登革2型病毒04株5′和3′末端的序列分析

1、登革2型病毒04株5和3末端的序列分析    登革2型病毒04株5和3末端的序列分析    中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志 2000年第1期第14卷 論著    作者：楊敬楊佩英秦鄂德胡志君于曼歐武仝莉莉趙衛(wèi)    單位：楊敬（100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室）；楊佩英（100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室）；秦鄂德（100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室）；胡志君（100850北

2、京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室）；于曼（100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室）    關(guān)鍵詞: 登革熱病毒；基因；序列分析    【摘要】目的測(cè)定登革2型病毒04株(D2-04)基因組5和3末端序列。方法從D2-04感染的C6/36細(xì)胞中提取總RNA，以該RNA為模板，利用RACE法，分別擴(kuò)增D2-04株的5和3末端cDNA片段。將其分別與pGEM-T載體連接得到含有5端535 bp和3端503 bp cDNA的重組質(zhì)粒，并測(cè)定上述cDNA插入片段的序列。將D2-04的5和3端非編碼

3、區(qū)的核苷酸序列與其它登革2型毒株進(jìn)行同源性比較。結(jié)果D2-04株與JAM、NGC、S1、16681和PDK-53株的同源性分別為98.96%，98.96%，93.75%，98.95%，97.92%和97.72%，97.80%，90.65%，94.26%，94.22%。結(jié)論D2-04株除與S1株的同源性略低外，其余株的同源性均在94%以上。    Sequence analysis of the 5and 3terminal regions of dengue type 2 virus 04 strain    YA

4、NG Jing, YANG Peiying, QIN Ede, et al.    （Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China）    【Abstract】ObjectiveTo analize the sequences of 5 and 3 terminal region of dengue type 2 virus 04 strain. Meth

5、odsTotal RNA was isolated from dengue type 2 virus 04 strain (D2-04) infected C6/36 cells. With this RNA as templete, the cDNA of both 5 and 3 termini of D2-04 were amplified using RACE method respectively. The cDNAs were separately inserted into pGEM-T vector and the recombinant plasmids containing

6、 the 5 terminus 535 bp and 3 terminus 503 bp were obtained. The nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment were determined. The nucleotide sequences of the 5 and 3 noncoding regions of D2-04 were compared with other Dengue type 2 viruses such as JAM、NGC、S1、16681 and PDK-53. ResultsThe results

7、 showed that they shared 98.96%,98.96%,93.75%,98.95%,97.92% and 97.72%,97.80%,90.65%,94.26%,94.22% homology with D2-04 strain respectively. ConclusionExcept S1, the homology between D2-04 and other type 2 viruses was higher than 94%.    【Key words】Dengue virus; Gene; Sequence ana

8、lysis    登革2型病毒04株(D2-04)的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2ANS5基因核苷酸序列已測(cè)定1。5非編碼區(qū)(5-NCR)長(zhǎng)約96100個(gè)核苷酸，3非編碼區(qū)(3-NCR)長(zhǎng)約400600個(gè)核苷酸，含有病毒全長(zhǎng)正鏈和負(fù)鏈RNA合成的啟動(dòng)子序列2，并與病毒的復(fù)制密切相關(guān)。因此我們又對(duì)D2-04的5和3末端的核苷酸序列進(jìn)行了測(cè)定并與其它登革2型毒株的同源性進(jìn)行了比較。    1材料和方法    1.1病毒的培養(yǎng)及RNA的提取病毒株D2-04株及其感染C6/36細(xì)胞總RNA的提取見

9、文獻(xiàn)1。    1.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已發(fā)表的登革2型標(biāo)準(zhǔn)株新幾內(nèi)亞C株(NGC)的基因組序列3，利用Goldkey軟件設(shè)計(jì)引物。5端設(shè)計(jì)兩條反向引物Sp1和Sp2,3末端設(shè)計(jì)一條正向引物Sp3(表1)。    表1登革2型病毒基因組5及3端引物序列及位置    Tab.1Genome 5 and 3 primers of dengue type 2 virus used for PCR       &#

10、160;    引物    Primer    位置    Position    核苷酸組成(53)    Nudectide sequence(53)            Sp1    6816

11、63    GGTACACGTCCCATAAGTT            Sp2    503480    CTTTTCCCTTTCTCTTGTCTACTG            Sp3    101

12、8910210    ATAGGCAATGAGGAATACACAG            1.3RT-PCR擴(kuò)增采用RACE快速擴(kuò)增cDNA末端方法擴(kuò)增D2-04的5和3末端。方法參照5/3 RACE kit說(shuō)明書(Boehringer Mannheim)，所用寡聚d(T)錨定引物核苷酸組成為：5-GACCACGCGTATCGATGTCGAC(T)16V-3(V=A,C或G)，PCR錨定引物的核苷酸組成為：5-GACCACGCGTATC

13、GATGTCGAC-3。    1.3.15 RACE取總RNA，加入cDNA合成緩沖液，dNTP混合物，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，特異引物Sp1(12.5 M)，加水至總體積20 l,55， 60 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)完畢，65，10 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，所得cDNA利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Boeheinger Mannheim)進(jìn)行純化。取純化的cDNA樣本加入10×反應(yīng)緩沖液和dATP，94變性3 min，以消除二級(jí)結(jié)構(gòu)，冰浴后加入末端轉(zhuǎn)移酶，37，10 min，在cDNA的3端加上poly A尾。70，10 min滅活末端轉(zhuǎn)移酶。取含poly

14、 A尾的cDNA，加入寡聚d(T)錨定引物，特異引物Sp2(12.5 M),dNTP,10×反應(yīng)液和Taq plus (Sangon)聚合酶，補(bǔ)水至總體積50 l,混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為：94，2 min后，94，15 s；55，30 s；72，40 s進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，再94，15 s;55,30 s;72,60 s,2個(gè)循環(huán)，94,15 s;55,30 s;72,80 s,4個(gè)循環(huán)，94，15 s;55,30 s;72,100 s，6個(gè)循環(huán)，94，15 s；55，30 s；72，120 s,8個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)后，72延伸7 min。   

15、 1.3.23RACE取總RNA，加入10×poly A聚合酶緩沖液(500 M Tris.Cl,pH7.9,2.5 M NaCl,100 mM MgCl2，25 mM MnCl2)，poly A聚合酶(GibcoBRL),ATPNa2(25 mM)(Boheringer Mannheim),RNasin(GibcoBRL),BSA(Promega)，加水至總體積35 l，37，30 min在RNA的3端加上poly A尾。用GlassMax核酸純化試劑盒(GibcoBRL)純化poly(A)RNA。取純化的poly(A)RNA,分別加入dNTP，寡聚d(T)錨定引物，AM

16、V反轉(zhuǎn)錄酶，加水至總體積20 l，混勻后55，60 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)完畢，65，10 min滅活cDNA，取cDNA加入PCR錨定引物，特異引物Sp3,dNTP及10×反應(yīng)液和Taq plus (Sangon)聚合酶，補(bǔ)水至總體積50 l，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為：94，1 min后，94，60 s，62，60 s，72，90 s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)后，72延伸7 min。    1.4PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序PCR純化試劑盒(Bohringer Mannheim)純化的PCR產(chǎn)物直接與pGEM-T載體(Promega)連接，

17、轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5，挑取陽(yáng)性克隆，ABI 377全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。2結(jié)果    2.15和3端cDNA克隆的測(cè)定采用5/3 RACE法擴(kuò)增出如預(yù)期大小的特異的片段。經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5，用菌落PCR法從平板生長(zhǎng)的菌落中篩選出5和3端cDNA陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖1)。        M:PCR marker;1:5端PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：pGEM-T-5的PCR產(chǎn)物；3：3端PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 4：pGEM-T-3的PCR產(chǎn)物  

18、;  1RACE法擴(kuò)增D2-04 5和3端結(jié)果    Fig.1Amplified fragments of 5 and 3 termini of D2-04 by RACE method    M:PCR marker. 1:PCR product of 5 terminus. 2:PCR product of pGEM-T-5.3:PCR product of 3 terminus. 4:PCR product of pGEM-T-3    2.25和

19、3端序列5端非編碼區(qū)的核苷酸數(shù)為96個(gè)，開放讀碼框架從97位的ATG開始(圖2)。3端非編碼區(qū)有454個(gè)核苷酸，其中有20個(gè)核苷酸的重復(fù)序列(圖3)。        圖2D2-04 5端核苷酸序列    Fig.2The nucleotide sequence of 5 tenminus of D2-04        注：下劃線為非編碼區(qū)核苷酸序列    

20、3D2-04 3端核苷酸序列    Fig.3The nucleotide sequence of 3 tenminus of D2-04    Note:The underlined part represents the    nucleotide sequence of noncoding region    2.3與其它病毒一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性比較利用Goldkey軟件將D2-04株5-NCR和3-NCR分別與其它登革2型病毒(JAM

21、、NGC、S1、16681和PDK-53)核苷酸序列的同源性進(jìn)行比較(表2)。    表2D2-04 5-NCR和3-NCR與其它登革2型病毒核苷酸序列的同源性    Tab.2Nucleotide sequence homology of D2-04 5-NCR and 3-NCR with other dengue type 2 viruses              &

22、#160; JAM    NGC    S1    16681    PDK-53            5-NCR    98.96    98.96    93.75 

23、0;  98.95    97.92            3-NCR    97.80    97.72    90.65    94.26    94.22     

24、       結(jié)果表明，D2-04株5-NCR與S1株核苷酸序列的同源性最低，與其它登革2型毒株的同源性相似。S1株的3-NCR的核苷酸數(shù)為443個(gè)，比其它2型毒株少11個(gè)，將其空余部分補(bǔ)齊后，D2-04再與它進(jìn)行同源性比較，它們之間的同源性為90.65%。    3討論    本文采用RACE法對(duì)D2-04株的5和3末端核苷酸序列進(jìn)行了測(cè)定。RACE法即快速擴(kuò)增cD-NA末端法，也稱錨定PCR法(A-PCR)，用于擴(kuò)增5和3末端未知序列4，5，

25、可準(zhǔn)確測(cè)得全長(zhǎng)的未知序列，而常規(guī)的5和3末端序列測(cè)定方法為根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增所需片段，再進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，這種方法測(cè)得的末端序列為已知引物的序列，而不是未知序列。由此可見，RACE法比常規(guī)方法有很大優(yōu)越性，尤其適用于擴(kuò)增未知序列。    D2-04株基因組RNA的5末端序列中有相連的寡聚T和寡聚A，它們之間易配對(duì)形成莖環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。錨定引物中有16個(gè)相連的T，因此易與序列中的寡聚A配對(duì)，往往造成序列測(cè)定時(shí)5端少約100個(gè)核苷酸。我們通過(guò)測(cè)定多個(gè)克隆，獲得了理想結(jié)果。    登革病毒基因組RNA的3末端無(wú)p

26、olyA結(jié)構(gòu)，我們先利用polyA聚合酶在3末端加上polyA尾，再與含寡聚dT的引物配對(duì)擴(kuò)增3末端。這種方法對(duì)3末端不含polyA尾病毒末端核苷酸序列的測(cè)定有借鑒意義。    登革病毒的5-NCR和3-NCR可形成莖環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。3-NCR二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)長(zhǎng)的莖和環(huán)，緊接一個(gè)短的莖和環(huán)(3-SL)，3-SL是由基因組3末端93個(gè)核苷酸形成，參與病毒的復(fù)制6。若設(shè)計(jì)針對(duì)5和3-NCR的反義核苷酸，可用于抑制病毒的復(fù)制，因此，我們對(duì)D2-04株5和3末端核苷酸序列的測(cè)定，為抗病毒藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。    作者單位：歐武（100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室）    參考文獻(xiàn)    1，楊敬，胡志君，楊佩英，等.登革2型病毒04株非結(jié)構(gòu)蛋白NS2ANS5基因的cDNA克隆及序列分析.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000(待發(fā)表).    2，Stollar V,Schlesinger RW