p16基因與肝癌的研究近況

1、p16基因與肝癌的研究近況         【關(guān)鍵詞】  腫瘤腫瘤發(fā)生的最重要原因是細胞增殖失控，這表明調(diào)節(jié)細胞周期的分子機制參與腫瘤的發(fā)生1。細胞周期的運行主要依靠一組使其進入分裂期的依賴性細胞周期蛋白激酶（CDKS）的作用。CDKS只有和細胞周期蛋白（Cyclin）結(jié)合才能被激活，從而使細胞由G1期進入S期。同時，細胞中存在CDKS的抑制因子，抑制其活性，阻止細胞分裂。近年來發(fā)現(xiàn)的CDK抑制分子（CDK inhibitor，CDI），對細胞周期有負調(diào)節(jié)作用。p16基因是人們發(fā)現(xiàn)的第一個直接作用于細胞周

2、期抑制細胞分裂的抑癌基因。p16基因編碼的蛋白即p16蛋白，為CDKS和Cyclin結(jié)合的抑制蛋白。p16基因的改變（頻繁雜合缺失、純合缺失、突變及甲基化13）可導致細胞過度分裂從而向惡性發(fā)展。p16基因的研究已成為當前腫瘤分子生物學和分子遺傳學研究的熱點。1  p16基因的結(jié)構(gòu)特性1993年，Serrano等4利用酵母雙雜合蛋白相關(guān)性篩選法（yeast two-hybrid protein interaction screen）研究與CDK4作用的蛋白時，發(fā)現(xiàn)了p16基因，并克隆了p16的cDNA。1994年，美國學者Kamb5與Noborl等1同時報道發(fā)現(xiàn)了一個新型抑癌基因p16

3、基因及有關(guān)p16基因的研究工作結(jié)果。應用克隆技術(shù)對46個人類惡性細胞系進行了研究，現(xiàn)已確定p16基因位于人第9號染色體短臂2區(qū)1帶（9p21）上，全長8.5kb，由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成，其5端的126bp編碼外顯子1，中間部分的307bp編碼外顯子2，3端的11bp編碼外顯子35。編碼一種分子量為15845Da的核酸蛋白p16。該蛋白包含一個148個氨基酸的開放閱讀框架，并由4個回鉤狀重復序列組成其空間構(gòu)型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這一構(gòu)型為維持其活性所必需，主要由外顯子2編碼。p16蛋白N端含有與cyclin box具有同源性的序列，即MX3ADWLATX4RVEEVX2LL序列。p16mBNA有型

4、和型兩種不同的形態(tài),其中型與廣泛進行研究的p16cDNA基因克隆是完全一致的，型p16mRNA的轉(zhuǎn)錄模板第1外顯子序列（E1）與型（E1）不同，第2和第3外顯子與型p16cDNA序列完全一致。和兩種不同的p16mRNA可能是由兩種不同的啟動子轉(zhuǎn)錄而來的。p16與CDK4有高度親和性。還能抑制與CDK4結(jié)構(gòu)相似的另一個酶CDK6。近年來，人們發(fā)現(xiàn)有關(guān)基因在多種類型惡性腫瘤中存在基因純合缺失或突變，從而證實了它是一個多重腫瘤抑制基因（multiple tumor suppressor 1，MTS1）4，5。大量深入的研究顯示，p16基因表達異常在某些原發(fā)腫瘤中較多見，如星形細胞瘤、黑色素瘤、白血病

5、、胰腺癌、食管癌等；但在某些腫瘤中卻較罕見，如乳腺癌、大腸癌等3；這可能涉及到不同腫瘤的發(fā)病機制。2  p16基因的功能及作用機制將p16基因cDNA表達載體轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細胞克隆形成，而且有p16基因表達的腫瘤細胞其體外繼續(xù)傳代受到抑制4。Jin等6將野生型p16基因連接于一個腺病毒衍生的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，并將其導入無p16基因表達的肺癌細胞系中，結(jié)果證實導入的p16基因的表達可阻止腫瘤細胞進入S期，并抑制腫瘤細胞體內(nèi)及體外的增殖。應用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)研究了p16基因生長抑制功能，發(fā)現(xiàn)將全長p16基因cDNA導入無p16基因的人類膠質(zhì)瘤細胞中可顯著抑制其生長；但對于有內(nèi)

6、在的野生型p16基因的細胞無明顯作用?？梢妏16基因的蛋白產(chǎn)物具有生長抑制功能。真核細胞的分裂周期是由細胞周期蛋白依賴性家族所調(diào)節(jié)，其中G1-S和G2-M轉(zhuǎn)換是最重要的兩個關(guān)卡。這個家族中各成員的連續(xù)激活和隨之產(chǎn)生的各種關(guān)鍵底物的磷酸化推動細胞周期的有序進行。不同的細胞周期蛋白CDK復合物可以在細胞周期的特異位點組裝起來，細胞周期蛋白D與CDK4、CDK6有特殊的親和性，其形成的復合物使細胞內(nèi)的Rb磷酸化，促進轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生，使細胞由G1期進入S期。p16的主要作用在于能夠抑制CDK4CDK6介導的Rb基因蛋白產(chǎn)物的磷酸化。非磷酸化的Rb可結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子E2F-DNA復合物上，在啟動子上阻斷mR

7、NA的轉(zhuǎn)錄，同時又可活化轉(zhuǎn)錄因子ATF-2，促進細胞分裂抑制因子的轉(zhuǎn)錄；磷酸化的Rb則無此活性。在G1期，CyclinD-CDK4復合物具有激酶活性，促進Rb的磷酸化，而與p16與CyclinD競爭結(jié)合CDK4，從而抑制Rb磷酸化，阻止細胞從G1期進入S期而被阻滯于G1晚期。正常情況下，G1期CDK活性的增加使Rb失活，進而導致E2F的過度表達；而后者反過來抑制CDK活性，并誘導p16相關(guān)的轉(zhuǎn)錄活動。因此，p16與CDK4、CyclinD、Rb、EIF形成一個反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。p16基因的任何變異都會導致上述環(huán)路無限制地進行，從而引起細胞的過度增殖1，46而誘發(fā)癌癥的發(fā)生。3  p16基

8、因?qū)δ[瘤發(fā)生中的影響3.1  p16基因的失活機制  目前大多數(shù)研究中，p16基因蛋白的失活被認為主要與p16基因本身的缺失、點突變及重組有關(guān)，其中p16基因的純合性缺失是其正常功能丟失的主要方式，但Nishikawa等7發(fā)現(xiàn)，在DNA測序證明是野生型p16基因的病例中，50未能檢測到p16蛋白，因此肯定存在p16基因突變以外的失活機制使其功能產(chǎn)物喪失活性。有研究檢測了來源于不同腫瘤類型的29例腫瘤細胞株，發(fā)現(xiàn)共有26例無法檢出p16蛋白，而其相應基因的純合性缺失卻只占18，點突變也僅有22。還有研究發(fā)現(xiàn)8，p16蛋白失活機制與p16基因5端CpG環(huán)島的甲基化作用有關(guān)。約2

9、0的原發(fā)腫瘤存在p16基因5端CpG環(huán)島的甲基化現(xiàn)象，而正常組織則無此現(xiàn)象。另外，還有研究證實，p16基因失活與Rb及CDK4的改變有關(guān)。Sakaguchi等9通過免疫組化研究了61例NSCLC標本，Rb陽性者均未測到p16蛋白，而Rb陰性的則有p16高表達，即p16蛋白與Rb的量呈負相關(guān)。He等10探討了膠質(zhì)瘤中CDK4與p16基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CDK4過度表達導致p16基因純合缺失，提示二者之間存在一定的調(diào)控關(guān)系。3.2  p16基因蛋白異常表達的意義  p16基因是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，它的突變和缺失廣泛存在于各種腫瘤中，自1994年以來，研究逐漸興起。Okamot

10、o等8報道在人肺、食管、肝、結(jié)腸和胰腺的腫瘤細胞中明顯的p16基因的表達與CyclinD的表達相反，因p16基因的cDNA表達載體轉(zhuǎn)染進入癌細胞可有效抑制癌細胞克隆形成。反之，p16的缺失則導致腫瘤細胞無限制生長。還有在食管癌、乳腺癌、白血病等研究中，均發(fā)現(xiàn)有p16基因高頻率純合缺失或突變，說明p16基因功能的失活與腫瘤的起因和惡化有關(guān)，需進行更廣泛的研究。p16基因與肺癌的關(guān)系亦有不少報道。Shimizu等應用PCR-SSCP方法檢測30例原發(fā)性肺癌標本，其雜合丟失發(fā)生率為50，突變率占7，說明在某些原發(fā)性肺癌的發(fā)生、發(fā)展中p16基因起一定作用。4  p16基因與肝癌4.1

11、0; p16基因在HCC的變異  肝癌是消化系統(tǒng)比較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高，預后較差。分子生物學研究顯示，肝細胞癌的發(fā)生與癌基因的異常激活及抑癌基因的失活密切相關(guān)。迄今已有一些報道。國內(nèi)外對p16基因在HCC中的表達及基因變異研究較少，且存在分歧。1995年Kitagawa等11對小鼠HCC用微衛(wèi)星探針進行共顯性分析，在源腫瘤中未發(fā)現(xiàn)明顯p16基因畸變，但HCC源的細胞系中第4號染色體雜合性丟失（Loss of heterozygosity，LOH）發(fā)生率很高（95），提示基因功能丟失很可能包括p16基因。Hui等12檢測了6個HCC細胞系和32例原發(fā)HCC的p16基因狀況，

12、分別在蛋白水平采用Wester blot，在mRNA水平用RT-PCR和Northern blot，在基因水平用Southern blot和PCR-SSCP分析法檢測p16基因，發(fā)現(xiàn)在50的細胞系，34的原發(fā)HCC中p16蛋白表達缺失，但在癌旁組織存在p16蛋白，提示p16基因的失活與HCC密切相關(guān)。Hui等還發(fā)現(xiàn)在HCC細胞系和原發(fā)腫瘤中既沒有p16基因的純合子缺失和突變，也沒有p16mRNA表達的丟失，認為HCC中p16基因的失活主要是由于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)而不是基因畸變或缺少轉(zhuǎn)錄所致。最近，Jin等13檢測了HCC原發(fā)腫瘤及細胞系中p16基因和蛋白狀況，發(fā)現(xiàn)30的HCC和29HCC細胞株有純合

13、性缺失，35的HCC和43HCC細胞株的p16啟動子區(qū)域存在過度甲基化，認為在9p21基因位點編碼的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白中，HCC最常發(fā)生p16基因的失活，其中啟動子過度甲基化和純合性缺失是常見的失活機制。         但有些研究結(jié)果則相反，Biden等14用LOH分析法、PCR、SSCP分析法和DNA序列分析澳大利亞23例原發(fā)HCC病例和4個HCC細胞系，均未發(fā)現(xiàn)p15、p16基因畸變，而在p16基因位點的鄰近區(qū)域發(fā)現(xiàn)兩處（DpSl604和DqSl71）缺失，發(fā)生率分別為54和29。SSCP和DNA序列分析發(fā)現(xiàn)4

14、例在密碼子148處有相同核苷酸的改變，其中1例在密碼子119位處有突變，從而使谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，故認為p16基因在HCC很少發(fā)生缺失或突變，這可能與人種不同及HCC病因不同有關(guān)。另外，p16基因上游共顯性基因丟失可導致此基因表達中調(diào)節(jié)序列的失活，在靠近p16基因區(qū)域的9p21-22區(qū)可能存在另一種腫瘤抑制基因。Shen等15也發(fā)現(xiàn)只有3（134）存在p16基因外顯子1的純合性缺失，亦未見p16基因突變或重排，認為HCC中很少有p16基因的改變，并且p16基因的改變在HCC的發(fā)生中很少起作用。4.2  p16基因與HCC的進展、轉(zhuǎn)移  許多研究發(fā)現(xiàn)，p16基因的異常與腫瘤的

15、進展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，表現(xiàn)為惡性程度高的腫瘤及轉(zhuǎn)移性腫瘤中p16基因的改變高于惡性程度低的腫瘤，如皮膚鱗癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌等。在HCC中也發(fā)現(xiàn)p16基因表達的失活與HCC的進展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Hui等16調(diào)查發(fā)現(xiàn)44的HCC存在p16蛋白缺失，在轉(zhuǎn)移灶中p16蛋白缺失的比例（74）是原發(fā)灶（36%）的2倍，且p16蛋白和（或）陽性蛋白的缺失與HCC的細胞低分化程度、血管侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。王英等在研究p16基因在HCC的表達情況時發(fā)現(xiàn)p16基因的陽性表達率與HCC的惡性程度、自然病程密切相關(guān)。隨著腫瘤惡性程度的上升，p16基因表達的陽性率明顯下降，且陽性程度也下降。在低分化HCC中p16基因

16、表達陽性率很低，認為p16基因陽性的低或無表達是HCC晚期的表現(xiàn)，提示p16蛋白缺失與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是與肝癌的惡性發(fā)展關(guān)系密切，對肝癌的預后可能有重要影響。5  p16應用前景p16蛋白是第一個發(fā)現(xiàn)的具有多腫瘤抑制作用的蛋白質(zhì)分子，p16基因的異常改變幾乎存在于全部的惡性腫瘤中，其在多種惡性腫瘤中的異常表達與惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，故可望成為估測某些惡性腫瘤發(fā)展、預后的候選標志。已有將p16基因?qū)肽[瘤細胞系已獲得抑制腫瘤細胞生長的效果，國內(nèi)亦見有報道17。因此，人們都將p16基因視為腫瘤基因治療的良好靶基因之一，這為p16基因在惡性腫瘤的基因治療上打下了理論基礎(chǔ)。目前只有

17、p53基因的替代治療進入了臨床實驗階段。而p16基因較p53基因具有更大的優(yōu)越性：（1）在腫瘤中的異常率高；（2）致癌機制更清晰、直接；（3）基因小分子量僅為53基因的1/4易于標定、操作容易，抗癌作用更直接高效；（4）可特異性作用于CDK4，蛋白特異性強18；（5）可與Rb、p53等抑癌基因共同抗癌。p16基因的CpG島甲基化研究工作帶來的一個重要命題是甲基化所致的表達是可逆的。CpG島甲基化對去甲基化劑5-dazc非常敏感，而正常體細胞中受甲基化調(diào)節(jié)的基因很少，使用去甲基化劑不會引起正常組織的功能基因表達異常3。這項工作可能會為p16基因在腫瘤中的“復活”帶來全新的方法。有學者應用腺病毒載

18、體將p16cDNA導入肺癌細胞系293中得到表達，腫瘤細胞生長受到明顯抑制。將Wt p16轉(zhuǎn)染有p16缺失的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，其對放射線的敏感性增加19。Arap等用p16基因治療腫瘤，收到一定效果。Higashi等將p16cDNA導入人成膠質(zhì)細胞瘤得到表達，限制了細胞的無約束生長和錨著非依賴性生長20。將wt p16基因?qū)氚螂装┘毎得黠@抑制了腫瘤細胞的生長。還有學者因p16基因畸變在消化系惡性腫瘤有較高發(fā)生頻率。Wt p16基因用于此類腫瘤的基因治療。另外，針對p16蛋白與CDK4/6的特異結(jié)合可以開發(fā)新的“生物導彈”制劑以治療腫瘤。為惡性腫瘤的基因治療開辟出一個新天地。尋找一種簡便而又靈

19、敏的方法，使p16基因在相關(guān)腫瘤中重新表達從而抑制腫瘤的無限制生長，這是腫瘤防治過程中的一項重要工作?！緟⒖嘉墨I】1  Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al,Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature,1994,368:753-756.2  Gonzales-Zulueta M,Ohneseit PF.High frequency of chromosome 9p allelic loss and CDKN2 tumo

20、r supressor gene alteration in squamous cell carcinoma of the bladder.J Natl Cancer Inst,1995,87:1383-1393.3  Herman JG,Merlo A,Mao L.Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene si frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers.Cancer Res,1995,55（20）:4525-4530.4

21、0; Serrano Met,Hannon GJ,Beach DA.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature,1993,336（6465）:704-708.5  Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentionally involved in genese of many tumor types.Science,1994,264（5157）

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