經(jīng)典生理生化試驗2

1、實驗十九 DNS法及聚酰胺薄膜層析技術測定蛋白質N末端和蛋白質的氨基酸組成分析一、目的：學習DNS法及聚酰胺薄膜層析法測定蛋白質N末端和蛋白質的氨基酸組成的原理及技術。二、原理：DNSCl在堿性環(huán)境里蛋白質和肽的-氨基酸的氨基起反應，生成帶有熒光的、穩(wěn)定的DNS-氨基酸（參看圖19-1，19-2），其反應如下：蛋白質在水解前與DNSCl反應，產(chǎn)生DNS-蛋白質，它標記在N-末端氨基酸殘基上，經(jīng)水解和薄層層析而測知是何種氨基酸。蛋白質水解后與DNSCl反應，標記的是蛋白質的氨基酸組成成分，如圖19-1和圖19-2所示。這是一種較為簡便的、適用的蛋白質的氨基酸組成成分分析的方法。DNS-蛋白質水解

2、產(chǎn)物中包括下列DNS-衍生物：相當于N-末端的-DNS-氨基酸，從鏈內賴氨酸及酪氨酸殘基形成的-DNS-賴氨酸和O-DNS-酪氨酸，這些衍生物相當穩(wěn)定。此外，DNSCl還與溶液中的氨起反應生成DNSNH2，DNS-磺酰胺以及DNSCl水解生成的DNSOH（DNS-磺酸）。此法與氟二硝基苯法相比，有二個突出的優(yōu)點，即水解產(chǎn)物無需提取，可用電泳或層析法直接鑒定氨基酸；另外就是靈敏度高，DNS-氨基酸的最大熒光激發(fā)值約為550nm，由于其熒光十分強烈，15n mol·L-1或1.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分別用電泳或薄層層析容易地檢測。DNSCl能與所有的氨基酸生成

3、具熒光的衍生物。其中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可與DNSCl生成雙DNS-氨基酸衍生物。這些氨基酸相當穩(wěn)定，可用于蛋白質的氨基酸組成的微量分析，靈敏度達1091010摩爾水平。比茚三酮法高10倍以上，比過去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。DNS-蛋白質（或肽），在·L-1 HCl，110水解1620h，DNS-蛋白質的肽鍵被打開。由于DNS基團與氨基之間的鍵結合牢固，絕大部分DNS-氨基酸都抗水解。除DNS-色氨酸全部被破壞；DNS-脯氨酸（77%），DNS-絲氨酸（35%），DNS-蘇氨酸（30%），DNS-甘氨酸（18%），DNS-丙氨酸（7%）部分被破壞

4、外，其余DNS-氨基酸很少破壞。DNSCl與蛋白質的側鏈基團巰基、咪唑基、-氨基和酚反應，前兩者在酸堿條件下均不穩(wěn)定，酸水解時完全破壞；DNS-賴氨酸和DNS-O-酪氨酸較穩(wěn)定，同時還有DNS-雙-賴氨酸和DNS-雙-酪氨酸生成，展層后在層析圖譜的位點上，都與DNS-氨基酸有區(qū)別。DNSCl在pH過高時，水解產(chǎn)生副產(chǎn)物DNS-OH，即：在DNSCl過量時，會產(chǎn)生DNSNH2，即：DNSOH在紫外光下產(chǎn)生藍色熒光，DNSNH2的位點往往和丙氨酸重合，在本實驗條件下，需進行第三相展層。根據(jù)鑒定方法需要，DNSCl的濃度5m mol·L-1（約每丙酮溶液），保存在棕色瓶中，置避光處防止分解

5、。樣品濃度大約1m mol·L-1。反應液要求丙酮濃度50%，pH，以保證游離氨基等功能團非質子化。在37保溫，黃色消退即表示反應完全，一般約1h。反應完后，混合物中含有較多DNSOH，最好除去副產(chǎn)物后再水解DNS-蛋白質或肽。蒸干除去丙酮，加·L-1 HCl，抽真空，封管在110水解20h，除去鹽酸，加丙酮溶解點樣展層，在紫外燈下鑒定熒光產(chǎn)物，同標準圖譜比較，可區(qū)分未知DNS氨基酸的種類。根據(jù)氨基酸的種類和數(shù)量可提供被測蛋白質或肽樣品的純度、肽鏈的數(shù)量和N-末端氨基酸的性質等方面的有價值的資料。聚酰胺薄層層析鑒定DNS氨基酸。展層后可鑒定所有的DNS氨基酸。聚酰胺是一類錦

6、綸的化學纖維原料（或稱尼龍）。由己二酸與己二胺聚合而成的叫作錦綸66：由己丙酰胺聚合而成的叫作錦綸6：聚酰胺薄膜是將錦綸涂于滌綸片上制成，這類聚合物含有大量的酰胺基團，所以稱為聚酰胺薄膜。聚酰胺薄膜的酰胺基團可與被分離物質之間形成氫鍵，因此對極性物質有很強的吸附作用（圖19-3）。被分離物質與酰胺基團形成氫鍵能力的強弱，確定了吸附能力的差異。在層析過程中，展層溶劑與被分離物質在聚酰胺表面競相形成氫鍵，選用適當?shù)恼箤尤軇?，使被分離的各種物質在溶劑與聚酰胺表面之間的分配系數(shù)有較大差異經(jīng)過吸附與解吸的展層過程，形成一個分離順序，彼此分開。選擇適當?shù)娜軇┫到y(tǒng)在5×5cm大小的薄膜上雙向層析，

7、大部分氨基酸可有效地分開。DNS-氨基酸的分離和鑒定：1溶劑系統(tǒng)第相展層溶劑系統(tǒng)（1）：甲酸（88%）水=1.5100（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（2）：苯冰乙酸=91（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（3）：乙酸乙酯甲醇冰乙酸=2011（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（4）：·L-1磷酸三鈉乙醇=31（V/V）2混合標準DNS-氨基酸圖譜（1）DNS-氨基酸混合樣品，經(jīng)雙向展層后大部分可得到分離（如圖19-4），第相用溶劑（1），第相用溶劑（2）。（2）DNS-天冬氨酸（Asp）和DNS-谷氨酸（Glu）；DNS-絲氨酸（ser）和DNS-蘇氨酸（Thr）；DNS-精氨酸（Arg）和DNS-組氨酸

8、（His）；DNS-賴氨酸（Lys）和DNS-賴氨酸（Lys）可能分不開；DNS-丙氨酸（Ala）和DNS-NH2也可能重疊在一起。為了分離這些DNS化的氨基酸，可用溶劑（3）在第相再展層一次（圖19-5）。（3）經(jīng)過3次展層，有時，組氨酸和精氨酸，和賴氨酸分離還不完全，可用溶劑系統(tǒng)（4）在第相再展層一次（圖19-6）。3豬胰島素N-末端氨基酸殘基圖譜和氨基酸組成（1）豬胰島素N末端分析（圖19-7）。豬胰島素由2條肽鏈組成，因此，純的豬胰島素有2個N末端氨基酸，即甘氨酸和苯丙氨酸。還有兩種非N末端的氨基酸，即酪氨酸和賴氨酸。在紫外燈下可見到DNS-Gly和DNS-Phe，同時還可見到O-DN

9、S-Tyr，-DNS-Lys。（2）豬胰島素氨基酸組成圖譜（19-8）。豬胰島素氨基酸組成包括：Gly，Phe，Leu，Ile，Pro，Val，Ala，Cys，Glu，Asp，Thr，Ser，His，Arg。胰島素氨基酸組成中，Asp和Asn，Glu和Gln是分辨不出來的，因為經(jīng)過水解之后，氨基酸的酰胺化合物都轉變成為相應的酸，Trp（Try）也完全被破壞，測不出來。測N-末端時，如果丹磺?；耆玫截摻Y果，則很可能此樣品的N-末端是Trp，因為Trp的DNS-衍生物鹽酸水解時全部被分解。丹磺?；蟮碾幕虻鞍踪|用鏈霉蛋白酶水解，則能很容易地檢測出Trp。鑒定DNS-氨基酸，可用夾心型的聚酰胺薄

10、板，即板的兩面都涂有聚酰胺薄膜，板的一面點上待檢樣品；另一面點上標準樣品。展層后，利用板的透明性鑒定未知DNS-氨基酸。一般情況下，如無這種薄板，則利用所得到的圖與標準的圖譜進行比較，有時還要計算相對遷移率，然后才鑒定氨基酸的種類。DNS法鑒定肽和蛋白質的N-末端氨基酸或它們的氨基酸組成是比較方便，也比較靈敏的。但由于聚酰胺薄膜的質量不能保證完全一樣，或者展層溶劑系統(tǒng)產(chǎn)生一些細微變化，這時所得圖譜與標準圖譜也會有差異，這就需要進一步證實差異原因，重復實驗。酪氨酸DNS化時，一般產(chǎn)生3種DNS化產(chǎn)物，即-DNS-Tyr的黃色熒光同一般的DNS氨基酸差不多，而O-DNS-Tyr和di-DNS-Ty

11、r帶有亮黃色熒光。這3種產(chǎn)物展層后分離得比較開（圖19-9）。如果Tyr的DNS化產(chǎn)物和甘氨酸、苯丙氨基酸DNS化產(chǎn)物一起展層，是到如圖19-10的結果。三、器材及試劑：1器材：紫外燈，恒溫水浴，小型干燥器（或400ml平底燒杯），燒杯，電爐，真空泵，塑料膜，水解管，磨口小試管，毛細管，聚酰胺薄膜。2試劑：DNSCl丙酮溶液：25mg DNSCl溶在1ml丙酮中，棕色瓶封口，暗處保存，數(shù)月穩(wěn)定。買的商品可能含有一些白色不溶物質（水解產(chǎn)物DNSOH），這種物質在試劑的保存期間也會慢慢產(chǎn)生。如果水解程度很少，對實驗不會有很大影響（不會有很大干擾）。·L-1 NaHCO3緩沖液（pH）：用

12、Na2CO3和NaHCO3配制（Na2CO3NaHCO3=37）。·L-1 HCl：用優(yōu)級純HCl配制。展層液：第相展層溶劑系統(tǒng)（1）：甲酸（88%）水=：100（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（2）：苯冰乙酸=91（V/V）四、操作步驟：1丹磺?；夹g（1）DNS氨基酸制備：用·L-1 NaHCO3緩沖液配成2m mol·L-1濃度的氨基酸溶液。取加入具塞玻璃試管中，同時加入0.1ml DNSCl丙酮溶液（·ml-1），反應要求最終濃度為氨基酸1m mol·L-1，DNSCl 5m mol·L-1，丙酮5%（）。用1mol·L-

13、1 NaOH調pH910，塞緊搖勻。置37保溫1h，反應完成后放暗處保存，備用。（2）多肽和蛋白質N-末端DNS化氨基酸溶液的制備：用·L-1 NaHCO3溶液配制2m mol/L多肽或蛋白質溶液。取此溶液加入水解管中，加入 DNSCl丙酮溶液（·ml-1），用1mol·L-1 NaOH調pH910，混勻后用parlfin封口，置37保溫1h。反應完成后，蒸干丙酮，加·L-1 HCl，抽真空封口，110保溫1620h，水解完成后，開管將溶液轉移到5ml小燒杯內，蒸干鹽酸，加幾滴水再蒸干，反復數(shù)次使鹽酸完全除凈。用丙酮溶解樣品、點樣展層，即可得到樣品的N-

14、末端DNS-氨基酸。（3）多肽和蛋白質DNS化氨基酸組成的溶液的制備 水解肽和蛋白質：取0.1ml 2m mol·L-1的多肽或蛋白質溶液，加入水解管中，再加優(yōu)級純鹽酸，使鹽酸濃度達到·L-1，抽真空封口，置110水解1620h（最好分別水解24,48,72h），水解完成后，開管轉移到5ml燒杯內，置沸水浴中蒸去鹽酸，干后加幾滴蒸餾水，繼續(xù)蒸干，反復數(shù)次除凈鹽酸。 水解氨基酸DNS化：加入·L-1 NaHCO3和 DNSCl丙酮溶液，用1mol·L-1 NaOH調pH910，轉移到具塞磨口試管中，置37保溫1h，到此，肽和蛋白質DNS化的氨基酸組成的樣品

15、制備完成，即可點樣展層。此法與二硝基化苯相比的優(yōu)點是，水解后無需提取水解產(chǎn)物，可用于電泳或層析法直接鑒定氨基酸，且靈敏度高。2以聚酰胺薄層層析鑒定DNS-氨基酸（1）選擇聚酰胺薄膜：聚酰胺薄膜有夾心式（即兩面都涂有聚酰胺的板）和單面聚酰胺薄膜，單面的有4×4cm，7×7cm，5×15cm和7×11cm等幾種規(guī)格。本實驗選用4×4cm或7×7cm均可，并要求質地均勻，與尼龍板貼附牢固，無剝脫現(xiàn)象。（2）點樣：將粗細合適的毛細管用沙紙或砂輪將較齊的一頭磨平，小心地將樣品點在薄膜的右下角，距離邊緣的地方。樣品點要求圓、小，不能把膜觸破，最好

16、一次點樣成功，即在一處只點一下，因此樣品的濃度要合適，如果濃度不夠，則需重復在一處多次點樣，即在第一次點樣后，用吹風機吹干再點第二次、第三次等，在膜上標記。展層第一相樣品在右下角，展層后徹底吹干，將膜順時針轉90°，即樣品原點轉到左下角展層第二相。（3）展層 點樣后在小的干燥器里進行展層，首先要在干燥器蓋的邊緣涂一薄層凡士林，使之密閉不漏氣，放入培養(yǎng)皿并調水平。 向培養(yǎng)皿里加入展層劑，溶劑高度不超過3cm，蓋上干燥器蓋，使溶劑蒸汽在干燥器內達到飽和。 用皮筋或線將點好樣的薄膜捆成半圓筒型，并能垂直放穩(wěn)，皮筋不接觸膜，膜在板的內面，即光面在外與皮筋接觸。打開干燥器蓋，將捆好的薄膜垂直放

17、入盛有展層劑的培養(yǎng)皿里，立即蓋好蓋，溶劑即向上展層，當溶劑上升到離膜頂端處時，停止展層，立即開蓋標記前沿，取出，徹底吹干后順時針旋轉90°，以同樣方法進行第相展層（用第（2）溶劑系統(tǒng)或根據(jù)需要可在溶劑系統(tǒng)（3）中展層）。五、結果討論：繪制出層析圖譜，并分析說明該蛋白質樣品是由幾條鏈組成？其末端氨基酸是什么？其氨基酸組成如何？六、注意事項：1制備的條件在DNS-氨基酸制備時，DNS化必須在堿性條件下（）進行，否則會有很多副產(chǎn)物DNSNH2或DNSOH產(chǎn)生。測蛋白質或肽的N-末端氨基酸時，可用透析或Sephadex G-25，G-15，G-10層析，除去DNS-OH和DNS-NH2及小分

18、子物質再水解。2封管水解的幾個問題（1）DNS化后，加·L-1 HCl水解，一定要抽真空封管。否則110水解時易氧化破壞氨基酸。（2）水解后一定要把HCl徹底除凈。3點樣展層（1）點樣：樣品的點要小、圓、量要適當，否則拖尾，因此毛細管要細，頭要平，樣品濃度要合適，聚酰胺薄膜要選擇優(yōu)質的。（2）展層要在小的、密閉的、底部水平的容器里進行，每次展層的溫度、時間、展層劑的濃度要保持一致，否則不易重復。4鑒定未知樣品的N-末端氨基酸（1）內標法確定未知樣品N-末端氨基酸：在一塊薄膜上點未知的DNS-氨基酸，第二塊膜上點已知標準DNS-氨基酸，第三塊膜上將未知的和已知的同時點在一點上，展層后觀

19、察，如果在第三塊膜的熒光加強并重合，表明此未知氨基酸同已知標準DNS-氨基酸一樣，否則為不同的氨基酸。（2）采用夾心型的聚酰胺薄膜，其膜的兩面都涂有聚酰胺，可在一側面點上待測的DNS-氨基酸；另一側面點上對照的標準DNS-氨基酸。層析后可利用板的透明性質，比較、鑒定未知的DNS氨基酸。思 考 題1DNS化測定N-末端的根據(jù)是什么？DNS化的最適pH值是多少？采用什么緩沖體系？2DNS化的副產(chǎn)物是什么？如何除去？3DNSCl除能與-氨基反應外，還能與氨基酸的什么基團發(fā)生反應，生成什么產(chǎn)物？4未知樣品（蛋白質或肽）的N-末端氨基酸如何確定？實驗二十 聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點一

20、、目的：學習聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點的原理及方法。二、原理：等電點聚焦（isoelectric focusing, IEF）或簡稱電聚焦（electrofocusing），也曾稱等電點分離聚焦電泳等。它是60年代中期出現(xiàn)的技術，克服了一般電泳易擴散的缺點。近年來，等電點聚焦電泳又有了新的進展，可以分辨等電點只差H單位的生物分子。由于它的分辨力高、重復性好、樣品容量大、操作簡便、迅速，在生物化學、分類學、分子生物學及臨床醫(yī)學研究等諸方面，都得到廣泛應用。等電點聚焦電泳產(chǎn)生pH梯度的方法有兩種：一是用兩種不同的pH緩沖液相互擴散，在混合區(qū)形成pH梯度，此為人工pH梯度。這種p

21、H梯度不穩(wěn)定，常用于制備電泳；另一種是利用載體兩性電解質在電場作用下形成自然pH梯度。本實驗就是利用載體兩性電解質形成的自然pH梯度進行蛋白質樣品等電焦聚電泳的。理想的載體兩性電解質應該在其本身的等電點處有足夠的緩沖能力和良好的導電性，且分子量要小，組成與被分析樣品有所區(qū)別，對分析樣品無變性作用或發(fā)生化學反應。常用的載體兩性電解質是一系列脂肪族多氨基和多羧基類的混合物，即是一系列的異構物和同系物，分子量在3001000之間，各組分的等電點(pI)既有差異又相接近，pI的范圍在11之間。合成載體兩性電解質的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反應如下：R1和R2為氫或帶有氨基的脂肪基。這一反應的特點是

22、生成眾多的異構物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等電點的分布，取決于原材料的性質、比例和合成條件。目前常用的載體兩性電解質的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司），近來已有國產(chǎn)商品了。不同廠家合成的方法不同，電泳的條件也略有不同。目前，載體兩性電解質商品在使用時還存在一些問題，如樣品中的鹽濃度對pH梯度有影響等，但畢竟優(yōu)點很多，仍然得到廣泛應用。 分析載體兩性電解質的結構可知，它既有酸性基團(NH)，也有堿性基團(COO)，既可接受分子，也可釋放質子：它們在酸性條件下帶正電荷，在堿

23、性條件下帶負電荷。當它們所帶的正負電荷相等時，其凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH值為該兩性電解質的等電點，以pI表示。所以兩性電解質的等電點在數(shù)值上等于它呈電中性時溶液的pH值。等電點是反映兩性電解質在溶液中得失質子的能力，是它的物化性質。兩性電解質在溶液中的行為可以從兩方面看，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質。如溶液是pH7，對pI=9的兩性電解質來說，是處于酸性環(huán)境，故帶正電荷；但對pI=3的兩性電解質來說，卻是處于堿性環(huán)境，故而帶負電荷。所以，不同pI的兩性電解質，在同一環(huán)境中帶有不同性質和數(shù)量的電荷；另一方面，溶液中的兩性電解質又破壞了水的解離平衡：使溶液pH有所改變。當某一兩性

24、電解質pI較低，即釋放質子（H+）能力較強，使溶液pH值下降，這類兩性電解質稱為酸性兩性電解質；反之，pI高的可使溶液pH值上升，稱為堿性兩性電解質。所以，在溶液中的兩性電解質一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質；另一方面，它又影響周圍環(huán)境（水溶液），使其pH值有所改變。載體兩性電解質是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI其分布在10之間。在制備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正極的電極液是磷酸，負極是氫氧化鈉。正極是酸性環(huán)境，載體兩性電解質都帶正電荷，但由于pI的不同，其所帶正電荷數(shù)量就有所差異電泳時負極泳動的速度也就因此不同。同理，負極是堿性環(huán)境，載體兩性電解質帶有數(shù)量不等

25、的負電荷，以不同速度向正極泳動。根據(jù)兩性電解質的特性，在泳動過程中又不斷地與溶液交換質子，改變了溶液的pH。當達到平衡時，即得失質子相等，不再出現(xiàn)質子的交換時，載體兩性電解質到達等電點并各處于自己的pI區(qū)域，pI即是指溶液的pH值，所以，溶液也因此呈現(xiàn)不同的pH，隨載體兩性電解質的pI梯度而形成pH梯度。由于凝膠的防對流擴散作用，使pH梯度保持穩(wěn)定不變（參看圖20-1）。實驗操作中，要求開始電泳時恒壓60V，15min，目的在于使小分子的，泳動快的載體兩性電解質可在短時間內形成一個粗略的pH梯度。此后，恒流為8mA，是為了避免電泳開始時介質中帶電顆粒較多，電泳電流過高而破壞凝膠。當各種蛋白質逐

26、漸泳動到各自等電點位置時，帶電顆粒逐漸減少，出現(xiàn)電阻增大，電壓隨之增高現(xiàn)象。當電壓升到550V時，帶電顆粒已大為減少，電流不再偏高，故恒壓到580V，繼續(xù)電泳120min后，蛋白質顆粒慢慢地集中到它等電點位置。電流接近于零時，蛋白質顆粒不再泳動，電泳也到此結束。蛋白質樣品也因其等電點的差異而得到集中和彼此分開（參看圖20-2）。最早的等電聚焦電泳是垂直板式，后來發(fā)展為水平板式。超薄層水平板式也是近幾年發(fā)展起來的，這種形式的電泳的優(yōu)點是節(jié)省兩性電解質試劑、加樣數(shù)量多、利于比較不同樣品的電泳結果，而且電泳后的固定、染色和干燥都很方便、迅速。水平板式等電聚焦電泳的最大優(yōu)點是防止了由于電極液的電滲作用

27、而引起pH梯度的漂變。三、器材及試劑：1器材：穩(wěn)流穩(wěn)壓電源，水冷式平板等電聚焦電泳電槽，玻璃板（×11.5×），大鐵文具夾，塑料模具（厚，中間開孔×），小眼科剪子，鑷子，解剖刀，1ml注射器，50l和100l微量注射器，擦鏡紙，濾紙，精密pH試紙，凝血板，培養(yǎng)皿（120mm），脫脂棉，棕色試劑瓶，吸液管，吸耳球，玻璃紙，坐標紙。2試劑：重蒸水，丙烯酰胺（重結晶），甲叉雙丙烯酰胺（重結晶），過硫酸銨，TEMED（四甲基乙二胺），載體兩性電解質（10），考馬氏亮藍R250，液體石臘，乙醇（95%），硅油，磺基水楊酸，三氯乙酸，甲醇，乙酸（36%），已知pI蛋白質樣品和

28、標準等電聚焦樣品（市售），磷酸，氫氧化鈉。3溶液配制：（1）單體貯液：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，重蒸水溶解，定容到100ml，過濾備用（在棕色瓶中4可保存兩周）。（2）電極液：陽極1mol·L-1磷酸（H3PO4）：原磷酸試劑的濃度約為16mol·L-1，故配制時用重蒸水稀釋16倍即可。陰極 1mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）：稱取4g固體溶于100ml重蒸水中。（3）固定液：甲醇35ml，三氯乙酸10g，磺基水楊酸加水定容到100ml。（4）染色液：乙醇35ml，冰乙酸10ml，考馬氏亮藍R250加水定容到100ml，溶解后過濾備用。（5）脫色液：乙醇25ml

29、，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。（6）保存液：甘油15ml，乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。（7）樣品：牛血清蛋白 1mg·ml-1，糜蛋白酶元A 1mg·ml-1，肌紅蛋白 1mg·ml-1，卵清蛋白 1mg·ml-1，標準等電聚焦樣品。（8）大鼠肌肉提取液：1g鼠肌肉，加水5ml，勻漿提取，離心取上清液透析備用。（9）10%過硫酸銨：稱1g溶在10ml重蒸水中（純過硫酸銨溶解時會有響聲）。四、操作步驟：1凝膠配制單體貯液，重蒸水，載體兩性電解質，真空抽氣15min后加TEMED（原液）8l和10%過硫酸銨60l，混勻立即灌

30、膠。2灌膠（1）準備 取3mm洗凈晾干的玻璃板，涂上一層薄薄的防水硅油，以重蒸水沖洗，使硅油分布均勻。 平板電泳槽調水平，電泳槽上放上一張濾紙。 濾紙上放一厚2mm的玻璃板，玻璃板上面放上塑料模具（參看圖20-3（a）。 用文具夾將模具和玻璃板固定在平板電泳槽上。 在模板上面，文具夾的另一端再放上涂有硅油的玻璃板。（2）灌膠：小心、迅速地將混勻的膠灌到模具的框內。灌膠時膠液沿著上面有硅油的玻璃板的一端即文具夾的另一端，向文具夾方向推進，邊灌膠邊推上面的玻璃板，使模具框內充滿膠液，框內不能有氣泡，為趕走氣泡可移動玻璃板，待氣泡釋放后再向前進，一直推到接觸文具夾，使兩塊玻璃把膠封在框內，模具框內充

31、滿膠液，切不可有氣泡，否則要重新制膠和灌膠（參看圖20-3(b)）。在正式灌膠之前調水平之后，以8ml水代替膠液練習灌膠，直到不產(chǎn)生氣泡為止。操作熟練后，洗凈玻璃板、模具、晾干備用。抽氣后再加TEMED和過硫酸銨，混勻后迅速灌膠。過硫酸銨溶液要新鮮，必須當天配制。（3）去掉上面的玻璃板和模具：灌膠后室溫靜止1h，在模具和膠的邊緣可觀察到折光，這是膠已凝固的特征。再老化，然后小心將兩塊玻璃打開，凝膠和模具會自然地貼附在其中一塊玻璃板上，去掉上面的模具及凝膠板周圍的和滲出邊緣的殘膠，即可作加樣準備。3加樣、電泳（1）加樣前準備 在電泳槽上涂一層液體石臘，再鋪一張方格坐標紙（點樣時作定位用）。用一塑

32、料片刮去電泳槽與坐標紙之間的氣泡，并使坐標紙浸透石臘。 將帶膠的玻璃板放至涂有石臘的坐標紙上面，趕走氣泡。 接通冷凝水，再調一次水平。 鋪電極條：將1cm寬、9cm長的3層濾紙條浸透電極液（陽極用磷酸1mol·L-1，陰極用氫氧化鈉1mol·L-1）后，放在另一張濾紙上吸干面上的電極液，用鑷子將電極條鋪在凝膠兩端，輕壓電極，使電極條和膠貼緊，一定要平直，多余部分剪去，膠面上的殘液用濾紙吸凈（參看圖20-3（d）。（2）加樣 取8層擦鏡紙重疊在一起，剪成約紙5×5mm小塊，浸透樣品，放在離電極1cm以外的膠面上。PI6以下的樣品置于負極附近，pI6以上樣品位于正極附近，貼緊。微量標準樣品可少幾層擦鏡紙或直接加樣在膠面上。根據(jù)玻璃板下坐標紙所顯示的格子，自由選擇待測樣品和標準樣品放置的部位。 壓好電極板，蓋好蓋子，接通冷凝水，再調一次水平（參看圖20-3（c）。（3）電泳 開始：恒壓60V，15min后，恒流8mA，電泳時電壓不斷上升，直到電壓升為550V時，關電源。 開蓋去掉加樣紙，以免紙上殘留的樣品在染色時干擾結果的判斷。 調節(jié)電源，恒壓580V，繼續(xù)電泳，至電流降為零（2