì)胞分裂抑制因子的轉(zhuǎn)錄；磷酸化的Rb則無(wú)此活性。在G1期，CyclinD-CDK4復(fù)合物具有激酶活性，促進(jìn)Rb的磷酸化，而與p16與CyclinD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4，從而抑制Rb磷酸化，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期而被阻滯于G1晚期。正常情況下，G1期CDK活性的增加使Rb失活，進(jìn)而導(dǎo)致E2F的過(guò)度表達(dá)；而后者反過(guò)來(lái)抑制CDK活性，并誘導(dǎo)p16相關(guān)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。因此，p16與CDK4、CyclinD、Rb、EIF形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。p16基因的任何變異都會(huì)導(dǎo)致上述環(huán)路無(wú)限制地進(jìn)行，從而引起細(xì)胞的過(guò)度增殖1，46而誘發(fā)癌癥的發(fā)生。3  p16基

8、因?qū)δ[瘤發(fā)生中的影響3.1  p16基因的失活機(jī)制  目前大多數(shù)研究中，p16基因蛋白的失活被認(rèn)為主要與p16基因本身的缺失、點(diǎn)突變及重組有關(guān)，其中p16基因的純合性缺失是其正常功能丟失的主要方式，但Nishikawa等7發(fā)現(xiàn)，在DNA測(cè)序證明是野生型p16基因的病例中，50未能檢測(cè)到p16蛋白，因此肯定存在p16基因突變以外的失活機(jī)制使其功能產(chǎn)物喪失活性。有研究檢測(cè)了來(lái)源于不同腫瘤類(lèi)型的29例腫瘤細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)共有26例無(wú)法檢出p16蛋白，而其相應(yīng)基因的純合性缺失卻只占18，點(diǎn)突變也僅有22。還有研究發(fā)現(xiàn)8，p16蛋白失活機(jī)制與p16基因5端CpG環(huán)島的甲基化作用有關(guān)。約2

9、0的原發(fā)腫瘤存在p16基因5端CpG環(huán)島的甲基化現(xiàn)象，而正常組織則無(wú)此現(xiàn)象。另外，還有研究證實(shí)，p16基因失活與Rb及CDK4的改變有關(guān)。Sakaguchi等9通過(guò)免疫組化研究了61例NSCLC標(biāo)本，Rb陽(yáng)性者均未測(cè)到p16蛋白，而Rb陰性的則有p16高表達(dá)，即p16蛋白與Rb的量呈負(fù)相關(guān)。He等10探討了膠質(zhì)瘤中CDK4與p16基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CDK4過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致p16基因純合缺失，提示二者之間存在一定的調(diào)控關(guān)系。3.2  p16基因蛋白異常表達(dá)的意義  p16基因是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，它的突變和缺失廣泛存在于各種腫瘤中，自1994年以來(lái)，研究逐漸興起。Okamot

10、o等8報(bào)道在人肺、食管、肝、結(jié)腸和胰腺的腫瘤細(xì)胞中明顯的p16基因的表達(dá)與CyclinD的表達(dá)相反，因p16基因的cDNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入癌細(xì)胞可有效抑制癌細(xì)胞克隆形成。反之，p16的缺失則導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)。還有在食管癌、乳腺癌、白血病等研究中，均發(fā)現(xiàn)有p16基因高頻率純合缺失或突變，說(shuō)明p16基因功能的失活與腫瘤的起因和惡化有關(guān)，需進(jìn)行更廣泛的研究。p16基因與肺癌的關(guān)系亦有不少報(bào)道。Shimizu等應(yīng)用PCR-SSCP方法檢測(cè)30例原發(fā)性肺癌標(biāo)本，其雜合丟失發(fā)生率為50，突變率占7，說(shuō)明在某些原發(fā)性肺癌的發(fā)生、發(fā)展中p16基因起一定作用。4  p16基因與肝癌4.1

11、0; p16基因在HCC的變異  肝癌是消化系統(tǒng)比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高，預(yù)后較差。分子生物學(xué)研究顯示，肝細(xì)胞癌的發(fā)生與癌基因的異常激活及抑癌基因的失活密切相關(guān)。迄今已有一些報(bào)道。國(guó)內(nèi)外對(duì)p16基因在HCC中的表達(dá)及基因變異研究較少，且存在分歧。1995年Kitagawa等11對(duì)小鼠HCC用微衛(wèi)星探針進(jìn)行共顯性分析，在源腫瘤中未發(fā)現(xiàn)明顯p16基因畸變，但HCC源的細(xì)胞系中第4號(hào)染色體雜合性丟失（Loss of heterozygosity，LOH）發(fā)生率很高（95），提示基因功能丟失很可能包括p16基因。Hui等12檢測(cè)了6個(gè)HCC細(xì)胞系和32例原發(fā)HCC的p16基因狀況，

12、分別在蛋白水平采用Wester blot，在mRNA水平用RT-PCR和Northern blot，在基因水平用Southern blot和PCR-SSCP分析法檢測(cè)p16基因，發(fā)現(xiàn)在50的細(xì)胞系，34的原發(fā)HCC中p16蛋白表達(dá)缺失，但在癌旁組織存在p16蛋白，提示p16基因的失活與HCC密切相關(guān)。Hui等還發(fā)現(xiàn)在HCC細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤中既沒(méi)有p16基因的純合子缺失和突變，也沒(méi)有p16mRNA表達(dá)的丟失，認(rèn)為HCC中p16基因的失活主要是由于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)而不是基因畸變或缺少轉(zhuǎn)錄所致。最近，Jin等13檢測(cè)了HCC原發(fā)腫瘤及細(xì)胞系中p16基因和蛋白狀況，發(fā)現(xiàn)30的HCC和29HCC細(xì)胞株有純合

13、性缺失，35的HCC和43HCC細(xì)胞株的p16啟動(dòng)子區(qū)域存在過(guò)度甲基化，認(rèn)為在9p21基因位點(diǎn)編碼的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白中，HCC最常發(fā)生p16基因的失活，其中啟動(dòng)子過(guò)度甲基化和純合性缺失是常見(jiàn)的失活機(jī)制。         但有些研究結(jié)果則相反，Biden等14用LOH分析法、PCR、SSCP分析法和DNA序列分析澳大利亞23例原發(fā)HCC病例和4個(gè)HCC細(xì)胞系，均未發(fā)現(xiàn)p15、p16基因畸變，而在p16基因位點(diǎn)的鄰近區(qū)域發(fā)現(xiàn)兩處（DpSl604和DqSl71）缺失，發(fā)生率分別為54和29。SSCP和DNA序列分析發(fā)現(xiàn)4

14、例在密碼子148處有相同核苷酸的改變，其中1例在密碼子119位處有突變，從而使谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，故認(rèn)為p16基因在HCC很少發(fā)生缺失或突變，這可能與人種不同及HCC病因不同有關(guān)。另外，p16基因上游共顯性基因丟失可導(dǎo)致此基因表達(dá)中調(diào)節(jié)序列的失活，在靠近p16基因區(qū)域的9p21-22區(qū)可能存在另一種腫瘤抑制基因。Shen等15也發(fā)現(xiàn)只有3（134）存在p16基因外顯子1的純合性缺失，亦未見(jiàn)p16基因突變或重排，認(rèn)為HCC中很少有p16基因的改變，并且p16基因的改變?cè)贖CC的發(fā)生中很少起作用。4.2  p16基因與HCC的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移  許多研究發(fā)現(xiàn)，p16基因的異常與腫瘤的

15、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，表現(xiàn)為惡性程度高的腫瘤及轉(zhuǎn)移性腫瘤中p16基因的改變高于惡性程度低的腫瘤，如皮膚鱗癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌等。在HCC中也發(fā)現(xiàn)p16基因表達(dá)的失活與HCC的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Hui等16調(diào)查發(fā)現(xiàn)44的HCC存在p16蛋白缺失，在轉(zhuǎn)移灶中p16蛋白缺失的比例（74）是原發(fā)灶（36%）的2倍，且p16蛋白和（或）陽(yáng)性蛋白的缺失與HCC的細(xì)胞低分化程度、血管侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。王英等在研究p16基因在HCC的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)p16基因的陽(yáng)性表達(dá)率與HCC的惡性程度、自然病程密切相關(guān)。隨著腫瘤惡性程度的上升，p16基因表達(dá)的陽(yáng)性率明顯下降，且陽(yáng)性程度也下降。在低分化HCC中p16基因

16、表達(dá)陽(yáng)性率很低，認(rèn)為p16基因陽(yáng)性的低或無(wú)表達(dá)是HCC晚期的表現(xiàn)，提示p16蛋白缺失與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是與肝癌的惡性發(fā)展關(guān)系密切，對(duì)肝癌的預(yù)后可能有重要影響。5  p16應(yīng)用前景p16蛋白是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的具有多腫瘤抑制作用的蛋白質(zhì)分子，p16基因的異常改變幾乎存在于全部的惡性腫瘤中，其在多種惡性腫瘤中的異常表達(dá)與惡性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，故可望成為估測(cè)某些惡性腫瘤發(fā)展、預(yù)后的候選標(biāo)志。已有將p16基因?qū)肽[瘤細(xì)胞系已獲得抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，國(guó)內(nèi)亦見(jiàn)有報(bào)道17。因此，人們都將p16基因視為腫瘤基因治療的良好靶基因之一，這為p16基因在惡性腫瘤的基因治療上打下了理論基礎(chǔ)。目前只有

17、p53基因的替代治療進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段。而p16基因較p53基因具有更大的優(yōu)越性：（1）在腫瘤中的異常率高；（2）致癌機(jī)制更清晰、直接；（3）基因小分子量?jī)H為53基因的1/4易于標(biāo)定、操作容易，抗癌作用更直接高效；（4）可特異性作用于CDK4，蛋白特異性強(qiáng)18；（5）可與Rb、p53等抑癌基因共同抗癌。p16基因的CpG島甲基化研究工作帶來(lái)的一個(gè)重要命題是甲基化所致的表達(dá)是可逆的。CpG島甲基化對(duì)去甲基化劑5-dazc非常敏感，而正常體細(xì)胞中受甲基化調(diào)節(jié)的基因很少，使用去甲基化劑不會(huì)引起正常組織的功能基因表達(dá)異常3。這項(xiàng)工作可能會(huì)為p16基因在腫瘤中的“復(fù)活”帶來(lái)全新的方法。有學(xué)者應(yīng)用腺病毒載

18、體將p16cDNA導(dǎo)入肺癌細(xì)胞系293中得到表達(dá)，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。將Wt p16轉(zhuǎn)染有p16缺失的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其對(duì)放射線的敏感性增加19。Arap等用p16基因治療腫瘤，收到一定效果。Higashi等將p16cDNA導(dǎo)入人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤得到表達(dá)，限制了細(xì)胞的無(wú)約束生長(zhǎng)和錨著非依賴性生長(zhǎng)20。將wt p16基因?qū)氚螂装┘?xì)胞系明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。還有學(xué)者因p16基因畸變?cè)谙祼盒阅[瘤有較高發(fā)生頻率。Wt p16基因用于此類(lèi)腫瘤的基因治療。另外，針對(duì)p16蛋白與CDK4/6的特異結(jié)合可以開(kāi)發(fā)新的“生物導(dǎo)彈”制劑以治療腫瘤。為惡性腫瘤的基因治療開(kāi)辟出一個(gè)新天地。尋找一種簡(jiǎn)便而又靈

19、敏的方法，使p16基因在相關(guān)腫瘤中重新表達(dá)從而抑制腫瘤的無(wú)限制生長(zhǎng)，這是腫瘤防治過(guò)程中的一項(xiàng)重要工作?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1  Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al,Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994,368:753-756.2  Gonzales-Zulueta M,Ohneseit PF.High frequency of chromosome 9p allelic loss and CDKN2 tumo

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